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方法論記事

遺伝的にコードされたFRETベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング

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DOI:

10.3791/53659

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2016年1月4日

 ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

この記事について

サマリー

私たちは、遺伝的にコード化されたBAS FRETセンサーを使用して、生細胞内の胆汁酸動態を研究するための詳細なプロトコルを提供します。この胆汁酸センサーは、幅広い細胞タイプにおける胆汁酸輸送とFXR活性化を研究(調節)するためのユニークなツールです。

要約

Förster Resonance Energy Transfer（FRET）は、単一細胞におけるタンパク質のフォールディング、相互作用、局在を監視するための強力なツールとなっています。FRETの原理に基づくバイオセンサーは、生細胞内の細胞内シグナル伝達イベントを高い時間的および空間的分解能でリアルタイムに可視化することを可能にしました。ここでは、ファルネソイドX受容体リガンド結合ドメイン(FXR-LBD)に融合した2つの蛍光色素からなる遺伝的にコードされた胆汁酸センサー(BAS)の応用について述べます。これにより、多数の胆汁酸種や他の(合成)FXRリガンドによって活性化される胆汁酸センサーが形成されます。このセンサーは、核(NucleoBAS)やサイトゾル(CytoBAS)などのさまざまな細胞コンパートメントを標的にして、胆汁酸濃度を局所的に測定できます。これにより、細胞性胆汁酸の流入、排出、内因性胆汁酸の細胞内分布を迅速かつ簡単に定量でき、蛍光タグや放射性核による標識は必要ありません。さらに、BAS FRETセンサーは、FXRリガンド結合のモニタリングにも役立ちます。最後に、このFRETバイオセンサーは、スペクトル的に異なる他の蛍光色素のイメージングと組み合わせることができることを示します。これにより、細胞内胆汁酸動態と、i)目的タンパク質の局在および/または存在量、またはii)単一細胞内の細胞内シグナル伝達の複合解析が可能になります。

概要

フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）が広く、高い時間および空間分解能1と生細胞中の細胞機能のより良い理解を得るために使用されます。 FRETは、励起されたドナーフルオロフォアからのエネルギーは、アクセプターフルオロフォアへ転送されます。 FRETの効率は、ドナーとアクセプターフルオロフォアとその方向との間の距離に強く依存するため、2つの蛍光体に影響を与えるコンフォメーション変化の敏感な読み出しです。この現象は、小分子のイメージングのためのFRETベースのバイオセンサーを生成するために利用されます。それらの濃度の変化は、ドナーフルオロフォア2対アクセプターの発光強度の比の増加/減少するように監視することができます。例えば、FRETベースのカルシウムのバイオセンサーは細胞3生き内遊離カルシウム濃度の迅速かつ安定した検出を可能にします。 FRETベースのバイオセンサの他の利点は、単一の生細胞内で撮像され、T相続人の非侵襲性は、それらの能力が異なる細胞型および細胞区画4を標的とします。

細胞内の胆汁酸動態の多くの側面は、まだよく理解されていません。例えば、少しは、共役および非抱合型胆汁酸輸送の規制の根底にあるメカニズムについて知られています。既存の技術は、この輸送は、主に、ルシフェラーゼベースのレポーター、放射性標識胆汁酸、または蛍光胆汁酸類似体を利用する監視します。後者は、おそらくそれらの特性に影響を与え、胆汁酸の修飾を必要とします。ルシフェラーゼベースのレポーターは悪い時間分解能を持っています。また、これらの技術は、サンプルの損失をもたらし、単一細胞でのイメージングには適用されません。したがって、それはレシオメトリック検出5,6の利点を備えているので、特に、FRETバイオセンサーを使用して、輸送活性の生きた単一細胞イメージングを可能にする方法を使用することが有益であろう。一方、CFの変種P / YFPのフォームは、最も頻繁に、FRETペアを使用し、自己会合を誘発する変異を有するmOrangeとmCherryをを使用して、新しい戦略がレッドシフト胆汁酸センサー7を含む小説センサー、とのFRETツールボックスの拡大につながっています。

