モデル化学療法抵抗性白血病インビトロ

サマリー

現在のレポートは、最も化学療法抵抗性のある亜集団の濃縮に重点を置いて、白血病細胞に対する骨髄微小環境ニッチの影響をモデル化するために利用できるプロトコルをまとめています。

要約

骨髄微小環境が、この場所で開始および進行する造血疾患のユニークな聖域を提供することは十分に確立されています。 本レポートで提示されたモデルは、腫瘍細胞の表現型に影響を与える骨髄ニッチの2つの代表的な細胞タイプとして、ヒト初代骨髄間質細胞と骨芽細胞を利用しています。 これらの主要なニッチ成分を持つヒト白血病細胞について記載されたin vitro共培養条件は、さまざまな技術による分析のために培養から効率的に回収できる腫瘍細胞の化学療法抵抗性亜集団の生成をサポートします。付着性骨髄間質細胞(BMSC)または骨芽細胞(OB)の下に移動した腫瘍細胞の集団のゲル型10架橋デキストラン(G10)粒子の回復に続く栄養フラックスを防ぐための厳格な給餌スケジュールは、腫瘍細胞の「フェーズディム」(PD)集団を生成し、精製された治療抵抗性白血病細胞の一貫した供給源を提供します。 この臨床的に関連性のある腫瘍細胞の集団は、アポトーシス、代謝、および細胞周期の調節経路を調査するための標準的な方法で評価できるだけでなく、最小限の残存病変を対象とした前臨床研究の前に新しい治療戦略をテストするためのより厳密な標的を提供します。

概要

説明されている方法の全体的な目標は、化学療法曝露中の白血病細胞の骨髄支持生存の根底にあるメカニズムの調査を支援する、効率的で費用対効果の高いin vitroアプローチを提供することです。治療後も持続する生存残存腫瘍細胞は、診断時よりも侵攻性が高く、治療効果が低いことが多い疾患の再発に寄与することが十分に文書化されています^1-8。治療アプローチの試験のために、培地中の細胞の培養のみに限定されたモデルなど、白血病細胞を単離して含むモデルは、これらの重要なシグナルや、ニッチ細胞と非常に特異的な相互作用を持つ腫瘍細胞亜集団が強化された保護を導き出すニッチ由来の手がかりの利用可能性に応答して発生する疾患の不均一性を考慮しません。骨髄由来の間質細胞と白血病細胞を共培養する標準的な2D共培養モデルは、骨髄ニッチの寄与にいくらか対処しており、骨髄微小環境細胞との相互作用が化学療法に対する耐性を高め、成長特性を変化させることを示しています^9-14。しかし、これらのモデルは、腫瘍細胞の長期生存を再現できないことが多く、MRDに寄与する最も耐性のある白血病細胞集団に関連する結果を正確に通知していません。in vivoモデルは依然として重要であり、臨床試験に先立って革新的な治療法を研究するための「ゴールドスタンダード」を定義していますが、耐性腫瘍や疾患の再発に関連する仮説を検証するために必要な時間とコストに課題が生じることがよくあります。そのため、より情報量の多い2Dモデルの開発は、パイロット調査において、その後のマウスベースの前臨床設計の設計により良い情報を提供するための有益性があります。

>jove_content<このレポートで提示された2Dインビトロモデルは、真のインビボ微小環境の複雑さを欠いていますが、腫瘍細胞の化学抵抗性亜集団の濃縮に特に適した微小環境との腫瘍相互作用を調査するための費用対効果が高く再現性のある手段を提供します。腫瘍細胞の全集団の評価は、最も重要な標的を構成する治療抵抗性腫瘍細胞のマイナーグループの表現型を隠す可能性があるため、この区別は価値があります。さらに、対象の分析に適合するモデルのスケーラビリティも利点として挙げられます。腫瘍細胞の大幅な回収が必要な解析にはバルク培養を確立でき、マルチウェルプレートでの小規模な共培養は、PCRベースの分析や顕微鏡ベースの評価に利用できます。

>jove_content<この必要性に基づいて、私たちはB系統の急性リンパ芽球性白血病(ALL)の特徴である疾患の不均一性に対処するためのin vitroモデルを開発しました。 私たちは、健康な細胞と共通の多くの特性を共有するすべての細胞が、BMSCまたはOB共培養の異なるコンパートメントに局在することを示しています。 腫瘍細胞の3つの集団が生成され、それらは治療応答の調査に貴重な明確な表現型を持っています。具体的には、共培養の「フェーズディム」(PD)集団から回収された(ALL)細胞が一貫して治療に抵抗性であり、細胞毒性物質に曝露されていない腫瘍細胞に近似する生存率を示す。これらのALL細胞は、確立された細胞株または初代患者サンプルのいずれかから、接着性間質細胞または骨芽細胞層の下を移動しますが、培養物のトリプシン化および細胞型の分離後に、ゲル型10架橋デキストラン(G10)粒子カラム¹⁵を利用することにより捕捉することができます。

