マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

Summary

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。

Abstract

このプロトコルは、系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のインサイチュ分析で定量、単セルを実行するための方法を提供 マウスの着床前胚インチ胚コレクション、免疫蛍光、共焦点顕微鏡で画像化し、画像分割および分析のために必要な手順が記載されています。この方法は、複数の核マーカーの発現と空間胚内のすべてのセルの（XYZ）座標の定量を可能にします。それはMINS、特に着床前胚および胚性幹細胞（ESC）のコロニーの共焦点画像の解析のために開発された画像セグメンテーションのソフトウェアツールを利用しています。 MINSはX、YおよびZ次元を横切る教師なし核セグメンテーションを行い、最小限のユーザ入力で、すべてのチャンネルについて、三次元空間内のセルの位置情報、ならびに核蛍光レベルを生成します。このプロトコルは、画像の解析のために最適化されているが着床前段階のマウス胚の、容易に良好な信号対雑音比を示す任意の他のサンプルの分析に適合し、ここで、高核密度は、画像分割（ 例えば 、胚性幹細胞（ESCの発現解析に障害をもたらすことができます）コロニーを、培養物中の細胞を分化、他の種または段階の胚、 等 ）。

Introduction

マウスの着床前胚は、細胞の運命の仕様および哺乳動物におけるデノボ上皮の研究のための出現とin vivoでの多能性の維持だけでなく、モデルを研究するためのパラダイムです。そして2胚体外系統、栄養外胚葉（TE）と - ほとんどの体細胞組織と生殖細胞を生じさせる - 哺乳類の発生の着床前段階は胚盤胞、すなわち多能性胚盤葉上層を構成する3つの細胞系統の確立に専念しています原始内胚葉（PRE）（ 図^1A）1,2。このプロトコルは、（1）収穫に手順を説明し、着床前段階のマウス胚を固定し、（2）目的のタンパク質を標識するために免疫蛍光を行う、（3）のzセクショニング機能を備えた共焦点顕微鏡を用いて全マウントイメージングを行い、（4）共焦点画像とその後の定量的画像分析の核セグメンテーションを行います。このパイプラインは、トンを可能にします彼は、 その場での細胞の亜集団を特徴づけるために、セルIDの割り当てのためのタンパク質レベルの測定に公正。データ解析（ 図1B）に胚コレクションから、（一般的に10マウス胚まで）単一のごみのために4日-このプロトコルはわずか3で行うことができます。いくつかの同腹仔の同時分析は、このように、プロトコルの全体の長さを延長する、画像化およびデータ分析の時間負担を増加させます。

着床前段階のマウス胚は、その小さなサイズとステレオタイプの形態³与えられた、実験的に扱いやすいシステムであり、単一セルの解像度を持つ細胞プロセスのトト撮影に適しています。胚の統計学的に関連する多数の公平な、システムレベルの分析を行うために、自動化され、定量分析パイプラインが望ましいです。しかし、胚盤胞の内部細胞塊（ICM）（高核密度に起因図1A、図2D）、従来の画像分割プラットフォームは、自動化または半自動化されたワークフローを確立するために十分な精度が得られません。一方、マニュアルセグメンテーションは、正確な一方で、細胞や胚の大コホートの処理を許可していません。また、セルアイデンティティの再現性、公平な決意するのに適している - 発達段階を研究する際に特に重要であるマーカーのパターン式は完全に（ 例えば 、人口全体のバイナリディストリビューションを示さない）解決しません。最近開発され、最小限のユーザ入力^{4-8を必要と}しつつ、高精度を実現マウス着床前段階の胚およびマウス胚性幹細胞（ESC）に合わせた画像分割方法を検証しています。

