これは、従来のバイオセーフティキャビネットとインキュベーターに取って代わり、最大の無菌性と再現性を可能にする密閉型細胞培養システムで多能性幹細胞(PSC)と神経幹細胞(NSC)を増殖させるプロトコルです。この装置は、臨床適正製造基準(cGMP)および臨床適正ラボ基準(cGLP)のガイドラインを満たしています。
この記事について
サマリー
要約
この論文は、基礎研究と前臨床研究のために、カスタムメイドの市販の閉鎖型細胞培養システムの使用方法を説明しています。バイオセーフティキャビネット(BSC)とインキュベーターは、基礎研究および前臨床研究のための細胞株の培養と拡大の標準と長年にわたりなってきました。しかし、多くの幹細胞研究室の焦点が基礎研究から臨床応用に移るにつれて、細胞培養システムには追加の要件が必要になります。すべてのプロセスは十分に文書化され、無菌性と再現性に関する優れた要件を備えている必要があります。従来のインキュベーターでは、給餌、継代、またはその他の操作のために細胞が取り出されるたびに、ガス濃度と温度が大きく変動します。このような中断は、cGMPおよびGLPガイドラインの標準ではない環境の一因となります。これらの中断は、特に細胞が治療目的に利用される場合に最小限に抑える必要があります。標準的なBSCおよびインキュベーターシステムからクローズドシステムに移行する動機は、そのような中断を無視できるからです。クローズドシステムは、細胞培養物を供給および操作し、温度とガス濃度が一定である制御された環境で細胞培養を維持するための作業スペースを提供します。このようにして、多能性幹細胞と多能性幹細胞は、その派生の瞬間から最終的に治療に使用されるまで、最適な健康状態を維持することができます。
概要
標準的な幹細胞培養技術は、細胞に過度のストレスを与え、細胞を許容できない汚染リスクにさらすいくつかの環境制約に苦しんでいます。標準的な細胞培養条件下で細胞が耐える可能性のあるストレスの中には、二酸化炭素と酸素濃度の急激な変化があります3,4。これは、細胞がインキュベーターからバイオセーフティキャビネットや顕微鏡に移動されたときに発生しますが、これは細胞にとって最適ではない可能性があります。以前の研究では、多能性幹細胞と神経幹細胞の両方を低酸素状態で培養することの利点が確認されており4,11、最良の結果を得るためには、これらの条件が連続的である必要がある。さらに、細胞の培養と操作のほぼすべての段階で、実験室の環境と人員が細胞に影響を与えるため、細胞汚染のリスクが高くなります。従来のクリーンルームは、汚染リスクを大幅に低減する効果的な方法の1つですが、高価で設置面積が大きく、二酸化炭素や酸素濃度に関連するストレス要因に対処できていません。
汚染リスクとガス濃度の両方に対処することができ、cGMP基準9を満たす資格を持つ細胞生産施設は、基礎科学研究だけでなく、臨床応用にも高品質の細胞を提供します1,6,7。このような細胞生産施設は、少なくとも、以下の構成要素からなる:細胞培養の供給および操作のための加熱作業スペースとして機能するプロセスチャンバー;試薬、チューブ、およびツールの初期滅菌用の層流フード。フードとプロセスチャンバーの間に2つの緩衝エアロックチャンバー。プロセスチャンバーからアクセス可能な2つの細胞培養インキュベーター。プロセスチャンバーに隣接する顕微鏡チャンバーと、そして最後に、これらのモジュール内の条件を設定および監視するためのコンピューターソフトウェア。この基本インフラを利用することで、多能性幹細胞や多能性神経幹細胞の標準的な摂食・継代などの手法から、センダイウイルスによるリプログラミング、in vitro遊走研究、神経幹細胞の分化による電気生理学的特性評価など、より専門的な手法まで、さまざまな作業を行うことができます。
プロトコル
1.初期セットアップ
- ガスや温度濃度を設定します
- ソフトウェアを使用して、グラフィカルなインターフェイスの左上隅に位置する「ゲスト」タブをクリックします。指定されたユーザ名とパスワードを使用してシステムにログインします。各ユーザーは自分のユーザー名とパスワードを持っていることを確認してください。
- （ 図1）を調整するために、モジュールをクリックします。現在の設定を表示する新しいウィンドウ内に、「セットポイント」は、以下の既存のO 2セットポイント値をクリックして、このモジュールに必要なO 2濃度レベルを入力します。神経幹細胞が増殖または操作する場合は、O 2を多能性幹細胞が増殖またはこのモジュールで操作する場合は、5％のO 2を入力して 、9％。セットポイントを確認するために、緑色のチェックマークをクリックします。
注：層流フード、顕微鏡室：二つのモジュールは、ガス調整できません。層流フード内でガス濃度が大気圧whilあります電子顕微鏡チャンバ内のものは、受動的に、処理チャンバ内のガス濃度によって維持されます。 - CO 2は、O 2のための唯一の調整可能なバッファ室を除き、すべてのモジュールに対して、5％CO 2のセットポイントを入力するために、この手順を繰り返します。