ここでは、骨髄微小環境間質細胞（BMSC/OB）と白血病細胞との間の相互作用をモデル化するために使用できる2次元共培養のセットアップを紹介します。特に重要なのは、白血病細胞が間質細胞単層に対して3つの空間的亜集団を形成し、PD集団がBMSCまたはOBとの相互作用により化学療法抵抗性腫瘍集団を表しているという観察です。さらに、G10カラムによって白血病細胞集団を効果的に単離する方法を示します。注目すべきは、これらの亜集団を単離することで、最も耐性のあるPD集団の下流分析が可能になり、骨髄微小環境間質細胞または骨芽細胞との相互作用によりこれらの細胞に付与される潜在的な耐性モードを決定できることを発見したことです。この共培養および単離モデルの下流で利用した技術には、フローサイトメトリー評価、プロテオミクス分析、標的タンパク質発現評価、および最近開発されたレーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化(LAESI)および代謝プロファイルを評価するためのタツノオトシゴ分析が含まれます。このモデルを上記の技術と組み合わせて使用することにより、白血病細胞のPD集団は、培地のみで培養された白血病細胞や同じ共培養の他の亜集団から回収された白血病細胞と比較して、化学療法抵抗性の表現型が独特であることがわかりました。そのため、このモデルは、骨髄微小環境との相互作用を通じて耐性表現型を導き出す最も化学療法抵抗性白血病細胞を標的とする戦略をテストするためのより厳密な評価に役立ちます。

プロトコル

1.高度な準備

1. デキストランG10粒子を調製します。
   1. 10グラムのG10粒子にPBS 1×50ミリリットルを追加することで、G10のスラリーを準備します。反転によって混合し、G10が4°CO / Nでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）から沈降することを可能にします。
   2. 定住G10粒子からG10カラム分離、吸引PBSの日と50ミリリットルの新鮮なPBSを追加します。転倒混和します。使用する準備ができるまで4℃で落ち着いG10粒子とストアに50ミリリットルの新鮮なPBSを追加して、二回繰り返します。
2. BMSCとOBを培養します。
   1. 90％の密集度に到達するまで、6％CO ₂中37℃でBMSCまたはOBの両方を維持し、10cmの組織培養プレート上で増殖させました。
   2. 新しい10cmプレート上に2：トリプシン処理BMSCまたはOB細胞とは、1を分割します。共培養白血病のために必要とされるまで細胞をこれらの標準に成長させます。

2.共培養の確立と維持

1. 5-20×10 ⁶白血病細胞iを追加nは、80％-90％コンフルエントBMSCまたはOB板上に腫瘍特異培地10mlの。
   注：私たちの研究室は、より良い1％から^7％16-18の範囲であると示されている骨髄微小環境を再現するために、5％のO ₂中で37℃で共培養を維持します。しかし、この酸素張力で共培養を維持することが3白血病の亜集団の確立のために重要ではなく、ラボの裁量です。
2. すべての4 ^日目は、（懸濁液中の白血病細胞を含む）は、メディアの1ミリリットルが、すべてを削除し、9ミリリットルの新鮮な白血病培養培地と交換してください。プレートからのメディアの9ミリリットルを取り外すときは、BMSC又はOB付着層を乱さないように注意してください。
   1. プレートの隅に側と吸引メディアにプレートを傾けることによってメディアを取り出します。新鮮な培地を追加するときにまた、BMSC又はOB付着層の最小限の中断を確実にするために、側壁に対するプレートの隅に一滴ずつ追加してください。
3. 共培養の12 ^日目の後、ディッシュアップから培養培地をピペットでBMSCまたはOB層から白血病細胞を洗浄し、ダウン静かに皿の上に約5〜10倍にした後、15ミリリットルコニカルチューブに集めます。ステップ2.1で説明したように新たな80％-90％コンフルエントのBMSC又はOBプレート上に再播種。
   注：ステップ2.3で説明したように、共培養の穏やかなすすぎは、BMSCまたはOB単層を破壊することなく、S、PBの白血病細胞を除去します。これは、腫瘍細胞は、次の同時培養プレートに移すことを可能にします。この12日のサイクルでは、ユーザーのニーズに基づいて、必要な数回繰り返すことができます。

3.準備G10ビーズカラム

注：次の手順は、無菌テクニックとG10カラムを用いて行われるべきである無菌下流の分析や培養が必要な場合は、次のG10カラム分離は、無菌の生物学的フードでセットアップする必要があります。