ここで紹介する解析パイプラインは、MATLABベースの画像分割ツールモジュラー対話型原子力セグメンテーション^（MINS）4を中心に展開。 MINS Pユーザは、グラフィカル・ユーザー・インターフェース（GUI）（ 表^{1）4 を使用して} 、画像特性の最小数を確立した後、共焦点のZスタックの大きなバッチの教師なし核セグメンテーションをerforms。このパイプラインは、野生型、実験的に処理し、遺伝的に改変された胚とのESC ^5-7の両方でタンパク質の発現および細胞局在化の高スループットデータの生成のために効率的であることが証明されました。現在のプロトコルでは、我々は、着床前段階の胚の画像のセグメンテーションにMINSのアプリケーションを記述します。 ESCの上MINS性能の例については^4.7を参照してください。空間的な蛍光強度の測定は、セル識別情報の公正な決意胚（ 図中の遺伝子発現ドメイン及び細胞位置の三次元マップの生成を可能にする一方、自動化された核のセグメント化ステップが大きく、セル識別プロセスの時間の負担を軽減1C ）。また、このワークフローの拡張性は、実験的に処理された胚の大コホートを通じて個々リットルの分析、または異なる遺伝的背景^5,6の胚にそれが適用になります。 MINSは（ソフトウェアは、MATLABのライセンスが必要）http://katlab-tools.orgで自由に利用可能です。

今日までに開発なしのアプローチは、マウスの着床前胚におけるタンパク質発現および細胞局在化に対するこのような綿密なデータの生成を可能にしません。すべての試みはこれまでに、これらのタイプのデータを定量化で^9月19日 （いずれか完全に手動で、またはソフトウェアアシスト）胚における異なる集団のために細胞数のマニュアル決意および定量に制限されています。 （MINSソフトウェアを組み込んだ）このアプローチは、に合わせ、マウスの着床前胚およびESCの上でテストされています。それにもかかわらず、高核密度を有する他のシステムでは、その性能は、まだテストされていないが、同等であると予想されます。

Protocol

倫理の声明：飼育、繁殖と犠牲を含むすべての動物の作業は、メモリアル・スロ​​ーンケタリングがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）、プロトコル番号03-12-017によって承認されました。