- 彼らは新しいセットポイントに達することを確認するために、「プロセス値」としてラベル付けされている現在のガス濃度を監視します。
- 適切な値にすべてのモジュールのガスセットポイントを調整します。お互いにさらされるチャンバのCO 2とO 2のレベルと一致しています。例えば、また、5％O 2、この時間の間にプロセスチャンバへアイテムを追加するために使用される任意のバッファ室に合わせ、5％O 2で細胞を増殖する培養器を開く前に、5％O 2の処理チャンバを調整します。
- ガス調整の同じ画面を使用して37℃まで処理室の温度を設定します。また、処理室Fを設定します37°Cにloor温度。
- 各インキュベータの下インキュベーションモジュールのバンクをクリックします。 37℃に銀行の温度を調整します。
- バッファチャンバの動作
- 作業の流れの遅延を防止するために、初めに与えられたタスク（送り、分割、染色など ）に必要なすべての電源を収集します。たっぷり70％エタノールですべての材料をスプレーし、それらを層状フード内で乾燥させます。細胞のフラスコまたはプレートをスプレーしないでください - 70％エタノールで飽和滅菌ガーゼスポンジで軽くふき取ってください。
- バッファ室の外側と内側のドアが確実に閉じているの両方を確認してください。その後、外部のドアを開け、中のアイテムを配置します。
- 外側のドアを閉じます。ソフトウェア内では、バッファモジュールを選択し、希釈倍率]タブをクリックします。ログ要因ボックスに1を入力します。開始]をクリックします。
注：「希釈因子」を意味するように定義されるバッファモジュールの雰囲気意志排気し、クリーン、HEPAろ過ガスで1時間を交換すること。 - グラフィカル・インターフェースは、「希釈率」を点滅を停止した後、バッファチャンバの内側の扉を開いて、プロセスチャンバ内の材料をもたらします。
注意：これまでに、内側と外側のドアが同時に開くことはできませんし、バッファ室は、希釈係数を受けていない場合は内扉を開けないでください。 - プロセスチャンバから項目を除去するために、第一バッファチャンバは希釈係数を受けたことを確認。そして、内側のドアを開けて内部削除するアイテムを配置し、内側のドアを閉めます。次に、外側のドアを開けてアイテムを削除します。
注：希釈係数は、外側のドアを開ける前に実行する必要はありません。
2.細胞を紹介し、摂食
- インキュベーターのセットアップ
- 各培養器の底に水パンの3ペトリ皿を置きます。 sterilでこれらの料理を埋めます電子水。直接水パンを記入しないでください。それらはインキュベータ内の相対湿度（RH）設定点を維持するために重要であるため、これらの皿の水のレベルを維持します。
- グラフィカルインターフェイス内では、インキュベーターをクリックしてください。セットポイントの下の相対湿度（RH）の既存の値をクリックして、85％を入力してください。この値を受け入れるように緑色のチェックマークをクリックします。
- 電池用セル生産設備の製造
- まだ行っていない場合は、バッファチャンバ、プロセスチャンバ、および導入された細胞のタイプに必要なガスのセットポイントへのインキュベーターを調整します。
- 滅菌ガーゼと非可燃性の消毒剤でプロセスチャンバの表面を清掃してください。強力なクローズドシステムのように、任意の過酢酸系の消毒剤は使用しないでください、長引く蒸気は、哺乳動物細胞に対して毒性です。その代わりに、塩化ベンザルコニウムベースの製品を使用しています。
- 消毒続けます。 Commoある手袋、表面をきれいにしてくださいNLYようなドアハンドルとして、触れました。プロセスチャンバ内の過剰な液体は、湿度、結露し、可能な微生物の成長に貢献するよう、徹底的しかし控えめに消毒剤を使用してください。
- 層流フードの表面を洗浄し、70％エタノールでチャンバをバッファし、それを乾燥させます。フード内で（私たちの場合は、のPSCまたはNSCの）細胞のフラスコやプレートを置き、簡単にエタノールで飽和し、滅菌ガーゼスポンジで、その外面を拭いてください。
- バッファ室でフラスコやプレートを入れて、希釈係数（ステップ1.2.3）を実行します。
- 希釈係数が完了すると、直ちにフラスコを移動したり、適切なインキュベーターにプレート。インキュベーターは、プロセスチャンバの背面にあるように、セル配置のためのプロセスチャンバ内に棚を引き出します。プロセスチャンバの空気はインキュベーターのそれに比べて非常に乾燥しており、かつ重要なことになりますように、不必要または長時間培養器のドアを開けないでくださいインキュベーター内の湿度の損失。
- 細胞培養を摂食
- 培地成分、血清学的ピペット、電子ピペッター、ガーゼや消毒剤を収集します。また費やした細胞培養培地のための廃棄物容器を収集しますが、漂白剤とそれを記入しません。 1.2節で説明したようにバッファ室を介してプロセスチャンバ内に材料を持参してください。前述のように、プロセスチャンバ内で細胞培養培地を調製9,10（また、 材料表を参照されたいです）
