ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

Summary

ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。

Abstract

このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞の分化能力は、細胞置換療法のための潜在的治療用途を可能にします。分化した細胞型は、種々の変性疾患の治療のために使用することができる。、肺、肝臓、および膵臓の組織に向かって、これらの細胞のインビトロ分化は、第一段階として、決定的な内胚葉細胞の生成を必要とします。このステップは、レート制限などのインスリン産生β細胞、肝細胞または他の内胚葉由来の細胞型として末端成熟した細胞型に向けてさらなる分化のためのものです。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、非常にそのようなFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバー、および表面受容体CXCR4のような転写因子の多くを表現します。しかし、分化プロトコルはめったに100％効率的ではありません。ここでは、分化後のCXCR4 +細胞集団の精製のための方法を説明します磁性マイクロビーズを使用して、DEへ。この精製は、さらに不要な系統の細胞を除去します。穏やかな精製方法は、迅速で信頼性が高く、下流側のアプリケーションと分化を改善するために使用されるかもしれません。

Introduction

このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞は、ヒトの身体の実質的に任意の細胞型に分化する能力を有します。したがって、in vitroでの分化プロトコルは、心筋^1、肝細胞^2、β細胞^3、肺上皮⁴または神経細胞⁵のような多数の成体細胞型を生成することができます。これは、様々な変性疾患³の潜在的な治療のためのESCの貴重なツールとなります。

肺、肝臓と膵臓の成体組織に向かってESCのインビトロ分化は、胚体内胚葉^（DE）6を連想させる細胞への擬似原腸形成を必要とします。上記の体細胞型に向かって下流分化は著しく効率が低いので、最適な内胚葉分化は律速⁷とみなされます。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、茶を受けますそれらの遺伝子発現プロファイルのracteristic変化。例えばFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバーと表面受容体CXCR4のような他の転写因子の発現は非常^6、8、9を上方制御される一方、多能性マスター調節遺伝子がダウンレギュレートされている。CXCR4はSMAD2によりトランスされることが知られています、そのプロモーター領域¹⁰内の特定の結合部位へのノーダル/ TGF-βシグナルとSOX1....

Protocol

胚体内胚葉に向けたヒトESCの1分化

1. 37℃のインキュベーター中でヒト胚性幹細胞（ESC）を育成し、5％CO _2。
2. コー​​ト基底膜マトリックス1mlの新たな6ウェル細胞培養プレート、室温で少なくとも30分間培養ウェアインキュベートします。具体的な詳細については、各メーカーの指示に回してください。
3. 培養したヒトESCは、低倍率（ 例えば、4X）を使用して、顕微鏡下で80％-90％の密集度に達していることを確認してください。滅菌ガラスパスツールピペットで培地をオフに吸引することにより空洞から培地を吸引除去します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で1回細胞を洗浄します。このために、そっと各ウェルに2mlのPBSを追加し、プレートを振盪し、死細胞及び細胞破片を除去するために溶液を吸います。
4. 細胞クラスターの穏やかな解離のための無酵素継代液試薬の1ミリリットルを追加します。 37°C ANで細胞をインキュベートD 5％CO ₂の細胞は小さなクラスターに混乱の明確な兆候を示すまで。
   注：インキュベーション時間は、用いる試薬によって異なります。材料の項で述べた無酵素継代溶液について、インキュベーション時間はおよそ7分です。
5. 1ミリリットルDMEM / F-12培地を加え、ピペッティングにより、1mlのピペットチップを使用してダウン単一細胞に....

Results

分化すると ESCは、遺伝子およびタンパク質発現の急激な変化を受ける。 図1は、成功した内胚葉分化を確認するために使用することができる代表的なマーカー遺伝子を示します。遺伝子発現解析のための主要な標的は、GSC、FOXA2、及びSOX17ある。未分化のESCと比較した場合の相対的な遺伝子発現解析では、特にFOXA2及びSOX17は > 2000倍に増加している。GSCはすでに原始線条形成の間に非常に初期の24時間以内に発現していますしかし、それにもかかわらず4日目> 100倍に誘導されます。これらの遺伝子の発現は、CXCR4の表面マーカー^6を用いて選別時に結果的に増加します。これらの遺伝子の発現は、まだ4日後に検出可能であるが、このようなOCT3 / 4（POU5F1）およびNANOGなどの多能性のマスターレギ.......

Discussion

現在使用されて分化プロトコルはほとんど100％に分化した細胞になりません。まだ対処されなければならない理由のために、いくつかの細胞は、分化過程に抵抗します。使用される分化プロトコルの効率とESCの傾向に応じて、残留​​多能性細胞の特定の数は、一般的にさえ胚体内胚葉への分化後に観察されているライン。これらの残留細胞は、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、およびmiRNA発現解析などの下流の微分またはさらなる分析を損なうおそれがあります。残余の多能性細胞または他の不要な系統はまた、分化の目標を妨げる可能性パラクリン効果を示すことができます。したがって、これらの細胞の除去は、改善された再現性をもたらすことができます。

分化後に内胚葉細胞を発現CXCR4 +の精製は、これらの集団を濃縮するために、および分化過程に抵抗する細胞を除去するために使用することができます。表面DEマーカータンパク質CXCR4は、胚体内胚葉細胞の特異的な精製のために使用することができます。手元MACS精製プロトコル未満、2時間以内に完了することができ、高価な実験装置および装置なしですべての細胞培養実験室での単純な.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 ヒト胚性幹細胞株	ハーバード大学幹細胞・再生生物学		内胚葉世代に適した細胞株
Hes3 ヒト胚性幹細胞株	ES Cell International		内胚葉世代に適した堅牢な細胞株
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC 培養液
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, ヒト	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS セパレーター	Miltenyi Biotec	130-042-109	磁場
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK 阻害剤
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stemcell Technologies	7174	Enzyme-free継代液、代替:トリプシン/ EDTA
マトリゲル*	コーニング	354277	基底膜マトリックス *-80°Cでアリコートに解決して保存します。サプライヤーマニュアルに記載されているC。使用時には、氷上で解凍し、25 mlの氷冷ノックアウトDMEM / F-12. で希釈します6ウェルプレートの各ウェルに1 mlを加え、室温で45分間インキュベートします。 マトリゲルを取り外してすぐに使用します。
MS カラム	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS セパレーター	Miltenyi Biotec	130-042-302
ヒト FOXA2 FW gggagcggtgagatgga	ライフテクノロジー	ズ NA
ヒト FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	ライフテクノロジー
ズ ヒト GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	ライフテクノロジー
ヒト GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	ライフテクノロジー
ズ SOX17 TaqMan アッセイ	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
ヒト SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	ライフテクノロジー
ヒューマン SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	ライフテクノロジーズ
ヒト POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtgggggg	ライフテクノロジー
ズ ヒト POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca	ライフテクノロジー
ズ ヒューマンナノグ FW ccgagggcagacatcatcc	ライフテクノロジー
ズ ヒューマンナノグ REV ccatccactgccacatctcttct	ライフテクノロジー
ズ ヒューマンTBP FW caacag cct gcc acc tta cgc tc	ライフテクノロジー
ズ 人間 TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	ライフテクノロジー
ズ 人間 TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	ライフテクノロジー
ズ 人間 TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g ライフ	テクノロジー
ズ 人間 G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	ライフテクノロジー
ヒト G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	ライフテクノロジー
ズ アンチSOX2	サンタクルーズ バイオテクノロジー	sc-17320
アンチFOXA2	メルクミリポア	07-633
アンチSOX17	R&Dシステムズ	AF1924