1.胚のコレクション

注：すべての動物の作業は、制度や地方当局によって承認され、地元や制度の規則に適合されている必要があります。

1. 目的の遺伝子型の肥沃なスタッド男性と処女雌マウスメイト。
   注意：自然交配を設定する場合は、発情期のサイクルの発情期にメスを選択すると、希望日に交尾の機会を増加させます。過剰排卵を誘発する場合は^、20に記載されているプロトコルを参照してください。
2. 鈍いプローブを使用して、午前中に膣のプラグインの存在を確認してください。理想的には、交尾栓が一日を通して失われるように、正午（午後12時）の前にこれを行います。お取置きを考えてみましょう膣プラグ胚日（E）0.5の検出のn個。
3. 希望日と胚発生の際には、M2またはRTへのフラッシング保持培地（FHM）または、好ましくは、37ºCを温めます。注：いずれかのM2またはFHMは紅潮し、取り扱い胚のために使用することができます。使用しないときは、4ºCでこれらのメディアを格納します。各子宮のための媒体の〜2ミリリットルの使用を推定します。
4. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で凍結し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）を解凍またはいくつかの新鮮な溶液を調製します。 4ウェルプレートのウェルあたり4％PFA溶液500μlを推定します。 4ウェルプレートの各ウェルに1ごみを修正しました。注：また、96ウェルプレートは、胚を固定し、格納するために使用することができます。 96ウェルプレートを使用している場合は、ウェルあたりPFA溶液100μlを使用します。
5. 先端にキャピラリー端を描画するために開いている炎を用いてガラスパスツールピペットを引き出します。
6. 地元や制度の規制によって要求される、またはとして頸椎脱臼またはCO ₂吸入によって女性を生け贄に捧げます。それは多くの場合desirablですeは頸椎脱臼により動物の安楽死を確認しました。
7. 毛髪脱落を最小限にし、内臓を露出するために第一の皮膚を通して、続い体壁（腹膜）を介して、腹部切開を行うために70％エタノールを用いて動物の腹スプレー。
   注：次の手順は、E3.25及びE4.5（ 図1A）との間のいずれかの段階で妊娠中の女性のマウスの子宮から胚盤胞を収集するための手順を説明します。以前E3.25よりも着床前胚のコレクションでのプロトコルの場合^、20を参照してください。
8. 子宮を見つけ、動物から取り除きます。ピンセットで子宮頸部の端を持ち、子宮頸部を切断し、両方の子宮角を伸ばして静かに引き上げます。
9. 子宮壁を貫通しないように注意しながら、子宮から脂肪をトリミングします。まだ動物の体に取り付けられている間、子宮の外に延伸することができるので、これは、除去時に容易に行うことができます。あるいは、それはRT PBSに、解剖顕微鏡下で、後で行うことができます。子宮の解剖に関するより詳細なプロトコルの場合、プロトコル5＆8 ^20を参照してください。
10. 卵管の上にカットし、卵巣の下に、シャーレに子宮全体、場所を解放し、PBSでカバーしています。
    注：このステップは、その後の胚盤胞の収穫を容易に子宮からの過剰な血液または他の破片の洗浄を可能にします。
11. 子宮頸部の両側に、近位端部を切断することにより、両方の子宮角を分離し、子宮頸部を捨てます。 （ 図1A）、それらを結ぶ地峡の下に切断することにより、子宮から独立した各卵管。胚の収集と操作のための操作媒体（M2またはFHMのいずれか）の低下に両方の角を転送します。
12. 解剖顕微鏡下では、子宮のうち0.5強制することにより、媒体へのフラッシュ胚盤胞 - 子宮頚部開口部から各子宮角を通してM2またはFHMの1ミリリットルを。 1を使用してください皮下針付きmlシリンジ。注：これは重要ではないが、針は、子宮を引き裂く回避するために、ファイリング石を使用して平滑化することができます。子宮洗浄のための詳細図は²¹で見つけることができます。
13. 解剖顕微鏡を使用して、培地のドロップに散在される胚盤胞を、探します。洗浄後は、皿の底に沈むする胚盤胞のために2分 - 1まで許可。キャピラリーエンドで口制御、ガラスパスツールピペットを使用して、すべての胚盤胞を収集し、メディアの新鮮なドロップに移します。
14. 新鮮なM2またはFHMの3滴 - 2を介してそれらを移動することにより、胚盤胞をすすぎます。一度に10個の胚盤胞 - 5のグループで胚を移動します。
    注：いずれかの時点でより大きなグループを移動するには、プロセスをスピードアップしますが、それはまた、誤って多くの胚を失う可能性が増加します。胚操作および転送を練習し、口制御ピペットの使用で訓練されていない場合はBの前に考慮すべきです実験をeginning。
15. 簡単に酸性タイロード液でそれらを洗浄することにより、未孵化胚盤胞から透明帯（ZP）（一般的に
16. 裸に胚盤胞を扱うときは、ガラスやプラスチックの表面に非常に付着しやすいよう、注意してください。操作媒体は、付着を防止するために、ウシ血清アルブミン（BSA）の4 mg / mlとを含むが、酸タイロードまたはPBSは、したがって、胚の損傷や紛失のリスクを軽減することが2つ以上のピックアップはありませんありません - 5剥皮胚盤胞をBSA-無料または無血清PBSまたは酸タイロードでそれらを操作する時。
    注：また、被膜は、使用前に1％BSAを有するガラスピペットは、ガラス表面への胚の付着を低減します。

コー​​ト各ウェルの底部プラスチックに付着する胚を防ぐために1％寒天、0.9％のNaClの薄い層を有する4ウェル組織培養皿の。また、PBS（PBS-BSA）にBSAの4 mg / mlとを追加します。