- 最適な作業スペースを有効にするような方法で材料を配置します。プロセスチャンバの中心に使用されていない項目を配置しないでください。
- わずかにキャップされていないメディアコンテナを残すことにより、システム内に存在するCO 2とO 2のレベルと平衡するための媒体を可能にします。いくつかのPSCメディアのメーカーは37ºCでメディアを暖めるない示しています。このような場合には、培地を平衡化するためにバッファ室を使用しています。私を許可します20分間平衡化するdium。
- 適切な立体ピペットおよび電子ピペッターを用いて、ウェルから古い培地を除去します。 PSCの場合は、給紙プロセスの間に乾燥を防ぐのに十分なすべてが、古いメディアの小さな残量を、削除します。 NSCのために、古い培地の半分を削除します。ピペット廃棄物容器に廃棄物。
- 元の包装に戻し使用するピペットを置き、プロセスチャンバの側に移動するか、廃棄物の除去のために指定されたバッファ室へ。新鮮な無菌の血清学的ピペットを用いて、培養プレートを細胞とその指定のインキュベーターに戻し、プレートを配置する新鮮な培地を追加します。
- 消毒剤で送り、スプレーガーゼの終わりに、徹底的にプロセスチャンバの床とドアハンドルを清掃してください。システム内で成長された複数の細胞株が存在する場合、それぞれの細胞株の供給の間に滅菌します。これは、交差汚染のリスクを最小限に抑えることができます。
- 完了すると、老廃物を取り除きますバッファ室のうちの1つを介して、または他の不要なアイテム。
3.分割細胞培養
- PSCまたはNSCの酵素的継代
- 継代のために必要なすべてのアイテムを収集します。これは、メディア、酵素または非酵素的細胞解離緩衝液（後者は唯一のNSCのためのものである）、DPBS、プレートまたはフラスコ、細胞外マトリックス（ECM）、コニカルチューブ、および血清学的ピペットを含みます。バッファ室を使用してシステムにそれらを持参してください。
- 以前9,10に記載されているように ECMでコーティング新鮮なプレートまたはフラスコ、。いくつかのECMマウス肉腫細胞株由来のものとして-suchは - 4と15℃の間の液体のみであるため、加熱処理室での作業中にECMの寒さを保つために滅菌冷たいブロックまたはゲルアイスパックを使用します。
- ピペットで培養物から使用済み培地オフ、廃棄物容器に廃棄してください。
- よくDPBS /の1ミリリットルを使用して、ウェルまたはフラスコの表面を洗浄し、DPBSを処分。
- 2から1を追加します。各ウェルに暖かい酵素のミリリットル。唯一の非常に高密度培養物は、2ミリリットルを必要とします。
- すぐに顕微鏡室に培養皿またはフラスコを移動し、慎重に文化を観察します。皿をオフ緩め始めて個々の細胞の兆候を監視します。細胞は、次のステップに進む前に懸濁液に浮くまで待ってはいけません。
- メインプロセスチャンバに細胞を返します。 5ミリリットル血清学的ピペットを用いて、酵素の各1ミリリットルのためにDPBSの4ミリリットルを追加し、強制的にウェル表面から細胞を取り除くために、上下にピペットと。多層板内の複数のウェルを継代した場合、十分に個々のウェルから細胞を取り除く前に、それぞれにDPBSを追加します。
- 適切なサイズのコニカルチューブに酵素とPBS細胞懸濁液を転送します。
- 遠心分離機は、セル生産設備で使用できない場合は、しっかりと、円錐管を密閉バッファ室に置き、ドアが閉じて密封します。
- BUFからコニカルチューブを削除します層流側からチャンバFER、室温で5分間、100×gで細胞をスピン。
- 70％エタノールでコニカルチューブスプレー、バッファチャンバと希釈係数を使用してプロセスチャンバにそれをもたらします。
- 上清オフピペット、およびPSCまたはNSC培地2mlで細胞を再懸濁します。 PSCを継代した場合、以前は9,10に記載されているように 、10μMの濃度で培地にROCK阻害剤を含めるようにしてください。
- 血球計数器を用いて細胞をカウントし、必要な井戸またはプレートの数を決定します。プレートのPSC 5×10で4から1×10 5細胞/ cm 2。 2：1の比率でのNSCを分割します。
注意：NSCは、多くの場合、血球計で正確なカウントを凝集し、抵抗します。 - 細胞の凍結保存が必要な場合は、適切なプロトコル9,10に従いますが、すべての電源および凍結メディアは予め用意し、プロセスチャンバの内部に配置されていることを確認してください。 DMSOは37で、細胞に対して毒性が非常に強いです6; Cは、そのように非常に迅速に働きます。層流フード内で室温でイソプロパノールジャケット冷凍コンテナを保管してください。凍結保存バイアルを充填密封されたら、すぐにバッファ室を介してそれらを渡すことによって、プロセスチャンバからバイアルを取り外します。
- PSCのマニュアル継代
- 文化は以前に8に記載されているように 、継代する必要があることを確認してください。もしそうであれば、細胞外マトリックスでコーティングされた新鮮なプレートまたはフラスコを準備します。その後、完全培地を変更します。