我々は以前ファルネソイドX受容体（FXR）のリガンド結合ドメインと融合されるドナーフルオロフォア（セルリアン）とアクセプターフルオロフォア（シトリン）で構成され、遺伝的にコードされたFRET胆汁酸センサー（BAS）を、作成した（FXR-LBD）そして、LXXLLモチーフ8を含むペプチド 。胆汁酸依存的にFXR-LBDとこのペプチドの仲間。 FXRの活性化の際に、シトリンと紺碧の間の距離は、立体構造の変化に起因する変更されます。哺乳動物細胞株における、FXR活性化の結果シトリン/セルリアン比で明らかに検出可能な増加で、精製されたセンサーは、反対方向に動作し、FXRの活性化の際に減少FRET比をもたらしました。このセンサー（CytoBAS）細胞質の胆汁酸動態のモニタリングを可能にします。細胞内ターゲティングモチーフのカルボキシル末端付加することで、BASの構築物は、異なる細胞区画における胆汁酸濃度の測定が可能、核（NucleoBAS）およびペルオキシソーム（PeroxiBAS）を標的とすることができます。ペルオキシソーム標的モチーフの添加は胆汁酸への応答性を損なうものではないが、細胞透過性FXRリガンドは、ペルオキシソーム8内 PeroxiBASの任意のFRETの変化を誘導しませんでした。この矛盾の性質は不明であるため、プロトコルは以下CytoBASとNucleoBASに焦点を当てています。

この遺伝的にコードされたFRETセンサーの使用は、最近、肝胆汁酸輸送体+ /タウロコール酸共輸送ポリペプチド（NTCP）Naおよび有機溶質輸送体アルファ/ベータ（OSTαβ）を8含む細胞で実証されました。 NTCPは、主要な肝胆汁酸輸入国であるとOSTαβは基底外側の腸胆汁です電気化学的な胆汁酸濃度勾配9、10に依存輸入および輸出の両方として機能することができる酸トランスポーター。最近のデータは、NTCP、および/またはOSTαβによる胆汁酸輸送の際に、リガンド - FXR-LBD相互作用の結果として、FRET比の堅牢かつ高速応答を観察することができることを示しました。

ここで、我々は、そのような共焦点顕微鏡分析および蛍光セルソーター（FACS）などのFRETを測定する方法のための詳細なプロトコルを記述する重要なステップを強調表示し、潜在的な問題に対処し、別の方法を説明します。この遺伝的にコードされたFRETセンサーを使用して、FXR-LBDと胆汁酸との相互作用を定量化し、生細胞内で直接監視し、リアルタイムでの胆汁酸の輸送および動態を可視化する迅速かつ簡単な方法を提供することができます。 CytoBASとNucleoBASをコードする哺乳動物発現プラスミドは、市販されています。したがって、このバイオセンサーは、さらにに貢献することができます胆汁酸輸送体またはFXRを活性化し、胆汁酸の生物学およびシグナル伝達をより深く洞察を提供する化合物の理解。

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プロトコル

1.一過性トランスフェクション

注：CytoBASとNucleoBASは（材料表を参照してください）​​が正常にいくつかの細胞型、（U2OS、Huh7細胞、HepG2細胞、H69、MDCKおよびHEK293T細胞）で使用されています。センサーを使用するための主な要件は、それが細胞に入るために、符号化DNAを必要とする、発現される必要があることです。

  1. 80％コンフルエント25cm 2のフラスコから細胞を回収します。特定の細胞株（U2OSとのHuh7細胞を10％FBS、1％L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）に適した完全培地中の細胞を希釈します。
  2. 滅菌8よくチャンバーカバーガラス（1.4 cm 2）とに所望の密度で細胞をプレート。これは必須ではないが、実験の日に、細胞のサブコンフルエント（60〜80％コンフルエント）層を目指します。
  3. ウェルあたり400μlの最終体積に完全培地を追加します。細胞を24時間付着させます。
  4. NucleoBAS0.5μgのを追加することにより、滅菌チューブ中でトランスフェクションミックスを調製または培養培地100μlにCytoBASのDNA（血清/抗生物質を含みません）。よくボルテックス。トランスフェクション試薬を加え、ボルテックスで混和します。最適な効率を与えるトランスフェクション試薬は、細胞型に依存しており、事前のテストが必要になる場合があり。
    1. 例えば、1 mg / mlのポリエチレンイミン（PEI）の2.5μLを使用して、DNA / PEIは、室温で15分間混合しインキュベートします。
  5. 細胞への液滴にトランスフェクション混合物を加え、穏やかに手でウェルプレートを振とうして混合します。 〜9.6センチメートル2のウェルについて、混合物の100μlのを追加します。一過性にトランスフェクトされた細胞のための個々のイメージング室のためのトランスフェクション混合物の10μLを使用します。
    注：24-48時間後、細胞は、胆汁酸センサーを発現する実験のために使用することができます。