1. 事前WA水浴中で37°CまでRM細胞培養培地（カラムあたり約30 ml）を。 10ミリリットル使い捨て注射器を使用して、削除し、プランジャーを捨てます。シリンジにグラスウールを追加します。
2. ピンセットを使用して、薄い緩いストランドにグラスウールを引き離します。注射器の2/3をガラスウールで充填されるまで注射器に軽く充填したグラスウールの複数の層を加えます。
   注：グラスウールは、白血病細胞のコレクションを汚染から緩いG10粒子を防ぐことが重要です。グラスウールはG10粒子をサポートするのに十分な詰めが、あまりにも密に列を介してメディアの流れを遮断するためにパックされていないことを確認してください。
3. 閉鎖位置に注射器の先端に1方活栓を取り付けます。
4. リングへのクランプシリンジの列が50ミリリットルコニカルチューブ（コレクションチューブ）がコックの下に配置することができる十分な高さに立ちます。シリンジ列の下にコレクションチューブを置きます。
5. 10ミリリットルのピペットを使用すると、G10粒子がの上欄にPBSに再懸濁し、滴下、追加しますグラスウール。グラスウールの上にG10粒子の形の（注射器の目盛りによって測定される）〜2ミリリットルペレットまでG10粒子を追加し続けます。
6. 予熱したメディアとG10カラムを平衡化します。
   1. 列に予熱したメディアの2ミリリットルを追加します。ようにオープンコックバルブはゆっくりとメディアを滴下カラムから流出します。
   2. 予熱したメディアの10ミリリットルの合計までの手順を繰り返し3.6.1は、列を横切って走ってきました。
      注：G10粒子をコレクションチューブを通る流れで見られ、いずれか1）より多くのG10粒子を追加している場合は、追加G10粒子がカラムから逃げないことを確認すること〜2ミリリットルペレットを維持するか、2）未使用の1繰り返しでカラムを交換します3.4-3.6.1を繰り返します。
   3. カラムからの予熱したメディア・ドレイン後、コックを閉じて、フロースルーとコレクションチューブを捨てます。列の下に新しいコレクションチューブを追加します。列は、メディア+細胞混合物をロードする準備ができています。
      注：列すぐに使用し、乾燥させないようにする必要があります。

4.共培養内の3亜集団を分離

1. 懸濁液（S）は、腫瘍亜集団のコレクション。
   1. 吸引ピペットとの共培養プレートからメディアと静かに再適用されるのと同じメディアのプレートを洗浄し、15ミリリットルコニカルチューブに白血病細胞を含む培地を収集します。収集した白血病細胞は、S亜集団です。
2. フェーズブライト（PB）腫瘍亜集団のコレクション。
   1. 共培養プレートに戻って10ミリリットルに新鮮な培地を追加します。接着性白血病細胞が、付着BMSC / OBの成分を除去するのは難しい十分ではありませんを削除するには、上下約5倍を追加したメディアをピペットで勢いよくすすいでください。
   2. ピペットで吸引し、15ミリリットルコニカルチューブにメディアを収集します。回収した細胞は、PBの亜集団です。
3. フェーズ点心のコレクション（PD）は、腫瘍亜集団。
   1. レムに1ミリリットルPBSですすぎ、プレートオベ残りのメディア。 5分間37℃のインキュベーターに3ミリリットルのトリプシンと場所とのトリプシン処理共培養プレート。
   2. インキュベーターからプレートを外し、静かに付着BMSC / OBを取り除くために、プレートの側面をタップします。
   3. 離れて大きな細胞凝集体を壊すために1ミリリットルのウシ胎児血清（FBS）およびピペット上下に3-5回を追加します。
   4. 15ミリリットルコニカルチューブ内の細胞でメディアを収集します。これらの細胞は、同様にBMSC / OBを有する未精製のPD亜集団です。
4. 遠心分離器3は、7分間400×gで亜集団を単離しました。吸引し、1ミリリットル予め温めメディアでペレットを再懸濁し、個別に、その後、上清を捨てます。細胞はG10カラムにロードする準備ができています。

G10カラムに5読み込んで共培養細胞

注：必ずコックはG10カラムに細胞を含む培地を添加する前に完全に閉じていることを確認します。また、それぞれの亜集団はintroducしないよう個別のG10カラム上で実行する必要があります下流の分析における集団間の偏りを電子。

1. 千μlのピペットを用いて、滴下別々のG10カラムに予熱した培地中に各細胞亜集団の1ミリリットルを追加します。細胞を含む培地が上またはG10ペレット内に残ることを確認してください。細胞を室温で20分間、G10ペレットにインキュベートすることを可能にします。
   注：活栓は、インキュベーションの期間のための閉じられたまま。