PBS中の4％PFAを500μlとよくRT PBS（またはPBS-BSA）を500μlでコーティングされた4ウェル組織培養皿の1つのウェルを記入し、別の。

RT PBS中で胚盤胞を洗浄し、室温で10分間、PBS中の4％PFAで固定します。固定後、PBS（またはPBS-BSA）に転送します。

胚はすぐに処理されようとしていない場合は、（試料の乾燥につながる）の蒸発を防止し、4ºCでプレートを格納するためにミネラルオイルの層を有する胚を含有するPBSを覆います。
注：別の固定方法と時間は、実験に応じて使用することができ、目的のエピトープと抗体が使用されます。どちらの選択方法、染色結果のその後の比較を容易にするために、同等の実験を通して一貫しています。
注： 一時停止ポイント：胚は、次のステップに進む前に、数週間まで、PBS中の4ºCで保存することができます。 PBSは、無菌であり、そして/または長期貯蔵を予想している場合（PBS-BSAを使用した場合は特に）細菌汚染を防止するために、ペニシリン+100μg/ mlのストレプトマイシン（ペニシリン - ストレプトマイシン）の100 U / mlのを追加することを確認します。

2.免疫蛍光

1. 以前に試験し、ホールマウント免疫蛍光のために堅牢であることが証明されている任意のプロトコルを使用して免疫蛍光を実行します。注：私たちは^{、22 および} 11に記載されているものをお勧めします。本記事では前者について説明します。どちらの選択方法、染色結果の比較を容易にするために、同等の実験を通して一貫しています。
2. 免疫プロトコルの一連の工程を実行するために柔軟な、ビニル、透明な、U底の96-ウェルプレートを使用します。 50で各ウェルを埋める - 溶液100μlと1溶液から胚を移動L字型の口のピペットを使用して別の。このアプローチは、試薬の使用を最小限に抑え、追跡の手順だけでなく、いくつかの実験群の並列染色を容易に注意してください。
   1. オプション：コートプラスチックに胚の付着を防止するために、1％寒天、0.9％のNaClの薄層とウェルの底。免疫蛍光ソリューションにBSAを追加しないでください。
3. PBX（PBS中0.1％トリトンX-100）を準備します。いくつかの免疫蛍光実験の性能を予測した場合、実験間の4ºCでPBXや店舗の50ミリリットルを準備します。
4. 透過化溶液（0.5％トリトンX-100、PBS中の100mMグリシン）を準備します。各実験のために新鮮な透過処理溶液1ミリリットル（またはいずれか必要な量）を行います。
5. 溶液（PBS中のペニシリン - ストレプトマイシン2％ウマ血清（HS）または20％ウシ胎児血清（FBS））を遮断準備。実験間の4ºCで10ミリリットルとストアを準備します。
   1. 差異は、いずれかの間で観察されていません血清型は、しかしながら、同等の実験のために使用されるブロッキング溶液の選択に一致すること。
6. PBXにおけるRT（〜100μL）で5分間固定胚を洗浄します。
7. 透過溶液（〜100μL）で室温で5分間胚を透過。
8. PBXにおけるRT（〜100μL）で5分間胚を洗浄します。
9. ブロッキング溶液の〜100μl中、室温で1時間に30分間ブロック胚。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
   注：胚は30分ブロッキングステップに比べて顕著な改善または損なうことなく4ºCで最大O / Nの期間のためにブロックすることができます。
10. 溶液（〜100μl）を遮断するに希釈した一次抗体/抗体中4ºCでの胚O / Nインキュベートします。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
    1. 事前に各一次抗体のための最適希釈を決定します。 Dを参照してください。抗体の数のテストされた希釈液のためのiscussionおよび材料セクション。
11. O / Nインキュベーションした後、PBXで室温で5分間ずつ（〜100μl）をするための胚3回すすいでください。
12. ブロッキング溶液の〜100μl中、室温で1時間に30分間ブロック胚。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
13. ブロッキング溶液の〜100μl中4μgの/ mlに希釈した二次抗体/抗体中4ºCで1〜2時間のための胚をインキュベートします。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
14. PBXで室温で5分間ずつの胚2回すすいでください。
15. 好適なDNA染色に胚を移動します。ヘキスト33342を使用している場合は、PBS中5μg/ mlに希釈します。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
    注： 一時停止ポイントを：胚はすぐに画像化されていない場合は、uのために保持することができ核染色溶液中で数週間P。この場合には、確実PBSは、無菌でありおよび/または細菌の増殖及び汚染を防止するために、ペニシリン - ストレプトマイシンまたはアジ化ナトリウムを加えます。