2.安定なトランスフェクション

  1. 80％コンフルエント25cm 2のフラスコから細胞を回収します。特定の細胞株（10％ウシ胎児Sに適した完全培地中でペレットを希釈U2OSとのHuh7細胞についてerum、1％L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）mlで150,000細胞の濃度を、6ウェル培養プレート（2 mlの端容量）でウェルあたり30万人の細胞を加えます。
  2. 細胞を24時間付着させます。
  3. 培地（血清/抗生物質を含まない）の100μlに（材料表を参照してください）CytoBASまたはNucleoBAS DNA0.5μgのを追加することにより、滅菌チューブ中でトランスフェクションミックスを調製します。よくボルテックス。トランスフェクション試薬を加え、ボルテックスで混和します。
    1. 例えば、1 mg / mlのポリエチレンイミン（PEI）の2.5μLを使用して、DNA / PEIは、室温で15分間混合しインキュベートします。
  4. 細胞への液滴中のトランスフェクション混合物の100μLを加え、穏やかに手でウェルプレートを振とうして混合します。安定な細胞株を作成するときは、必ずトランスフェクトしていないコントロールが含まれています。
  5. 37℃、5％CO 2で細胞O / Nを成長させます。
  6. 製造業者のプロトコールに従ってトリプシン処理細胞（37℃ワットで細胞をインキュベートしますi番目の1.5ミリリットルを25cm 2の細胞培養あたりのトリプシンを予熱し）し、室温で5分間250×gで、それらをスピンダウン。上清を除去し、完全培地13 ml中に細胞を再懸濁。 0.5ミリリットル（低密度）、1.5ミリリットル（中密度）、および4.5ミリリットル（高密度）：様々な直径10cmの培養皿の上にセルを分割します。 6.5ミリリットルの残りについても同じ操作を行います。
  7. 10 mlの最終体積に培地を加えます。 U2OS細胞の場合、そのようなCytoBASとNucleoBASは陽性細胞を選択するための構築物としてネオマイシン耐性カセットを有するプラスミドを800 / mlのG418を使用しています。この濃度依存性の細胞型で、非トランスフェクト細胞は、（U2OS細胞を800μgの/ mlのG418）2〜10日以内に死亡した最低の抗生物質（G418）の濃度を選択することによって決定することができます。
  8. 非トランスフェクト細胞が死んでいるまで、適切な抗生物質（G418）を含む培養培地ごとに72時間を更新します。
  9. 20Xの目的のために顕微鏡下で培養プレートを調べ陽性コロニー（蛍光緑、シアンや黄色の蛍光のために使用されるほとんどのフィルターセットを使用して監視することができます）。
  10. 培養皿の外側の底にペンで他のコロニーから単離し嘘陽性コロニーをマーク。
  11. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回プレートを洗浄し、それを吸引除去します。約15無菌クローニングシリンダーを取り、無菌のシリコーンにそれらを浸し。ペトリ皿に軽く押すことによって選択されたコロニーの周りにそれらを適用していない複数のコロニーをクローニングリングに含まれていることを確認します。
  12. ピペット20クローニングシリンダー内の予熱したトリプシン（1倍、0.25％）のμLと切り上げた細胞のほとんどは、（顕微鏡で観察）まで37℃でインキュベートします。
  13. クローニングシリンダー内（U2OSとのHuh7細胞を10％FBSおよび800μgの/ mlのG418）血清および適切な抗生物質を培地150μlを添加して、ダウン細胞を再懸濁し、96に転送するには、いくつかの回をピペットとウェルプレート。 4-24時間後に培地を更新し、細胞が数日（37℃、U2OSとのHuh7細胞について、5％のCO 2）でコンフルエントに成長することができます。
  14. 3日または4日ごとに抗生物質を含む培地をリフレッシュします。細胞がコンフルエントに成長しているときに、大きなウェルプレートに移します。文化は実験のための十分な大きさになるまで、この手順を繰り返します。バックアップのためのいくつかのバイアルを凍結保存。凍結保存培地は補充物を含まない培地（DMEM）中の20％FBSおよび20％DMSOから成ります。
    注意：ここで、細胞株は、モノクローナル抗体および胆汁酸センサーを表現するための安定であると考えられます。抗生物質G418（400μgの/ mlで）の半分の濃度は、現在安定した細胞株での発現を維持するのに十分です。

