アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

アレナウイルスは、自然界^1-3のげっ歯類で主に維持されている包まれ、一本鎖RNAウイルスのファミリーです。これらのウイルスは、通常、齧歯類貯水池^1,2に無症候性、持続感染を確立しているが、それらは、ヒト³に重篤な疾患を引き起こす可能性があります。重要な病原性の種は、新世界フニンウイルス^（JUNV）4とそれぞれアルゼンチン南米出血熱、アフリカのラッサ熱の病因剤である旧世界ラッサウイルス^5が含まれます。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）、家族⁶の原型ウイルスは、世界的な分布を持っており、免疫抑制における免疫応答性個体⁶で無菌性髄膜炎、胎児⁷に重篤な先天性欠損、または高い致死率を含む種々の疾患状態の原因であります固形臓器移植^8,9を以下の個人。米国の欠如これらのウイルスに対抗するための食品医薬品局（FDA）が承認したワクチンや有効な抗ウイルス薬は、治療これらの新興/再新興病原体を標的とする新たな戦略を開発するための重要な必要性を強調しています。

アレナウイルスのゲノムは、2つの一本鎖RNAセグメント、大（L）（〜7.2キロバイト）と小（S）（〜3.6キロバイト）セグメント¹⁰から構成されています。 Lセグメントはウイルスポリメラーゼ（L）、およびマトリックスタンパク質（Z）をコードしながら、Sセグメントはウイルス核タンパク質（NP）およびエンベロープ糖タンパク質（GP）をコードします。 LとSのゲノムRNAセグメント（のvRNA）は、ビリオン^10-12にパッケージ化されています。アレナウイルス感染の初期段階は、ウイルス粒子の付着はJUNVのために、ヒトトランスフェリン受容体^{1（hTfR1）13,14を}含み、ウイルスGPとそれに対応する宿主細胞受容体との間の相互作用を介して細胞をホストすることです。添付ファイルの後、JUNV粒子はクラスリン依存性エンドサイトーシス^15を介して細胞内に取り込まれます。その後、粒子このコンパートメントの低pHはGP ^16,17の活性化を誘発後期エンドソームへのトラフィック。いったんウイルスおよびエンドソーム膜の融合を開始し、エンドソーム膜に、GP-コードされる融合ペプチド挿入を活性化しました。彼らは、ゲノムの複製および転写のための鋳型としての役割を果たす細胞質内へのビリオンにパッケージのvRNAのリリースで成功融合結果。ウイルス構造タンパク質とのvRNAの十分な量が生成されると、新しい粒子がライフサイクル^18を完了するために感染細胞からアセンブルし芽。

治療的に病原性アレナウイルスを標的とするために新たな戦略の発見を容易にするために、当社グループは、ホスト用のウイルス増殖のために重要な、しかし必須では宿主因子の同定に焦点を当ててきました。この文脈において、そのような宿主因子によって制御されるウイルスのライフサイクルの正確なステージ（複数可）を定義する案内することが必要です抗ウイルス戦略の開発。ここで、我々は、選択された宿主タンパク質および/ ​​または抗ウイルス性分子がウイルス侵入¹⁹のこの初期の段階に影響を与えるかどうかを識別するためにアレナウイルス-細胞接着を測定するために使用することができる定量的（q）はRT-PCRに基づくアッセイを記載します。アレナウイルス-細胞付着を測定するための別のアプローチは、ビオチン²⁰で標識されたビリオン、蛍光染料^21、または放射性同位元素^22を特色^にしています。これらの方法の欠点は、入力されたウイルスの大量の要求（感染の例えば、高多重度（MOI））、放射能の使用、および/ ​​または入力ウイルスを調製するための追加の処理工程（ 例えば、濃度および/ ​​またはウイルスの標識）を含むことができます。特に、高いMOIを用いることが困難な非生産添付イベント^15,23対生産性を区別することができます。ここに記載のqRT-PCRに基づくアッセイは、20プラークとしていくつかを使用して、添付イベントを検出することができます。48ウェルプレートのために0.0004のMOIに変換ウイルスの明単位（PFUの）、。したがって、アッセイの強い感度が高いMOIの要件だけでなく、任意のウイルス標識または濃縮工程を克服します。さらに、アッセイは、ⅰ）融合後のビリオンのエンドサイトーシスと同様に細胞質へのウイルスゲノムの放出を測定するように構成することができると、ii）参照、例のために（ウイルス特異的定量RT-PCR試薬の開発を通じて、他のウイルスで使用するために仕立て^24-27）。