3.共焦点イメージング

注：個々の共焦点顕微鏡の構成が代わりにシステムとソフトウェアのために調整される特定の収集パラメータが必要になります。ただし、次のセクションでは、それが任意のインストールに適用可能であるべきである従うべき一般的なルールのセットを提供します。

1. 微細口ピペットを用いて、PBSまたは35ミリメートルのガラスボトムディッシュのガラス面上に核染色溶液の微小液滴を作り、ミネラルオイルで覆います。別の方法として、胚の損傷を防ぐため、ガラス顕微鏡スライドでカバーするシリコーンセパレータで定期的にカバーガラスを使用しています。注：定期的にカバーガラスを使用した場合、胚はその後に再配置さまたは遺伝子型決定のために回復することはできませんので、我々は強くグラスボトムを使用することをお勧めします料理。
2. 場所胚微小液滴であり、好ましくはガラス表​​面にICM-空洞軸に平行で、一貫した方法でアレンジ。顕微鏡ホルダーの皿を設定します。注：レーザー走査型共焦点顕微鏡で得られた画像は、蛍光強度のZ軸に関連する損失を被ります。そのため、配置の一貫性が異なる胚の同等の領域の間の強度を比較するために重要です。
3. 遺伝子の発現を変化させることが治療の任意の並べ替えの対象とされていない野生型の胚を用いて、参照パラメータを設定します。
   1. MINS ^具 4 ^を用いて正確な分割を容易にするデータを得るために高倍率の対物レンズ（ すなわち 、40Xまたはそれ以上）を使用して画像を取得します。
      注：20Xの目的にデジタルズームを使用すると、MINSを使用してセグメント化するために十分な解像度の画像を得られません。それがあるべきように、1つはまた、目的の作動距離（WD）​​を注意する必要があります全体の胚盤胞にまたがるZスタック、このように長いWDの取得を可能にするのに十分な（〜130から150μm）の目的は、通常必要です。 図2に示されている画像- 4は、210ミクロンの作動距離と40X / NA 1.30油浸対物レンズを用いて得ました。
   2. フルオロフォアを漂白することなく、強い信号対雑音比を提供する最低のレーザ出力を使用してください。
   3. ゲインを調整し、サンプルをover​​exposingことなく、最も広いダイナミックレンジを得るためにオフセット。大部分をカバーする、または全体にまたがるように画像を露光する、グレースケール範囲が画像間の強度の小さな差の検出を容易にします。
   4. Z軸解像度がMINSとの正確なセグメンテーションのために重要であるため、小さな（1ミクロン）Z-ステップを使用してください。
      注意：XYの寸法は、核セグメンテーション処理、画像ファイルのみのサイズには影響しません。一般に、512×512ピクセルがcompromiなし出版品質の画像のために十分なXY分解能でありますハードドライブの空き容量を歌います。
   5. 重要なステップ：サンプルを比較することができるように、同じ実験のイメージングセッション内および全体で一貫性のある撮像パラメータを保管してください。
4. 胚のバッチをイメージング：
   1. 単一セッション内での画像コヒーレントグループ（リットル、実験）可能な限り。
   2. 同じ実験の反復のためのイメージングセッション内および全体で一貫性のあるパラメータを保管してください。
   3. すべての細胞を捕捉する（全Z軸）を通して画像胚。
      注記：所望であれば²³に記載されるように、胚の遺伝子型決定は、画像形成後に行ってもよいです。ネステッドPCRのための必要性は、経験的に決定されなければならないと分析される遺伝子座と使用するプライマーに依存するであろう。
5. 遡及的に画像に胚を一致させることができていることを確認してください。