- スペアリング量不燃性消毒剤で湿らせた滅菌ガーゼで顕微鏡室をクリーニングします - あまりにも多くのチャンバ内の過剰曇りになります。唯一の手袋、床面積、およびステージをきれいに。チャンバー内にいくつかの200μlあるいは千μlの個別包装ピペットチップを持参してください。
- 、顕微鏡室へのPSCのプレートを持参ふたを削除し、それが新鮮に清掃床に伏せて置きます。蓋アップのままにすると、下ディレクトリを公開します空気の流れに、および潜在的な汚染にectly。
- ピペットチップのラップを解除し、文化を視覚化する顕微鏡を用いて、ピペットの先端を使用して、良好な形態を有するコロニーを離れて選びます。
注：個々のユーザーが、これはより快適に見つかった場合ピペットチップは、ピペットに取り付けることができます。 - プレートに蓋を取り付け、バックプロセスチャンバにプレートを移動させます。
- 新しいプレートから過剰なECMオフピペット、および新しいプレートに旧版（懸濁液中のコロニー片を含む）からメディアを転送します。旧版はまだピックアップする準備ができていないコロニーが含まれている場合は、同様にそれを養います。
4.特殊培養の技術
- PSCへの線維芽細胞の仙台伝達
- セル生産設備の中で、5％のO 2で、DMEM / F12、10％のFBS、および20 ng / mlのFGF2を含む線維芽細胞培地中のヒト皮膚線維芽細胞1を展開します。 6ウェル培養disheを使用します0.1％ゼラチンでコーティングしました。■。
- 調製した細胞を0.25％トリプシン1mlでそれらを解離ウェルあたりにより形質導入されます。 1ミリリットル線維芽細胞培地でトリプシンを不活性化します。 200×gでスピンは、線維芽細胞培地1mlに細胞を再懸濁し、血球計数器を使用してそれらを数えます。
- 再懸 濁2.0×10 5 2ミリリットルの線維芽細胞の培地中の細胞、およびゼラチンでコーティングした6ウェルプレート（2.1×10 4細胞/ cm 2）の1ウェルに細胞懸濁液を追加します。インキュベーターで細胞を元に戻します。
- 細胞はプレートの底に付着するための24時間を許可します。
- プロセスチャンバ内の新鮮な線維芽細胞培地（形質導入される細胞のウェル当たり培地1ml）を配置し、それがガスに平衡化することを可能にします。
- 70％エタノールで予め冷却したコールドブロックを滅菌し、バッファ室に置き。商業冷たいブロックが使用できない場合は、それにカット穴を有するゲルアイスパックを使用してください。
注：あり3から4の別々仙台ウイルス（形質導入キットのバージョンに応じて）、急速に解凍が、一度解凍コールドブロックに保管されなければなりません。 - 15秒間37℃の水浴中でチューブの下半分を浸し（チューブ水没しない）、その直後に70％エタノールでチューブの外装を清掃してください。バッファ室で滅菌コールドブロックにチューブを配置し、希釈係数を実行します。
- すぐに作業を、平衡化した媒体2にそれぞれ仙台の再プログラミングウイルスの必要なボリュームを追加。細胞の数を、各ウイルスの力価は、各ウイルスについて感染の所望多重 - このボリュームは、3つの変数によって決定されます。推奨MOIのためのキットのマニュアルを参照してください。式は次のとおりです。
ウイルスμLの必要[（トランスフェクトされた細胞の数）（感染の多重度）（千）] /（ウイルス力価）= - 再プログラムされるセルのウェル（複数可）からの上清を取り除きます。各ウェルについて、メディの1ミリリットルを追加ウムウイルスを含みます。静かにメディアをこぼさないように注意しながら、プレートを揺らし、バック5％O 2インキュベーターでプレートを置きます。
- 2時間後、静かに再びプレートを揺らし、さらに2時間後に再度繰り返します。
- 24時間（1日後の形質導入）の後、多能性幹細胞培地1mlでよくフィード。 2日目に繰り返しますが、ウェルから培地を除去しないでください。
- 3日目と4日、培地の半分を変更します。
- 5日目以降では、媒体全体を変更します。
- コロニーが出現すると、以前に2説明したように、コロニーが多能性確かにあることを確認するために、無菌の抗体を用いて培養を染色。細胞を供給する場合と同様に、抗体を含有するPSCメディアがセル生産設備においてガスに平衡化されていることを確認してください。
注：成功した再プログラミングでは、IPSCのコロニーは約2週間伝達1の後に存在すべきです。 - コロニーは、大きな成長しているとき3.2節で説明したように十分な、ECMコートプレート上にそれらをマークし、機械的に通過するために顕微鏡を使用しています。
- 以前9,10に記載されているように 、手動または酵素的にコロニーを展開します。
5.クリーンアップした後、日常の使用
- 無菌バッファチャンバ内に、液体廃棄物のフラスコを含め、すべての廃棄物を置きます。処理室の表面と滅菌ガーゼと非可燃性の消毒剤の供給により接触しているすべての領域を拭いてください。
- バッファ室からすべての固形廃棄物を削除し、適切な廃棄容器に廃棄します。