注：記載されているプロトコルは、（前のPCR実験室とどのように良いプレPCR法を用いた実験を行うための設定方法についての優れた概要については^28を参照^のこと ）、厳格な事前-PCR法を用いて行うことが重要です。すべての試薬および装置は定量PCR標的配列を含む増幅されたDNAを含まないと、適切なコントロールは、このような汚染を検出するための場所にあることが肝要です。プロトコルの概要を図1に示されています。

1. 48ウェルプレート中のメディアや種子細胞を準備します

1. 50 mlで添加することにより、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、1％HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸）を含有する完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を500mlの緩衝液を調製熱不活性化ウシ胎児血清、5mlのDMEM 500mlのボトルに100Xペニシリン - ストレプトマイシンおよび100X HEPES緩衝液の各々の。この試薬は4℃で保存することができます76;ヶ月間C。
2. 完全DMEM500μlの最終体積で48ウェル組織培養プレート中のウェル当たりの種子2.5×10 ⁴のVero E6細胞。 10〜18時間、5％CO _2を含む加湿インキュベーター中、37℃でプレートをインキュベートします。
   1. 終業時にプレートをシード。いずれかの複製または三連のウェル中の各ウイルスのサンプルをテストします。
      注：このアッセイのために48ウェルベースの​​プラットフォームが記載されているが、96または384ウェルプレート中でダウン使用するためのアッセイをスケーリングすることが可能であるべきです。

2.ウイルスの細胞アタッチメントを行います

注：このプロトコルで使用されるウイルス、JUNV株率直＃1（C＃1）は、成功しJUNV病²⁹の予防のための弱毒生ワクチンとして使用されてきました。 JUNV C＃1は、in vivoおよびin vitroの両方でシリアル通路を通って病原性JUNV株XJに由来し、12個のアミノ酸³⁰による親XJ株と異なりました。 Becaus＃1は、バイオセーフティーレベル（BSL）-2-定格病原体である電子JUNV Cは、このセクションの説明作業は、適切なBSL-2プラクティス^31を使用して行わなければなりません。これは、個人用保護具（ 例えば眼の保護、白衣、二重手袋）、クラスIIバイオセーフティキャビネットの使用を含む、すべての職員が制度的訓練と安全にこの生物を処理するために必要な承認を受けていることを保証します。

1. 希望のPFUにテストされるJUNV C＃1のサンプル（複数可）を希釈するか、氷冷完全DMEMに形成単位を集中し、各ウェルに追加する直前まで、氷上で保存します。
   注：完全DMEMで希釈したウイルスとの結合試験を実施する代わりに、低血清濃度（2％）、血清がウイルスの添付ファイルとの干渉を引き起こす可能性があるかどうかを確立するために、適切な緩衝液を用いてPBSを含む最小培地を使用しています。代替ウイルスの同様の添付ファイルプロトコルはbicarboないRPMI 1640培地を使用することを報告しています0.2％ウシ血清アルブミン、10mMの（2-（モルホリノ）エタンスルホン酸）、および10mM HEPES、pH6.8の^32を含むネイト。この結合のメディアは、メディアがインキュベーターのCO ₂ -environmentから削除されたときに発生する可能性のpHの変化を防ぐために優れていることがあります。
   1. 非生産添付イベントを制限するために、200から2000までの範囲のPFUでウェルを接種します。 図2に示すように、このアッセイは、わずか20 PFU（又は多くの^6×10 2 PFUなど）を使用して添付ファイルを検出することができます。
   2. 細胞に接種するためのウイルスのマスターミックスを作成します。各ウイルスサンプルは、ウェルあたり50μlの容量で二連のウェルに接種されます。したがって、ウェルあたりのウイルス2000のPFUの添加が望まれる場合には、氷の120μlの総容積に4800のPFUを希釈DMEMを完了コールド。
      1. アッセイの特異性を制御するために、いずれかTfR1（TRVb）またはEXPを発現しないチャイニーズハムスター卵巣細胞株のペアを使用しRESS hTfR1（TRVb-1）これらの細胞にJUNVの添付ファイルとしてはどちらか減少かどうか、それぞれ^13,33れるべきです。また、アレナウイルス添付ファイル³⁴またはエントリ^35を防止するために、このようなプロテイナーゼKなどのプロテアーゼで細胞を処理します。可溶性hTfR1またはhTfR1に特異的でありするモノクローナル抗体のch128.1は、また、それらが細胞^13,36へJUNVの侵入を阻止することが知られているとみなすことができます。さらに、遊離マンノース¹⁴またはJUNV特異的中和抗体³⁷を有する粒子のインキュベーションによる細胞の前処理は、ウイルス侵入を阻害することができます。
      2. しかし、これらの後者の試薬とアプローチすることを、JUNVエントリを遮断するにもかかわらず、これは可能性の高い説明であるが、添付ファイルをブロックすることが確認されていないのでご注意ください。ここで説明するプロトコルは、形式的に、これらの様々なアプローチの衝撃ビリオン付着するかどうかを決定するために使用することができます。
2. 37℃のインキュベーターからプレートを取り外し、4℃の冷蔵庫中またはエンドサイトーシスを行うためにプレートされた細胞の能力を阻害するために15分間氷上に置きどちら。
3. 次に、各ウェルから完全DMEMを吸引し、急速に氷冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）pH7.4の100μlのを使用して二回各ウェルを洗浄します。その後、適切なウェルに（ステップ2.1で調製した）前希釈したウイルスサンプルの50μlを添加します。
4. プラスチックラップでプレートを包み、すぐにウイルス添付ファイルが発生することを可能にするために1.5時間に1のために戻って氷の上または4℃の冷蔵庫内にどちらかに配置します。このステップを通して4℃で冷緩衝液を洗浄、プレートを維持し、ウイルスサンプル。
5. 4℃でのインキュベーションの終了後、ウイル​​ス接種物を吸引し、氷冷したPBS200μlで各ウェルを3回洗浄します。

