母体の免疫活性化（MIA）は、自閉症と統合失調症の環境リスク因子のモデルです。この記事の目的は、このモデルの再現性を高めるために、妊娠中のマウスでMIAを誘導する方法の段階的な手順を提供することです。
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方法論記事
ウイルスミミックポリ（I：C）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
母体免疫活性化(MIA)モデルは、さまざまな精神疾患の環境リスク因子のげっ歯類モデルとしてますます高く評価されています。多くの研究により、MIA モデルが自閉症や統合失調症に関連する顔、構成、および予測妥当性を示すことができることが示されています。MIAをモデル化するために、研究者はしばしばウイルス模倣ポリイノシン酸:ポリシチジル酸(ポリ(I:C))を使用して、妊娠中のげっ歯類の免疫系を活性化します。一般に、免疫活性化ダムの子孫は、自閉症や統合失調症に関連する行動異常や生理学的変化を示します。しかし、異なる用量で異なる時点でのポリ(I:C)注射は、異なる段階で脳の発達を混乱させることにより、異なる結果をもたらす可能性があります。ここでは、妊娠半ばの胚 12.5 日 (E12.5) で 20 mg/kg ポリ (I:C) の腹腔内 (i.p.) 注射により MIA を誘導する詳細な方法を提供します。この方法は、母体-胎盤-胎児軸に急性炎症反応を誘発することが示されており、最終的には自閉症や統合失調症に関連する脳の摂動と行動表現型をもたらします。
概要
母体の免疫活性化（MIA）の概念は、自閉症や統合失調症1と母体感染との関連について疫学研究に由来します。胎盤や母体のウイルス感染2,3-後の胎児の脳で検出可能な複製ウイルス病原体が存在しないために、子孫に感染の影響は、母体の免疫系の活性化ではなく、病原体そのものに起因すると仮定されています。
MIAと精神障害との間の因果関係を解明するために、化学的に合成され、ウイルスを模倣する二本鎖RNAポリイノシンの注入：ポリシチジル酸：妊娠げっ歯類に（ポリ（I C））が広くMIAの動物モデルとして使用されています4,5。ポリ（I：C）は、Toll様受容体3（TLR3）によって認識され、そしてポリ全身投与（I：C）は、ウイルスのような急性炎症反応を誘発します。メカニズムの一つはポリによって（I：C）の広報子孫に行動異常と神経病理をoduces母体の胎盤胎児軸6にプロおよび抗炎症性サイトカインの不均衡を引き起こすことによってです。いくつかのグループは、精神障害7の病因を理解するためにMIAモデルを採用している、と原因の研究グループ間の多様な関心に、免疫活性化の種々の時点では、脳の発達や行動7上の異なる摂動を達成するために使用されてきました。
胚12.5日目に妊娠マウスに正常MIAは、行動、神経学的に誘導す....
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プロトコル
すべてのプロトコルは、カリフォルニア工科大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）の承認の下で実施しました。
時限交配ペアの1.準備
- 遺伝子発現解析のために、少なくとも6行動実験のためのダムと3を使用してください。
注：マウスの約50％は時限交配から差し込まれるように、推定された雌マウスの二重番号を使用します。 - なし妊娠前に、年齢の8-16週でメスのマウスを使用してください。
注：女性のマウス雄マウスの前に性的な露出を持っていますが、妊娠していない許容可能です。 - ハウスは、雌マウスは、一緒に、お互いの隣に自分の発情周期を同期させるためにケージを置きます。 5成体マウスの筐体を可能にするために、5.5インチ以上の高さと75平方インチインテリアフロアで、標準的なマウスケージを使用してください。耳パンチを用いて、各メスのマウスにラベルを付けます。
2.時限マットを設定しますINGペア
- 暗サイクルが始まる前に、時限交配0-2時間を設定します。各ケージに2匹の雌マウスを置きます。マウスを取り出し、それらを個別に量ります。各雌のマウスの体重を記録します。
- 2雌マウスと各ケージに1人の男性にマウスを置きます。父方の交絡影響を最小限にするためにトリオの交配を使用してください。
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結果
注射20 mgの/ kgのポリ：E12.5における（I C）は、母体の胎盤胎児軸に急性炎症反応を惹起し、脳の発達や行動の表現型12,13への慢性効果を沈殿させることができます。炎症性サイトカインのレベルの上昇は、インターロイキン（IL）-6は、MIA後の急性炎症反応の信頼できる指標です。注射12,13：IL6遺伝子胎盤における発現および胎児脳のピーク時間は、3時間後のポリ（I：C）です。母性脾臓胎盤胎児脳（ 図5）（。データはWu らから適応、2015）13を横切って高いIL6遺伝子の発現を誘導する（I：C）私たちは、そのポリを示しています。研究者は、MIA、 例えば、母体の食生活、遺伝的変異マウス、抗炎症薬、 などの後に急性炎症反応を変化させる可能性がある要因を研究するために、他の治療と、このパラダイムを組み合わせることができます。
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ディスカッション
異なる時間窓でのMIAの誘導は、げっ歯類の異なる脳の発達のイベントを乱し、その結果、子孫に異なる行動異常と神経病理につながります。 E12.5で射出：ここでは、ポリ（C I）を有するマウスにMIAを誘導するためのプロトコルを説明しました。 MIA誘導のこの方法は、行動、神経学、免疫学、および子孫8,10,11,16に自閉症や統合失調症に関連した胃腸の異常をもたらします。 MIAは、環境リスク因子であるので、それは、それに注意することが重要であり、子孫の表現型は、神経発達障害の遺伝的モデルのマウスのそれよりも高い変動を有することが期待されます。したがって、正確にかつ一貫してMIAを通して自閉症および統合失調症に関連する表現型を生成するために、その結果を混乱させる可能性のある追加の変数を最小化するために特に重要です。