4.画像解析やデータの前処理

1. ダウンロードしてインストールMINS ⁴のhttpから：// katlab-tools.org（MATLABライセンスが必要）。
2. 画像分割を実行します。
   1. ハードドライブからの共焦点画像やスタックをロードするためにMINSのグラフィック・ユーザ・インタフェース（GUI）をフォロー、核とセグメント画像を検出します。顕微鏡（.lsm、.lif、.oif、 など ）によって生成された生データの全体のZスタックをロードします。 http://katlab-tools.orgと⁴で検出された各ステップの詳細と手順については、 表2を参照してください 。完了すると、対応する「表示」ボタンをクリックして、各ステップの結果を表示します。ボタンの上の黄色いタグは、プロセスの動作を示し、緑色のタグは操作が完了を示しています。
      注：MINSは現在、配列またはマルチポジションファイル.TIFF、.cziファイルをサポートしていません - 各Z-スタックは独立したファイルである必要があります。
   2. 満足のいくセグメンテーション後、それは他の胚または同腹のために直接使用することができるように作成されたパイプラインを保存します。
3. バッチ・モード・セグメンテーション：
   注：Siのngleファイルを個別にセグメント化することができます。しかし、ゴミや実験内胚は、一般的に匹敵するステージのあることを考えると、MINSは監督なしでそれらのグループに単一のイメージ用に作成したセグメンテーションパイプラインを適用することができます。
   1. バッチモードファイル名を指定して実行]メニューから、[ファイルを追加]を一度に処理されるすべてのファイルを読み込む]をクリックします。注：異なるソースからのファイルは分割キューに追加することができます。
   2. 「バッチモード実行を開始 'とファイルを処理するためのソフトウェアのための時間を許可する]をクリックします。注：セグメンテーションの出力は、元のファイルが置か同じディレクトリに保存されます。
4. セグメンテーションの評価と手動補正
   注意：非常に高い精度（> 85％）でMINSセグメント画像が、しかしながら、染色および画像化、ならびに胚のステージの品質は、MINSのパフォーマンスに影響を与えることができます。一般的に、胚内のより高い核密度は、より多くの可能性が高いセグメンテーションエラーがPLACがかかりますE（ 図2D、3）。したがって、セグメント化の精度は、各サンプルについて評価されるべきであり、必要に応じて手動で修正。エラーの2つのタイプが一般的に発生する：セグメンテーションオーバーやアンダーセグメンテーション。
   1. オーバーセグメンテーションの解決：
      1. 偽陽性同定-アポトーシス小胞（ 図3Aの A、B、D、アスタリスク ）または無傷の核ではない他の要素が、MINSによってそのように同定されている可能性があります。
         注意：一般的に、このような偽陽性は、実際の核よりも小さいサイズを持っていると、ほとんどの場合、容易に識別することと、スプレッドシートでソートすることができます。小さ ​​いが、有効なセグメント化されたボリューム（ 図3Aの B、矢印 ）、その結果、核が部分的にしかセグメント化することができる多くの場合しかし、目視検査を強くお勧めします。
      2. *のstatistics.csvファイルから偽陽性のための対応するレコードを削除します。オリジナル*統計情報を保存しますこの.csv将来の参照用ファイルとそれのコピーのみを編集します。
      3. 核はオーバーセグメント化されていると2以上の核（ 図3A cを、矢印と矢印）として提示している場合は、どちらかそれらの強度レベルを平均化することによって、レコードをマージしたり、同様の場合、そのセルのレコードの1つを保持し、破棄残り。
   2. アンダーセグメンテーションの解決：
      1. MINSは、2つ以上の核の境界を検出することができなかったし、その結果、単一の核（ 図3A dを、矢印および図3B）としてそれらをセグメント化したイベントを特定します。注：測定レベルがマージ誤っされた細胞の平均値となり、別系統にする属してもよいので、これは、タンパク質レベルを定量するために、正確な細胞計数のために問題となるが、より重要なことに。
      2. MINSが完全に核を検出するために、失敗したイベントを特定します。
      3. これらのインスタンス（4.4.2.1と4.4.2.2）において、f平均グレーレベルを測定しますまたはそのようなImageJのような代替ツールを使用して、不足または非セグメント化されたセル（複数可）の各チャネル、（http://imagej.nih.gov/ij/）に、正しいレベルで誤ったレコードを交換してください。今後の参考のために、オリジナル* statistics.csvファイルを保存し、それのコピーのみを編集します。 ImageJのを使用してこれを行うには、次の手順を実行します。
         1. 仮想スタック（「ファイル」>「インポート」>「TIFF仮想スタック... '）としてMINSによって生成され、対応する* overlaid.tiffファイルをImageJのに関連するマルチチャネルスタックを開き、インポートします。