3.ウイルスRNA抽出

1. JUNVのC＃からウイルスRNAを精製市販のキット（ 例えば 、RNeasyミニキット）を用いて、単層に付着した1粒子アコー製造業者のプロトコルに鼎。具体的には、以下のとおり変更とのRNeasy Miniプロトコール（ ^第 4版、2006年4月）内のページ23-28の「スピン技術のプロトコルを用いて動物細胞からの全RNAの精製」に従ってください。
   1. 溶解を各ウェルに直接溶解緩衝液RLT350μlのを追加することにより、ステップ1（b）に指示されるように細胞が。細胞溶解を確実にするために、バッファを数回混合します。細胞は簡単にこのバッファに溶解し、完全な溶解が倒立顕微鏡下で井戸を見ることによって確認することができることに注意してください。
   2. キットカラム（ステップ3a）に得られた細胞溶解液を移し、記載されているように、プロトコルの残りの部分に従います。プロトコルの残りのステップは、クラスIIバイオセーフティキャビネットの外で行うことができますので、この時点では、ウイルスは、溶解緩衝液によって中和されたキット管が感染性ウイルスで汚染されていなかった提供。
   3. ADDITある製造業者のプロトコルから任意のステップ9を含み、Buffer RPEのキャリーオーバーの可能性を排除するためのスピンカラムのional遠心分離。
   4. 最後のステップでは、製造業者のプロトコール（ステップ10）は、ヌクレアーゼフリーのddH ₂ O30μlのを使用してスピンカラムから精製されたRNAを溶出しますこの時点で-80℃で保存RNAまたは定量RT-PCRアッセイで直接使用します。ヌクレアーゼによって精製されたウイルスRNAサンプルの分解を防止するために、ヌクレアーゼフリーの試薬および機器を使用し、氷上で解凍したRNAサンプルを保ちます。
      注：バッファーRLTとRW1はグアニジン塩を含んでいる漂白剤と混合しないでください。 Buffer RW1は、エタノールが含まれています。