3.レンチウイルス形質導入

注：一部の細胞株は、例えば、ポリエチレンイミン（PEI）法などのより伝統的な方法によってトランスフェクトすることは困難と考えられています。細胞のウイルス形質導入は、効率的な代替ツールFでありますまたは遺伝子送達と安定した導入遺伝子の発現。

  1. 80％コンフルエント25cm 2のフラスコから細胞を回収します。特定の細胞株に適した完全培養培地中の細胞（U2OSとのHuh7細胞を、10％FBS、1％L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）で希釈し、6ウェル培養プレートにウェルあたり約200,000細胞を加えます。
  2. ウェル当たり2ミリリットルの最終容量まで培地を追加します。細胞を24時間付着させます。
  3. （リクエストに応じて利用可能）培地を含有する500μlのCytoBASのレンチウイルスに4-6時間、細胞をインキュベートすることによって、ウイルス形質導入を行い10 / mlのジエチルアミノエチル（DEAE） - デキストランまたは他のレンチウイルスを含む完全培地で1ミリリットルの合計量まで充填形質導入増強剤。形質導入されていない対照細胞とよくを含めることを忘れないでください。
  4. 培地を除去し、所望の抗生物質（500 / mlのハイグロマイシン）を含む完全培地2 mlを加え。提供CytoBAS伝達のためのレンチウイルス構築物を使用してくださいS細胞にハイグロマイシン耐性。所望の条件下で細胞を増殖させます。
  5. すべて陰性対照細胞は、（ほとんどの細胞株について約1〜2週間かかります）死んでいるまで、（500 / mlのハイグロマイシン）、抗生物質3日ごとに培地を更新したときに80％のコンフルエント細胞を分割します。細胞株は、現在胆汁酸センサーを発現する安定したと考えられています。
    1. また、1〜3日ウイルス形質導入後の実験のための細胞を使用しています。生きたウイルスが存在する可能性があるように、これは適切な安全レベルの部屋でFRET-読み出し装置を必要とします。
  6. 代替的に、安定な細胞株の迅速な単離のために、蛍光活性化細胞選別（FACS）を行います。
    1. コンフルエント160センチメートル2フラスコから細胞を回収します。
    2. 1ml当たり最大5×10 6細胞の濃度を<5％血清を含むリーボビッツ培地中の細胞（L-15培地）で希釈
    3. 選別された細胞の収集のために、収集培地1ml（L-1をFACSチューブを埋めます5培地+ 1.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％のL-過剰及び20％血清）。
    4. 405レーザーで励起シトリン（520から580ナノメートル）またはセルリアン（450から520 nm）でのソート細胞。
    5. 約500,000個の細胞をソーティングした後、細胞（5分、250×gで）をスピンダウンし、5 ml中に再懸濁し、通常の完全培地（10％FBS、250 / mlのハイグロマイシンU2OSとのHuh7 CytoBAS細胞）およびT25培養でそれらをめっきフラスコ。所望の条件（37℃及びHuh7細胞U2OS細胞について、5％のCO 2）で細胞を成長させます。

胆汁酸センサー4.ライブ細胞イメージング

注：胆汁酸輸送体を含む細胞は、親油性化合物を削除する1〜10％の炭ろ過血清を含む培地で培養することができます。正常血清は、多くの場合、胆汁酸センサーの細胞内の胆汁酸の蓄積と飽和につながる可能性胆汁酸が含まれています。