         2. アンダーまたは非セグメント化された核の中間部分を探します。
         3. フリーハンド選択ツールを使用すると、DNA染色チャネル上のアンダーまたは非セグメント化された核の周囲を概説します。
         4. 押しのCrl + M（Macintoshの場合はCmd + M）または分析メニューに移動し、「測定」を選択します。このアクションは、概説領域の平均グレー値を記録し、新しいウィンドウに表示されます。 「分析」に移動します>9;灰色の値が「選択されている意味...測定値を設定します」と確認してください」。測定しようとする他の任意のパラメータを選択します。
         5. ステップ4.4.2.3.3において概説したものと同じ領域を使用して、関心対象の蛍光チャネルごとに測定を繰り返します。結果は測定結果[結果]ウィンドウの前の1に追加されます。
         6. * statistics.csvファイル内の誤ったレコードを置き換えるために得られた測定値を使用します。核がセグメント化されていない場合は、新しい行を挿入し、それを新しいCell IDを割り当て、各チャネルの対応する列の下のImageJで得られた値をご紹介します。このセルは、空間座標（X、YとZ値）を持っていません。核がundersegmentedされていた場合、その行を複製し、それぞれの新しいセルに異なるセルIDを割り当て、対応する列の下のImageJで得られた値をご紹介します。この場合には、両方のセルは、空間座標を共有します。
            注：空間分布を分析する場合、我々はrを彼らが重複するようecommendは、これらの細胞のXYZ座標を除きます。新しいレコードを作成するときにこの目的のために、オリジナルのもの（例えば、非整数）と容易に区別されていることを、それらへのセルIDを割り当てます。
   3. 分裂細胞スコア。注：MINSは、有糸分裂だけでなく、間期核を検出し、それらを区別することはできません。
      1. 有糸分裂核は分析において別々に考慮されるべきである場合は、手動でこれらのスコアと、データファイルにこの情報を追加します。 、有糸分裂細胞を記録* statistics.csvデータファイルに新しい変数（列）を追加し、有糸分裂する異なる値と間期核を割り当てます。
5. データ前処理。
   注：スプレッドシートはオーバーのために修正されており、アンダーセグメンテーション彼らは分析する準備ができたら。分析プロセス及びデータ表示は、特定の実験に依存することになります。ただし、以下のいくつかの一般的なデータ変換があります私たちは、分析前に行うことをお勧めします：
   1. データのばらつきを低減するために、それらの対数や平方根に蛍光強度の値を変換します。生データはプロットの軸付近に集中する傾向がある（ 図4B、C参照）、これはまた、可視化を支援します。
   2. 蛍光のZ-関連の減衰を修正してください：
      注：レーザー走査共焦点顕微鏡画像での蛍光強度は、スライスが（ 図4E、F）に配置される軸Z上の深いを減少させます。
      1. 試料中に検出されたエピトープのユビキタスかつ均一発現ハウスキーピング核マーカーである場合には、ハウスキーピングマーカーの対応する値によって、各セルにその値を除算することによって他のエピトープの蛍光強度を正規化します。
      2. このような基準マーカの不在下で、以下のように蛍光のZ-関連する損失を補償します。
         1. 各マーカーの値をプロット（Yプロットのすべてのコントロール、野生型胚（ 図4F）のために一緒に値- Z位置の上のグラフ）（グラフのX軸）の軸がZを超える強度の減少を可視化します。
         2. 各マーカーの前のステップ（Z超える強度値）（ 図4F）で得られたプロットに線形モデル（回帰曲線）を取り付け。
         3. 以下の式を用いて各マーカーのすべての値を修正してください：
            ログ（元の値）+ Z *モデル（ 図4D、G）の傾き。
            注：（R、MATLAB など ）を使用し、解析ソフトウェアによって異なります。この補正を実行するための具体的な手順を。 Rを使用している場合は、データに線形モデルにフィットするように、次の式を実行します。
            > LM（ログ（チャネル）〜Z、データ=データフレーム）
            、 チャネルは補正すべき蛍光チャネルであり、Zは、Z座標され、 データフレームを所望の胚（複数可）のすべての値（*スタットを含む表でありますMINSまたはその改変によって生成されたistics.csvファイル）。
            注：上記の式の出力は次の形式を持っています。
            （インターセプト）Z
            4.76373 -0.01947
            ここで、値Zは、絶対値（例えば、 図4Gを参照）4.5.2.2.3に示した式で元の値を変更するために使用されるべきであるデータセットの回帰直線の傾きです。