4.ウイルスゲノムの定量RT-PCR測定

1. その後の定量PCR用のcDNAにJUNV C＃1 SセグメントRNAを変換するには、総容量50μlでRTに（ステップ3.1.4で生成された）ウイルスRNAを施します。
   1. ヌクレアーゼの6.75μlの：RT反応を設定するには、最初の反応あたり以下の試薬のそれぞれを含むマスターミックスを作成フリーのddH ₂ O、SセグメントゲノムRNAのNPの領域に相補的である2075-へRTプライマーS 2098-2μMの株式の5μlの（5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '）、5μlの10X PCR緩衝液II、25のMgCl ₂溶液、RT酵素の1.25μlの（62.5単位）、RNaseインヒビターの1μL（0.4単位）、およびdNTPの500μMのストックの10μlを11μlの。
      注：アレナウイルス複製の過程で、4ウイルスSセグメントRNA種が生成されます。完全長ゲノムRNA（vRNAの）、全長アンチゲノムRNA（vcRNA）（つまり、vRNAのの逆相補体である）、および2つのサブゲノムmRNAをそれぞれ、NPおよびGP遺伝子をコードします。ここに記載されているRTプライマーはSセグメントのvRNAはなく、vcRNA、NPのmRNA、またはGPのmRNAに特異的です。
   2. ゆっくりRTマスターミックスを混合し、次いで、個々の0.2ミリリットルのPCRチューブに40μlずつ分注し。各チューブにウイルスRNAを10μlを加えます。含めるⅰ）鋳型なしコントロールチューブ（ 例えば 、。ヌクレアーゼフリーのddH ₂ O 40にマスターミックスのμL）およびii）無RT酵素制御10μlのを（ 例えば受信しなかったマスターミックスの40μlに知られている陽性ウイルスRNAサンプルの10μlを添加する追加ウイルスの標的配列を含む増幅されたDNAを用いたRT試薬の汚染をスクリーニングするための任意のRT酵素）。細胞RNAの存在下でのアッセイ特異性を制御するための完全なRTマスターミックスと非感染細胞から抽出したRNAを含みます。
   3. また、RT試薬の品質を検証するための完全マスターミックスに知られている陽性ウイルスRNAサンプルが含まれます。必要であれば、RT反応の体積は25μlに減少させることができることに留意されたいです。
2. 5分間、10分間、30分間、48°C、95°C、25°C以下のサイクリング条件をRT管を施します。サンプルは4℃のステップを追加することで、この時点では、-20℃で保存するか、またはサーモサイクラー中で一晩放置することができることに注意してください。
3. P総量25μlでerform定量PCR。
   1. 以下を組み合わせることにより、定量PCRマスターミックスを行います。各の（9μM株式の）2.5μlのフォワードPCRプライマーS1937 +（5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 '）を1958+と1982にPCRプライマーS 2001-を逆にする（5 qPCRプローブS 1960+の「-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3 '）、2μM株式の2.5μlの（）1975+（5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'）、および2Xユニバーサル定量PCRマスター12.5μlのミックス。 JUNV C＃1に特異的である、ここで報告されたフォワードプライマーは、ntの病原性JUNV株ロメロを対象とし、元々報告プライマー配列³⁸から1によって異なることに注意してください。
   2. 溶液を穏やかに混合し、次いで、各ウェルのqPCRに20μlを添加します。適切な定量PCRウェルに各RT反応の5μlを添加します。試験した各サンプルについて3回定量PCRを実施します。必要に応じてPCR反応容積は、わずか12.5μlに減少させることができることに注意してください。
      注：関連付けられているソフトウェア定量PCRマシンは、定量PCRプライマーの標的であるJUNV C＃1 NP遺伝子をコードするプラスミドの標準希釈系列に各未知試料の値とを比較することにより、JUNV C＃1 SセグメントゲノムRNAの絶対的なコピー数を生成しますおよびプローブセット。定量PCRアッセイは、標準曲線の範囲内に入る値の定量化を提供することができます。 5、50、×10 ³ 5、5×10 ^{5、5×10 7}コピーウェルあたり：このため、以下の（三連のウェル中）プラスミドの量が含まれます。
4. 1分15秒、60℃で10分間および95℃での40サイクル：95℃サーモサイクラーに定量PCRプレートをロードし、以下の反応条件を実行します。
   1. 製造業者のプロトコールに従って、各試料中のウイルスRNAの存在量を決定するためにデータを収集し、分析します。
5. 定量PCRタールを含むプラスミドの新たに精製されたサンプルを使用して標準曲線を確立するために、シーケンスを取得し、最初にこの溶液中でのプラスミドのコピー数を決定します。
   1. プラスミドの分子量を計算します。プラスミド全体の配列が知られている場合は、以下の式を使用して、これを計算する：MW =（[A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13）。二本鎖プラスミドの各鎖上に見出される特定のヌクレオチドの合計数を含めることを忘れないでください。
   2. プラスミドのサイズは知られているが、その正確な配列がない場合、各二本鎖DNAの塩基対は、600のMWを有するという仮定の下でMWを計算します。
      注意：ここで使用したpCAGGS-JUNV C＃1 NPプラスミドは、4.2×10 ⁶のMWを持っています。
   3. プラスミドのMWが決定されると、1μl当たりどのように多くのコピーを計算ストックプラスミド溶液中に存在します。
   4. 最初のx 1 6.9その後、プラスミドの69μgのは、300μlの水に含まれている場合は、プラスミド（ 例えばのモル数にこれを変換した後、溶液中でのプラスミドの合計μgのを計算コピー数に変換することができるプラスミド* 1モルの0 ^-5グラム/プラスミドの4.2×10 ^6グラム =プラスミドの1.6×10 ^-11モル）、（ 例えば、プラスミドの1.6×10 ^-11モル* 6.022×10 ²³分子/モル= 9.8×10 ¹²分子（またはコピー））。
   5. 1μl当たりのコピーを取得するために、その溶液の容積によってプラスミド溶液中のプラスミドの総コピーを分割し（ 例えば 9.8×10 ¹²コピー/300μlの= 3.28×10 ¹⁰コピー）。
   6. 5μlの容積は、標準曲線を確立するために必要なコピー数の範囲を提供するために、PCRプレートにロードすることができるように、適切にこの溶液を希釈します。