  1. 共焦点顕微鏡を使用して、FRET測定
    1. 安定細胞またはtransieのプレートntly無菌の8ウェルカバースリップ底チャンバースライドに所望の密度でセンサーを表現（1.4 cm 2）が必要です。実験の日に、密集度が約60〜70％となるように（木炭濾過した血清を使用して）完全培地中で細胞を増殖させます。
    2. PBSまたはリーボビッツのL-15培地1×200μlで一度チャンバースライドで接着細胞を洗浄。
    3. 何のCO 2の制御が必要でないように吸引し、300μlのリーボビッツのL-15培地と交換してください。
      注：フェノールレッドなしのDMEMも同様に使用されるが、CO 2緩衝条件を必要とすることができます。胆汁酸センサーショー（一部）pH感受性はそれほどデータ収集中のpHを一定に保つことを目指しています。
    4. L-15培地中でも、共焦点イメージング実験において使用される化合物を希釈します。 、撮像中に、チャンバー内の液体の比較的大量の試料（50〜100マイクロリットル）の急速な混合を確保するために添加しなければならないことを考慮してくださいそう3-5xソリューションを作ります。
    5. 37℃のインキュベーションチャンバーと共焦点顕微鏡の画像処理ソフトウェアを起動して、紫色の405nmレーザーをオンにします。客観的にイマージョンオイルの滴を入れて、その上に8室を配置します。 FRETの単一細胞イメージングのために、63X油の目標を使用しています。センサーが正常に室温で使用されてきたが、細胞の挙動を変更することがあります。
    6. 適切に共焦点顕微鏡の設定を行います。
      1. 取得モードを設定します。XYT（単一焦点面のタイムラプスイメージング）。
      2. 化合物は、実験を一時停止することなく、取得の間に追加することができるように、20秒間隔で画像を取得します。
      3. セルリアン：発光検出のための設定スペクトル範囲450から520 nmの。シトリン：520から580 nmの。
    7. 透照光を用いた単一細胞層に焦点を当てています。撮影を開始し、より正確にz位置を調整します。ゲインを調整したままでバックグラウンドからの信号を区別するために、各チャネルのオフセット目的の細胞内の全ての画素についても飽和下る。
    8. 関心領域（ROI）を定義するために円を描画します。同様の蛍光強度を示す細胞を選択します。明らかに大きさや形状に平均セルと異なるセルを避けてください。センサの光退色を最小限にするために、できるだけ短時間で光に細胞をさらします。これは、細胞周辺部に非常に近接していないのROIを描画することをお勧めします。この領域は、焦点によるドリフト（z方向に移動する細胞）がより困難に実験中の蛍光比の変化を監視することに蛍光強度の変化に最も敏感です。
    9. 共焦点顕微鏡を用いて測定を開始します。セルリアンとシトリン蛍光が安定するまで待ちます。
    10. 測定時に選択された時点で50〜100μlの胆汁酸または他の化合物を追加します。液体（最終容量の1/3に五分の一）の比較的高い量は、/ P振盪せずに（10秒以内）よく流体を混合するために必要です上下ipetting。ピペットチップで8ウェルチャンバーの縁に触れ、細胞が焦点から出ないように、ゆっくりと液体を追加しないことを確認してください。プラトー期に達する前に、新しい化合物を添加しないでください。これは、約200秒かかります。
    11. 100μlのGW4064、最終濃度5〜10μM（センサ飽和用量）を加えて、各実験を終了し、センサー蛍光が安定するまで待ちます。
    12. 実験を保存して、.AVIファイルとしてデータをエクスポートします。
    13. プラグイン>スタック>スタックのインターリーバを選択することで、ImageJの両方のAVIファイル（01チャンネル、シトリンチャンネル00、セルリアン）で開きます。 （http://www.openmicroscopy.orgで入手可能）は、適切なプラグインを使用して直接イメージJで別の方法として、インポート共焦点ファイル（ 例えば、.lsmまたは.lifファイル）と4.1.14のステップに移動します。
      1. スタック1の場合：チャンネル01（シトリン）を使用します。
      2. スタック2の場合：チャネル00（セルリアン）を使用します。
    14. [編集]> [選択]をクリックして[追加]> [マネージャに、ROIマネージャ]ウィンドウを開きます。チェックボックス「すべて表示」をチェックしてください。
    15. 楕円形選択ツールで特定のセルをカバーする利息（ROIを）のいくつかの領域を描画します。また、バッ​​クグラウンド信号を決定するためにセンサーを発現しない細胞外または細胞内の領域内の1つの円を描きます。それが原因焦点ドリフト（z方向に移動する細胞）または細胞移動の蛍光強度の変化は明らかだったときの実験では、細胞周辺部に非常に近接していないのROIを描画することをお勧めします。