6. G10カラムから白血病細胞を収集

1. 各G10カラムに1〜3ミリリットル予め温めたメディアを追加します。オープンストップコックバルブとメディアがゆっくりコラム滴下を終了することができます。
   注：これは、列または列の外に洗い流し、分離された白血病細胞を汚染する可能性がBMSC / OBを含むG10ペレットからの遅い流れの速度を維持することが重要です。
2. 15〜20ミリリットルの合計までG10カラムに少しずつ（1-2 ml）に予熱したメディアを追加していきカラムに通しており、収集されています。閉じるコックVALVEとキャップコレクションチューブ。
   注：G10粒子ペレットを回収チューブの底に見られる場合は、ゆっくり乱されていないG10粒子ペレットを残してチューブからメディアを取り出し、新しいチューブに移します。
3. 遠心分離は、室温で7分間、400×gでメディアを集めました。上清を除去し、下流側のアプリケーションのための適切な緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。
4. 細胞は、今BMSC又はOB汚染のない白血病細胞の純粋な集団であり、ユーザーの裁量で、下流のアプリケーションに適用する準備ができています。
   注：G10カラムを通して細胞を通過する際に白血病細胞の生存率は変わらないはずです。

結果

この共培養モデルの成功セットアップと文化が。付着BMSC又はOB単層に比べて白血病細胞の3亜集団の確立につながる1は、BMSCの単層に播種ALL細胞は、最初に中断のようにのみ単一集団をどのように表示されるかを示しています白血病細胞。 4日間のコースで白血病細胞は、3空間白血病細胞の亜集団（一時停止（S）、位相明るい（PB）、および位相薄暗い（PD））を形成するためにBMSCと対話します。腫瘍細胞の3亜集団は、一般的にBMSC又はOBとの共培養の24時間後に見ることができますが、私たちは、白血病細胞およびBMSC / OBセル間の完全なダイナミクスとの相互作用が起こることを可能にするために4日間細胞を培養に共同しました任意の操作や実験の前の場所（図1）をとります。また、我々は蜂を持っている、骨髄生理学を再現するために、5％の酸素圧での共培養を維持することに注意してくださいnは^{1％-7％16-18}の範囲であると報告しました。

ディスカッション

病気の再発に寄与する微小残存病変（MRD）は、積極的な難治性ALLの治療、ならびに、他の血液悪性腫瘍のホストに主要な臨床課題であり続けています。骨髄微小環境は、ALL ^3,8における再発の最も一般的な部位です。このように、骨髄微小環境をモデル化したモデルは、化学療法の露光中にMRDの白血病腫瘍細胞の生存および維持に関連する仮説をテストするための重要なツールです。マウスモデルは、薬効に関連したテストの質問のためのゴールドスタンダードを定義しているが、2D共培養は、テストの仮説と白血病細胞の生存の骨明日の微小環境のサポートに関連する薬物戦略のための費用対効果の高い方法であり続けています。多くのグループがBMSCで白血病細胞の共培養を示しているかの化学療法剤^{9,10,12-14,19-21}でチャレンジしたときにOBが生存優位性を提供します。通常の未成熟CD34 + HEMAのモデリング作業間葉系幹細胞（MSC）との共培養におけるtopoietic細胞は、造血細胞が造血細胞^22,23の三つの異なる空間的な集団を形成するために、MSCの接着単層と相互作用することを明らかにしました。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
G10 セファデックスビーズ	シグマ	G10120	原稿ではゲルタイプと呼ばれている 10 架橋デキストラン粒子
10 ml 滅菌シリンジ	BD	309604
グラスウール	パイレックス	3950
一方向ストップコック	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml円錐形遠心分離管	ワールドワイドメディカルプロダクツ	41021039	コレクションチューブとして使用されます
15mlコニカル遠心分離管	ワールドワイドメディカルプロダクツ	41021037	細胞収集に使用されます
ウシ胎児血清	シグマ	F6178
0.05%トリプシン	株式会社メディアテック	25-053-CI
100 x 20 mm 細胞培養ディッシュ	Greiner Bio-One	664160
培地
骨芽細胞培養培地	PromoCell	C-27001	ヒト骨芽細胞培地用
RPMI 1640 メディア	・メディアテック	15-040	腫瘍培地調製用
細胞株
接着細胞:
ヒト骨芽細胞	PromoCell	C-12720	ヒト骨芽細胞は、サプライヤーに従って培養されました」の推奨事項です。
Human Bone Morrow Stromal Cells	WVU Biospecimen Core		匿名化された原発性ヒト白血病および骨髄間質細胞 (BMSC) は、Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core と West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank によって提供されました。BMSC培養は、前述のとおりに確立されました(*)
Leukemic Cells:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH細胞は、サプライヤーに従って培養されました」の推奨事項と推奨メディア。
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1は、サプライヤーに従って培養されましたの推奨事項と推奨メディア。
(*) ギブソンLF、フォートニーJ、ランドレスKS、ピクテルD、エリクソンSG、リンチJP。エトポシドによる骨髄間質細胞機能の破壊。Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc 血液骨髄移植。1997年8月;3(3):122–32.