プロトコルに記載タイムラインは近くに従わなければなりませんLY。正しい噴射時間ウィンドウはMIAが所望の段階での子孫の脳の発達を乱すことを確実にするでしょう。重要な脳の発達が発生している期間、皮質層におけるプルキンエ細胞と尾状核被殻の開発、および.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
私たちは、MIAモデル、自閉症、統合失調症研究の進歩への貢献のために後半博士ポール・H・パターソンを尊重したいと思います。我々は、このプロトコル上の彼の偉大なサポートのためにサルキスK. Mazmanianを認めます。ルーベンM.バイヨン、イヴェット・ガルシア・フローレス、カレンC. Lencioni、および行政支援のためのレスリーA.ノイマン。撮影上の支援のためのアリKhoshnanとヤンC.コ。 MIA誘導に対する助言のためのエレインY.シャオとナタリアMalkova。彼らの専門家畜産用のジェフリー・S・コクラン、ホアキン・グティエレス、クワンF.リー、ハイメ・ロドリゲス、ロレーナC.サンドバル、とナタリーA. Verduzco。この作品は、（ポール・H・パターソンにNIH 5P50MH086383-04、）NIHコンテセンター賞によってサポートされていました。自閉症は（ポール・H・パターソンに、＃7670）を語ります。 （サルキスK. Mazmanianへ＃322839）シモンズ財団。 NIHトレーニンググラント（K.-HCにNIH / NRSA T32GM07616）。 （ZY）は、カリフォルニア工科大学の夏学部研究フェローシップ（SURF）。アムジェン学者カリフォルニア工科大学（ZYへの）プログラム。そしてポストドクトラルフェローシップFRオム国家科学委員会、台湾（NSC 101から2917-I-564から039、W.-LWへ）。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ポリイノシン–ポリシチジル酸カリウム塩 | SIGMA | P9582 | |
| 0.9% 塩化ナトリウム INJ. USP | HOSPIRA | NDC 0409-4888-10 | |
| MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2インチ | COVIDIEN | 8881600145 | |
| 50 ml 円錐形スクリューキャップチューブ | USA SCIENTIFIC | 1500-1211 | |
| Nanodrop 1000 分光光度計 | THERMO SCIENTIFIC | 1000 | オプションの |
| 実体顕微鏡 | Wild Heerbrugg | M5A | オプション |
| デュモン #5 鉗子 イノックス 先端サイズ .10 X .06 mm | Roboz | RS-5045 | オプション |
| RNAlater RNA 安定化試薬 | Qiagen | 76104 | オプション |
| TRIzol 試薬 | Life Technologies | 15596-026 | 随意 |
| RQ1 RnaseフリーDNase | Promega | M610A | オプションの |
| iScript cDNA合成キット | Bio-Rad | 170-8891 | |
| オプションのFastStartユニバーサルSYBRグリーンマスターミックスとROX | ロシュ | 4913922001 | オプション |
| リアルタイムPCR | ABI | 7300 | オプションの |
| プライマー:Il6 フォワード | Life Technologies | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | オプションの |
| プライマー:Il6 リバース | ライフテクノロジー | ズ TTGGTCCTCTTAGCCACTCCTTC | オプションの |
| プライマー:β-actin forward | Life Technologies | AGAGGGAAATCGTGCGTGAC | オプション |
| プライマー:ベータアクチンリバース | ライフテクノロジー | CAATAGTGATGACCTGGCCGT | オプションの |
| MicroAmp光学96ウェル反応プレート | Life Technologies | 4306737 | Optionl |
| MicroAmp光学接着フィルム | Life Technologies | 4311971 | Optionl |
| EthoVision | Noldus | EthoVision | Optionl |
| SR-LAB装置 (PPI) | San Diego Instruments | SR-LAB | Optionl |
| Marbles | PENN-PLAX | ブルージェムストーン ビー玉 | Optionl |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) | Life Technologies | 21600-069 | Optionl |
| パラホルムアルデヒド | MACRON | 2621-59 | Optionl |
| ビブラトーム | ライカ | VT1000 S | Optionl |
| アジ化 | Σ S2002 | Optionl | |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Optionl |
| 過酸化水素溶液 | Sigma | 18312 | Optionl |
| ヤギ血清 | Vector Laboratories | S-1000 | Optionl |
| ウサギ抗カルビンジン抗体 | Abcam | ab11426 | Optionl |
| ビオチン化ヤギ 抗ウサギ IgG抗体 | Vector Laboratories | BA-1000 | Optionl |
| VECTASTAIN ABCキット | ベクターラボラトリーズ | PK-4000 | Optionl |
参考文献
- Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
- Fatemi, S. H., et al.
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