    16. 一つのセルを選択します。プラグイン>比率プロファイラをクリックします。 RAW、比とRatio_Profile：これは、3の画面になります。 RAWウィンドウは、FRETがある場合シトリン（青線）の強度の増加と紺碧（赤線）の減少を示しています。比ウィンドウは、FRETの増加に伴って増加しますセルリアン比シトリン/についての情報を提供します。 Ratio_Profileウィンドウは、両方のチャネルで測定された蛍​​光強度の実際の数を示します。 MICROS場合ファイルは、チャンネル順序を逆可能性があります使用されているセットアップ固有のファイル（ 例えば、.lsmまたは.lifの代わりに.AVI）を対応。
    17. 補足データとして添付のスプレッドシートにRatio_Profileウィンドウからデータをコピーします。他のすべてのセル（と背景ROI）についても同様にします。
      注：オンライン表計算では、すべてのデータが最大BAS活性化が予想される状態に正規化されます。 GW4064は、FXRの最も強力な活性化因子であることを考えると、GW4064の余剰とのインキュベーション後の蛍光比が1に設定されているこれは、GW4064を添加した実験の全てを終了することが重要です。これの利点は、データがもはやより容易に比較することができ、別の日に、レーザ強度​​又は検出器利得及び実験に依存しないことです。また、スプレッドシートの下のグラフでは、実行中の平均値は、実験ノイズの曲線を平滑化するために使用することができます。動的データを分析するときただし、実行中のアベラので、このグラフを使用しないでくださいGEはまた、速い動的応答を滑らかにします。
  2. 蛍光活性化セルソーティングを使用したFRET測定（FACS）
    1. 無菌FACS取り込みバッファー（0.3 mMのEDTA、0.5％のBSA、0.01％NaN 3を、10 mMのD-グルコース）でのFACS実験の全ての化合物を希釈します。
    2. PBS中の5mMのEDTAを用いて80％コンフルエントなT-160 cm 2の細胞培養フラスコから収穫細胞。 5分間250×gで遠心分離した細胞。 RTで5ミリリットルのFACS取り込みバッファに細胞ペレットを2回洗浄します。
    3. コー​​ルターカウンターや計数チャンバーを用いて細胞を数えます。
    4. 1×10 6細胞/ mlの濃度になるようにFACS取り込み緩衝液中でペレットを希釈します。単一細胞の均質な懸濁液を作成するために、上下にピペット。細胞は脱凝集するのが困難である場合は、ノズル目詰まりを最小限に抑えるために選別前の細胞ストレーナーを通してサンプルを置きます。
    5. FACSチューブあたりピペットで200μlの細胞と光から保護。
    6. 化合物の所望の濃度を追加する（ 例：、胆汁酸、合成FXRリガンド、トランスポーター阻害剤）。渦。 （暗所では）振とうしながら室温で20〜30分間インキュベートします。
    7. 一方、FACSを（レーザーはウォームアップ時間が必要）を起動します。
    8. 実験のためのフローサイトメトリー・ゲーティングのパラメータを設定します（ 図3を参照）。
      1. ゲートを決定するために、細胞をトランスフェクト10〜20万NucleoBASまたはCytoBAS周りロード。
      2. 最初のプロットの中心にセルをプロットするFSCとSSCの電圧を調整します。
      3. 青紫色レーザを用いて、セルリアン（40分の450 nm）の電圧値とシトリン（20分の525 nm）の電圧を調整し、すべてのNucleoBASまたはCytoBAS陽性細胞は散布図内にプロットされていることを確認してください。
      4. 正しいゲート（門P4までのゲートP1）を設定し、 図4を参照してください 。
        1. SSC-A / FSC-プロットの中央にメイン集団を選択することにより、通常は左下隅に表示された死細胞を排除するためにゲートP1を使用してください。
        2. でゲートP2を使用してくださいFSC-H / FSC-ウィンドウは分析からデュプレットを削除します。単一細胞が二重以上の対角線に提示されています。
        3. シトリンでゲートP3（20分の525 nm）の/セルリアン（40分の450 nm）のウィンドウがシトリンと紺碧の高い細胞をゲートすることによって、NucleoBAS / CytoBAS陽性細胞を選択するために使用することができ、人口が右上に斜めに表示しましたプロット。
        4. できるだけ近い人口の左上にあるゲートP4を、描画し、細胞の5％以下は、このゲート内に収まることを確認してください。
      5. 自家蛍光を決定するためにいくつかの非トランスフェクト細胞（CytoBASまたはNucleoBASの発現なし）をロードします。トランスフェクトしていない人口は、ゲートP3に配置されない場合があります。自動蛍光細胞を排除するために、必要なときにゲートP3を調整します。
    9. FACSにチューブを配置する前に、サンプルをボルテックス。各サンプルについて、ゲートP3に少なくとも10,000細胞を測定します。
      注：人口階層ウィンドウは、イベントの数を示します親ゲートの各ゲートと％を表示されています。ゲート4には、親の％はすべてNucleoBAS陽性細胞の割合として増加シトリン/セルリアン比で細胞を述べています。