- 適切な廃棄物容器内の液体廃棄物を捨てて、あるいは単に漂白剤と混合し、ドレインを下に注ぎます。石鹸とブラシで廃棄物容器を清掃してください。 70％エタノールで容器を殺菌し、バッファチャンバを介して処理チャンバに戻します。
注：中に漂白剤を使用することは推奨されません廃棄物容器漂白ヒュームは、細胞培養物を再循環し、害を及ぼすことができるように、それは、システム内部です。 - 衛生上の考慮事項については、70％エタノールでシステムの処理室の前面プラスチック表面を拭いてください。これは、ユーザの額から汗や皮脂をきれいに役立ちます。
- 結露は、プロセスチャンバ内に構築している場合は、結露をクリアするために希釈係数を実行します。このため、少なくとも1時間を完了させます。
6.日常非日常のタスク
- 必要に応じて滅菌蒸留水で細胞培養インキュベーター中での水の料理を補給してください。少なくとも週に一度料理を締めくくり。しかし、蒸発速度は、インキュベーターのドアは、培養物中の液体の体積を開き、インキュベータ設定される頻度に基づいて変動します。
- 月に一度、すべてのチャンバ内のO 2およびCO 2の設定を再キャリブレーション。これは、SPAN（キャリブレーション）ガス、CONTを使用する必要がAINSは、基準の標準としてO 2およびCO 2の濃度レベルを知られています。十分なSPANガス供給は、キャリブレーションを開始する前にそこにあることを確認してください。システムは、ガス濃度を検出するために、各モジュールに位置する特定のガスセンサーを使用します。このように、高品質のSPANガスの使用は、センサが確実に正確なガス濃度が得られることを保証します。
- 定期的にプロセスチャンバと顕微鏡室で手袋を交換してください。かかわらず、システムが利用される頻度の、2ヶ月ごとに手袋を交換してください。インストールの前に、消毒剤を使用して新しい手袋を消毒。手袋を交換した後、プロセスチャンバに希釈係数を実行します。
注：システムの袖口の上に伸ばしたとき、ニトリル手袋は、物理的なストレスや熱にさらされた領域に穴を開発する傾向があります。これは正常および不可避的損耗です。 - 6ヶ月ごとに全てのチャンバ内のシリンジフィルターを変更します。
- トンを交換するか、洗います彼はすぐにそれが汚れて見えるし始めると、層流フードのプレフィルタ。
- 主要部品の交換の詳細については、定期的に、製造元のドキュメントを参照してください。
システムの7.クリーニング
- 細胞培養物の大部分に影響を与える主要な汚染事象の場合には、影響を受けないインキュベーターにシステム、または（可能な場合）のうちいずれかの生存細胞培養物を移動させます。
- 影響を受けないインキュベーターのことを除いて、全てのチャンバのためのガス制御をオフにします。
- 装置の柔軟なフロントパネルを取り外して、影響を受けた細胞培養インキュベーターからステンレス製の棚を削除します。また、水の鍋を削除します。
- インキュベータの棚や水パンオートクレーブし、インキュベーターに戻し入れます。 70％エタノールでインキュベーターの内部表面を拭いてください。エタノールを蒸発させると、インキュベータのドアを閉じます。
- 70％らで処理し、顕微鏡室の表面を拭きhanol。装置のフロントパネルを交換してください。
- 非可燃性の消毒剤で、影響を受けたインキュベーターのものを含む装置の内面を、拭いてください。オープン影響を受けたインキュベーターのドアを残して、プロセスチャンバに希釈係数を実行します。顕微鏡室のドアも開いていることを確認してください。
- 細胞培養インキュベーターの定期的なクリーニングのために、インキュベーターとプロセスチャンバは、同じ大気中の設定であることを確認してください。インキュベーターの扉を開き、プロセスチャンバの表面上のすべての細胞培養皿を置きます。
- 非可燃性の消毒剤とのインキュベータの棚と内部表面を拭いてください。消毒剤を蒸発させると、バックインキュベーターに細胞培養物を移動させます。細胞培養のdessicationを避けるために、可能な限り迅速に作業してください。
結果
本稿では、いくつかの詳細にセル生産施設、クローズドシステムの内部で細胞を培養するユニークな側面について説明します。セル生産設備の大部分は、小さなフットプリントを有し、容易に6×7.5 m 2の部屋（ 図2）内に収容することができるカスタムメイドの、囲まれた、細胞培養装置を含みます。時間がない時に実験者や環境にさらさ装置内の細胞です。この装置は、複数のモジュールで構成さ：処理チャンバ、層流フード、フード処理室、二つの細胞培養インキュベーター、処理室に隣接顕微鏡室との間で2緩衝エアロックチャンバ（ 図3）。システムは、環境変数を制御および監視することを可能にするソフトウェア（ 図1）によって制御されます。このソフトウェアを実行しているコンピュータは、無停電電源装置です。ガスは番目に供給されます酸素、窒素及び二酸化炭素（ 図4）のためのマニホールドの集合によって電子システム。アクティブセットと予備セット - デバイス用のガスがタンクごとの2セットを持つマニホールドシステムによって供給されています。アクティブセットがドローダウンされた場合、マニホールドは、自動的に予備セットとスタッフの順序交換タンクに切り替わります。電源は、バックアップ発電システムです。