Results

すべての細胞およびそれらの相対的な位置を分析することができるように、データの解釈とプレゼンテーションを容易にするために、ケアは、収集および操作中の胚を傷つけないように注意すべきである。図2A - 。Dは、拡張キャビティと異なる段階で無傷の胚盤胞の例を示しています。発生する損傷べき結果を分析し、解釈する際に、余分な注意が必要です。

このプロトコルを使用して生成されたデータの品質と信頼性は、固定の品質に、目的のタンパク質を検出するために使用される抗体の信号対雑音比に依存します。常に新鮮な固定液を使用して、一連の実験を開始する前に、適切な陽性および陰性対照で、新しい抗体をテストする。 図2Aは、核タンパク質の数のための良好な抗体の例を示している。 図2Bは examplを示しています細胞質タンパク質（DAB2）のための良好な抗体の電子。 図2...

Discussion

現在のプロトコルは、着床前段階のマウス胚の全マウント免疫蛍光の定量的な分析を実行する方法について説明します。堅牢な免疫蛍光プロトコル^22は、高解像度、ホールマウント共焦点イメージングによっておよびソフトウェア⁴の仕立て片を用いて画像分割が続いています。免疫蛍光プロトコルの選択は重要ではないが、我々は、高速で信頼性が高いことが、我々がテストした抗体の多くは強いシグナルを提供するために、ここに^22を提示されている1つを見つけます。他のプロトコルが続くことがあり、そのアプリケーションは同等の実験で一貫して提供します。多くの要因は、個々の実験の結果に影響を与える、と実験の間の直接の比較は必ずしも可能ではありませんが、我々は繰り返し間の整合性のために努力し、十分な技術的反復を実行すると、大幅に変動を減少させることを発見しました。そのため、一度最適化された、固定およびimmunolabelinG試薬およびプロトコル、ならびに撮像条件は、同等の実験の間に一定に保たれるべきです。

多くのエラー（ すなわち 、オーバ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
胚コレクション
プラグチェック用鈍いプローブ	Roboz	RS-9580
鉗子	Roboz	RS-4978
手術用ハサミ	Roboz	RS-5910
ガラスパスツールピペット	フィッシャー	13-678-20C
組み立て済み吸引器チューブ &マウスピース	Sigma	A5177
長めのゴムチューブ	Fisher	14-178-2AA
M2	ミリポア	MR-015-D
FHM	ミリポア	MR-024-D
酸性チロード液	ミリポア	MR-004-D
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	15140
ウシ血清アルブミン	Sigma	A9647
4ウェルプレート	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
免疫蛍光
96-well U-bottom plates	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Sigma	G7403
馬血清		ΣH0146
Primary Antibodies			Concentration
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R&D	AF1700	1:100
GATA4	サンタクルス	sc-9053	1:100、10分固定
GATA4	サンタクルス	sc-1237	1:100、O/N 固定
SOX17	R&D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, 10 min to O/N fixation
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Secondary antibodies Life	Technologies	Various	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Imaging
35 mm glass-bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
Computer running 64-bit Windows OS		n/a	Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (software)	Mathworks	n/a
MINS (ソフトウェア)	無料	n/a	http://katlab-tools.org