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結果

提示FRET-BASセンサはFXRのリガンド結合ドメイン（LBD-FXR）2つのフルオロフォアシトリンと紺碧に取り付けられている）とLXXLLモチーフに基づいています。このセンサは、高い空間分解能と時間分解能（ 図 1 A）と生細胞内で胆汁酸輸送の調査を可能にします。セルリアンとシトリンの変異は分子内複合体（ 図 1 B）の形成を促進するために適用しました。胆汁酸および他のFXRリガンドは、FXRに結合し、それによりコンホメーション変化によってシトリンと紺碧の間の距離を変化させます。哺乳動物生細胞では、これは、増加したFRET効率（シトリン増加、セルリアン減少）（ 図 1 C 1 D）が得られます。共焦点...

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ディスカッション

ここでは、生きた細胞内の胆汁酸輸送の時空間ダイナミクスを監視することができる新規な遺伝的にコードされた胆汁酸センサーを使用するための詳細なプロトコールを提示します。このバイオセンサーは、それによって、FRETベースの胆汁酸センサー（BAS）を形成する、FXR-LBDに融合されセルリアンとシトリン蛍光タンパク質で構成されています。

細胞培養およびFACSまたは（共焦点）顕微鏡の基本的な経験をしたとき胆汁酸センサーは、使用中の比較的簡便です。しかし、いくつかの側面は、いくつかのトラブルシューティングが必要な場合があります。胆汁酸輸送体と組み合わせた胆汁酸センサーを使用する場合には、木炭濾過血清を含む培地中で細胞を培養することが推奨されます。木炭は、さらに血清からの吸着によって胆汁酸のレベルを低下させます。これは非感受性センサーの最も一般的な原因であるため、特に、NTCPなどの輸入の存在下では、これは、培養中のセンサの飽和を防ぐために重要です実験中。そのため、他のセンサは、より大きなダイナミックレンジ8を作成し 、胆汁酸に対する感度を変更する突然変異を含む（Nucl...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、ERCの設立助成金（ERC-2011-StG 280255およびERC-2013-StG 337479）およびオランダ保健研究開発機構（Vidi 91713319）によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CytoBAS Addgene62860
NucleoBAS Addgene62861
ダルベッコの改変イーグルス培地 (DMEM)ロンザBE12-614FL-グルタミンを含まない高グルコース
ペニシリン-ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)ロンザ17-602E
L-グルタミン (200mM)ロンザ17-605E
ウシ胎児血清 (FBS)Invitrogen102-70
トリプシン-EDTA (10x)ロンザCC-5012
T-25細胞培養フラスコVWR国際392-0253ミニンコーティング
T-175細胞培養フラスコVWR国際392-0238ミニンコーティング
6ウェルプレートVWR国際734-0229ポリ-L-リジンおよびラミニンコーティング
10cmディッシュVWR国際392-0243ラミニンコーティング
ジエチルアミノエチル(DEAE)-デキストランSigma-AldrichD9885
ポリエチレンイミン(PEI) Brunschwig23966-2
G418 (geneticin) 50 mg/mlInvitrogen10131-027
ハイグロマイシン B, 50 mg/mlInvitrogen10687-010
クローニングシリンダー (6 x 8 mm)Bellco2090-00608
L-15 Leibovitz culture mediumInvitrogen21083-027フェノールレッド不
ポリスチレン丸底チューブ (5 ml) Facs チューブFalcon BD352008キャップなし、非滅菌
Falcon 2,063 チューブ (5 ml)Falcon BD352063スナップキャップ、滅菌済み
Nunc Lab-Tek 8 ウェルカバーガラスThermo scientific155409
チャコールろ過 FBSLife テクノロジー12676011
GW4064Sigma-AldrichG5172
TCDCASigma-AldrichT6260
CDCASigma-AldrichC9377
その他の化学物質Sigma-Aldrichn.v.t.
ララ使用 滅菌

参考文献

  1. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
  2. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  3. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  4. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  5. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  6. Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
  7. Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
  8. van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
  9. Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
  10. Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
  11. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170(2011).
  12. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  13. Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).

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