多能性神経幹細胞は、新規の機器に固有の追加の合併症と以前に開発されたプロトコル9を使用して、この施設で、低酸素条件下で増殖させることができます。多能性幹細胞は、次いで、単離し、拡張され、完全にトランスフェクトされたコロニーを同定するために多能性特異的抗体を用いて、センダイウイルスを使用して導出することができます。 （ 図5AおよびB）は 、これらのiPS細胞から、神経幹細胞及び神経細胞は、デュアルSMAD阻害を用いて導出することができ、それらの表現型は、USIを確認しました NG NSC特異的抗体（ 図5C及びD）。
セル生産設備については、図1のグラフィカルインタフェース。（A）CPFのグラフィカルな表現は、デフォルト画面で、（ 図1に2F） 図3。バッファモジュール1の上にマウスのクリックで示したCAD図面と一致しましたO 2の値が（ 図3の3）処理室に一致するように設定され、その制御画面（B）を開きます。同様に、プロセスチャンバまたはインキュベータ1をクリックすると、値は適宜変更または監視することができるそれぞれのコントロール画面（それぞれCおよびDを 、）、起動します。目標確認= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
セル生産設備2.図。（A）右フロントビューから見たシステム。天井に電力とガスの接続と右に顕微鏡のアクセサリーやコンピュータとカートに注意してください。 （B）右で見られるバッファモジュールへのアクセスドアを持つ層流フード。後方から見た（C）は、2つのインキュベータ（黒ドア）を有するプロセスチャンバ。 （D）システムの右側を通るビュー顕微鏡を示す距離で見られるバッファ室へのドアで監視。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
セル生産設備の図3. A CAD図面は装置に入るすべてのアイテムは最初の層流フード内で乾燥させ、アルコールと空気で拭いている（1）。アイテムはその後UCPCモジュールに渡される前にフロントバッファモジュール（2F）内の適切な雰囲気に移行、またはされているプロセスチャンバー（3）。細胞は、2つのインキュベータ（4,5）で培養します。ライブ細胞染色、コロニーピッキング、一般的な細胞形態および移行解析の評価は、UPCモジュールで行われ、または顕微鏡商工会議所（6）。最後に、廃棄物はリアバッファモジュール（2R）を介してシステムを出る。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 < / P>
ガスと電力の図4.ソース。（A）は、実験室のすべてのインキュベーターを供給するようにCO 2マニホールドは、4×4のセットアップです。 （B）O 2マニホールドは、2×2の設定のみを供給し、セル生産設備があります。システムのための窒素はまた、自動的に（左下）cryofreezersを埋める（右へ）液体窒素マニホールドに取り付けられた気化器（ちょうど終了記号以下のC、）で生成されます。マニホールドは、160 L液体窒素タンクの二対によって供給されている2×2の設定です。 CO 2、O 2、およびN 2は、閉止弁（D）を介して天井から供給されます。ハウス真空はまたこの場所で供給されます。システムに電源を供給する電源ケーブルの一対だけ供給ガスの閉止弁の背後に見られます。F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
センダイウイルスと低酸素症に派生図5.多能性幹細胞。（A）SC187-SF4-2I0-E3 iPS細胞iPS細胞（命名法のStover ら 9で見つかった）、位相コントラスト10X。 （B）SC88.1-UH1-2I0性IPSC AF-594で標識したTRA-1-60、1でライブ染色：メディアで100希釈。すべてのiPS細胞は、センダイウイルスで5％のO 2のセル生産設備に導入しました。 （C）チャンバースライドで5％O 2で成長したSC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 IPSC由来のNSCの位相コントラスト。次いで、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ヒトネスチン一次抗体で染色し、アレックス-488二次抗体ました。すべてのスケールバーは100であります1;メートルこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ディスカッション