プロトコルの第4節で説明したように定量PCRアッセイの感度とダイナミックレンジを実証するために、JUNV C＃1（範囲5-5×10 7コピー）のNP遺伝子をコードするプラスミドの既知量を定量PCRに供しました。アッセイは敏感であり、確実に標的核酸の5コピー（ 図2）のようにいくつか検出することができます。さらに、アッセイのダイナミックレンジが大きく、 図2に示すように、テンプレートの少なくとも7ログを覆うことができます。図示していないが、我々は、核酸のような多くの9×10 5のようなコピーを検出しました。

プロトコールに記載されるようにJUNV C＃1粒子付着を測定するためのアッセイの有用性を例示するために、JUNV C＃1の様々な量は、ベロE6細胞に予め結合させました。未結合粒子を洗浄した後、細胞をRNA精製のために溶解し、得られたRNA試料を定量RTに供しました-PCR。 図3に示すように 、このアッセイは、わずか20として、またはそれぞれ0.0004及び40ののMOIに変換などの多くの10×2として6 PFUを用いてウイルス添付イベントを検出することができます。

図4に示されるように 、それだけでなく、ウイルス付着でなく、時間をかけて受信ウイルス粒子中に含まれるゲノムの増幅率を測定するためのプロトコルを変更することが可能です。この修正されたアプローチは、ウイルス侵入（ 例えば、粒子のエンドサイトーシスおよび/ ​​または融合および細胞質へのウイルスゲノムの放出）の残りのステップにおけるさらなる欠陥が発生する可能性があるかどうかを決定するための代用として使用することができます。興味深いことに、ウイルスゲノムの量が入ってくるウイルスゲノムの一部が劣化することを示唆している最初の6時間以下の添付ファイル、中に減少すると思われます。これは、細胞内に取り込まれるときにエラーが発生する粒子に起こるとextracellに低下する可能性がありますエンドリソソームネットワーク内の劣化によるおそらくウラルスペースか。示したデータは、12または18時間後に感染がアクティブなゲノム複製をスクリーニングするために最適な時間になることを示しています。

図1：プロトコル・ワークフローの描写ウイルス-細胞付着アッセイの主要なステップは1）4℃で細胞とウイルス粒子のインキュベーションは、未結合のウイルスを除去するために、ウイルスの細胞付着が洗浄に続いて起こることができるようになっている、2）精製細胞からのウイルスRNAの、3）逆転写（RT）をcDNAにJUNV SセグメントゲノムRNA（vRNAのを）変換する、および4）定量PCRは、ウイルスの細胞付着の尺度としてJUNV SのvRNAのコピーを列挙する。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。

図3：JUNV-細胞付着アッセイ確実に措置20 PFU、わずかとして使用して、粒子の付着。ベロE6細胞をJUNV C＃1の既知量と予め結合した（2×10 1、×10 2 2、2×10 3、2×10 4、×10 5、または2 2 ×10 6 PFU）4℃で1.5時間。結合していない粒子を洗浄により除去し、細胞をRNA抽出のために溶解し、得られたRNAサンプルを、ベロE6細胞への粒子付着の測度としてJUNV C＃1 SセグメントのvRNAを検出するためのqRT-PCRに供しました。データは、平均±SEM重複ウェルからウェルあたりの平均コピー数を表します。

図4：感染後のJUNV C＃1ゲノムの複製の速度論ベロE6細胞を、4℃で1.5時間JUNV C＃1の2×10 3 PFU（0.04のMOI）と共にインキュベートしました。氷冷PBSで数回洗浄後、細胞は、直ちに回収した（0時間の時点）またはコレクションの前に示された時間のために37℃に温めました。それぞれの場合において、総RNAを細胞から抽出し、JUNV C＃1 SセグメントのvRNAを検出するための定量RT-PCRを行いました。値は平均±SEM二連のウェルからウェル当たり、平均コピーを一覧表示されます。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。