彼らはバックチャンバを顕微鏡とする処理チャンバにインキュベーターから移動すると、CPF内で増殖した細胞は、酸素や二酸化炭素の濃度に変化は見られません。各チャンバー内の条件は、細胞をインキュベーターから削除される前にセルが保持されている特定のインキュベーターに一致していることが重要です。装置内の雰囲気は、連続的にHEPAろ過され、酸素と二酸化炭素濃度に関してはカスタマイズ可能です。細胞は、それぞれ、標準のPSCまたはNSCのための濃度は、5％と9％で成長させることができます。または代替の濃度が異なる細胞タイプまたは特定の実験のために選択することができます。したがって、この装置は、医療グレードの酸素、二酸化炭素、及び窒素（ 図4）の一定の源が供給されます。これらのガスのすべての3つは、一定の供給を確保ガス固有のマニホールドシステムによって供給されています。装置はまた、からなる校正ガス混合物が供給され酸素10％（±0.01％）、二酸化炭素。マニホールドシステムは、セル製造施設の外に収容され、ガスは、天井を介して施設にパイプされています。校正ガスは、施設内に収容されています。装置は、さらにまた、天井を通して、ハウス真空が供給されています。ユニットを送信する電子監視システム及び無線を使用して、すべてのマニホールドの出力圧力が常に監視されています。任意の圧力が範囲から外れる場合には、セル生産設備のオペレータは、自動的に電話をし、適切な処置をとることができるよう通知されます。
装置の電力要件は、6つの専用の120 V回路天井から下降し、一定の供給を確保するために、病院のバックアップ発電機に接続することによって満たされます。装置の動作は、無停電電源装置から給電PCベースのコンピュータにソフトウェアを介して制御されます。これらの電源とコンピュータの手配でも公共の電源システムに障害が発生した場合に継続的にシステム関数ことを確認してください。装置を制御するソフトウェアは、酸素と二酸化炭素濃度の制御、ならびに温度、湿度、及びチャンバ圧力を可能にするユーザーフレンドリーなグラフィカル・インターフェース（ 図1）を有しています。すべてのこれらのパラメータの値は、連続的に、すべての装置パラメータの実行記録を提供するために記録されています。このデータは、それらの完全性を保護するために毎晩、リモートサーバー上にバックアップされます。コンピュータとソフトウェアが評価および/または任意のパラメータを変更するには、管理ユーザーがリモートでアクセスすることができます。また、コンピュータとソフトウェアは、装置パラメータの対話的な評価を可能にし、ローカルユーザーとトラブルシューティング、リモートからアクセスすることができます。追加の警報送信ユニットを装置に接続されたセル生産設備のオペレータは装置の任意の範囲外の状態が通知されるように。リモートアクセスCapabilitiesは、ログインして範囲外の状態を具体的に評価することができます。
装置は、モジュラーシステムの両方マクロとミクロの意味で設計されています。このようなインキュベータや処理室のような個々の細胞培養モジュールは、互いに対してそれらの寸法および要件に関して、ならびにそれらのレイアウトにカスタマイズすることができます。さらに、個々のモジュールの制御機能の多くは、それ自体は、モジュール、そのような個々の雰囲気ガスコントローラは、例えば、容易にシステムに重大な影響を与えることなく交換することができることです。
そのような細胞培養物の顕微鏡可視化および操作のための1つのような特殊な処理チャンバは、容易にシステムに適合されます。細胞は生きて染色することができ、そしてコロニーをt内部同じ大気条件に切開することができるように、位相差および蛍光顕微鏡の両方がシステム（ 図6）内にあります彼はインキュベーター。処理室の側壁で密封されたグロメットを介して、ケーブルの配線は、通常はカート（ 図6）に、このような電源やコンピュータなどの機器は、装置の外に保つことができます。
セル生産設備内の処理室は、従来のBSCとは異なる空気流パターンを有します。従来のBSCで、空気の流れは、中央排気口から流下した後、キャビネットの床の前方及び後方部分に二つの異なる吸気口によって取り込まれている2つの別々の流れ、に分かれます。これとは対照的に、CPFは、天井の前方部分で単一の通気口があります。空気が下向きにし、それがその後、吸気口の中に上向きに描かれている室の奥に向かって流れます。 CPFは、本質的に非常にきれいであるが、このユニークな気流パターンは、技術者がわずかに汚染のリスクを低減するために、それらの技術を調整しなければならないことを意味します。従来のBSC、ラボワーカーの場合と同様にhouldの回避は、オープン細胞培養プレートとメディアボトルの上流に手を置きます。しかし、上流の方向は、CPFに変更されました
セル生産設備の研究室自体はかなり標準であり、-20℃の冷凍庫を装備しています、-80℃の冷凍庫、4℃の冷蔵庫、遠心分離、および水浴。研究室では、便利なハンズフリー操作用のフット・コントロールとのシンクがあります。この研究室では、機能の臨床セル生産施設となるようにするためには、しかし、いくつかの追加の修正がまだなされなければなりません。まず、装置自体が揮発性有機化合物、微粒子、及び汚染除去のために使用される二酸化塩素の濃度を監視する能力を有するようにアップグレードされなければなりません。第二に、FACS機を含む処理チャンバは、バッファモジュールを介して収容し、装置の残りの部分に接続されてもよいです。これは、細胞選別とTRの精製を可能にします適切な環境条件下でansplantable細胞集団。最後に、装置全体が柔らかい壁クリーンルーム内に収容されなければなりません。これは装置5のための国際標準化機構（ISO）クラス8環境を提供します。
CPFの高い無菌性およびコンピュータ制御の性質は、細胞ベースの治療法との良好な製造プロセスと将来のアプリケーションのための理想的なシステムになります。汚染の危険性が大幅に緩和されるが、より重要なことには、細胞増殖の条件は、自動的に記録され、コンピュータシステムによってアーカイブされます。ガス濃度、温度、湿度、およびシステムへのアクセスのすべてのイベントの偏差は厳密に文書化されています。製品の品質上の問題を調査するときに非常に役立つことができます。しかし、まだ制限があります。任意および全ての試薬 および消耗品（ 例えば、培地成分、ピペット、プレート）の使用量は、別々に文書化されなければなりません。加えますitionally、CPFの監視システムによって文書の変数とは全く無関係である生じる可能性がある（ヒューマンエラーの多くの形態を含む）の潜在的な問題が多数あります。このように、高度に訓練された人材とタスクの詳細なマニュアル文書化の必要性は、所定の位置に残ります。
開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
著者はXvivo囲まれた細胞培養系を使用することを学んで彼らの助けのためのBiospherixのスタッフ、特にマット・フリーマンを承認したいと思います。実験室でのインフラストラクチャを設定する際に自分の仕事のためのマイルズ＆ケリー建設会社、Inc.のスタッフ、特にラス・ヒューズ。実験室の改造を調整中で自分の仕事のための設備とサポートサービスの小児病院オレンジ郡の部門のスタッフは、特にアダムLukhardとデヴィンHugie。データ管理インフラストラクチャおよびリモートアクセスを設定する際に彼らの助けのための情報システムのオレンジ郡部門の小児病院のスタッフは、特にベトナムトラン。オレンジカウンティエグゼクティブ・マネジメントチームの小児病院プロジェクトの彼らの長年の支援、特に博士マリア・ミノンやブレントDethlefsため。この作品は、子供のオレンジ郡の病院や再生Medicinためのカリフォルニア工科大学によって資金を供給されましたPHSへの補助金TR3-05476を通じて電子。すべての著者は、この作品にも同様に貢献しました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | カスタムメイド | |
| Xvivo ソフトウェア | Biospherix | バージョン i.o.2.1.2.1 | |
| O2 マニホールド | Amico P-M2H-C3-S-U-OXY | ||
| CO2 マニホールド | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 マニホールド | ウエスタン イノベーター | CTM75-7-2-2-BM | |
| 顕微鏡 DP21 カメラと蛍光 | オリンパス株式会社 | CKX41 | |
| 名前 | 会社名 | カタログ番号 | コメント |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| リン酸緩衝ナトリウム | Hyclone | 9236 | |
| 線維芽細胞成長因子 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| ジメチルスルホキシド | プロチド | PP1130 | |
| ハンクスベースの細胞解離バッファー | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-メルカプトエタノール | Life Technologies | 21985-023 | |
| 上皮成長因子 | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 抗体 | ミリポア | AB3209 | |
| TRA-1-60 抗体 | ミリポア | MAB4260 | |
| SSEA4 抗体 | ミリポア | MAB4304 | |
| BIT-9500 血清サプリメント | Stemcell Technologies | 9500 | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 消耗品 | |||
| 2 ml セロジカルピペット | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml セロロジカルピペット | オリンパスプラスチック | 12-102 | |
| 10 ml セロロジカルピペット | オリンパスプラスチック | 12-104 | |
| 25 ml 血清ピペット | オリンパス プラスチック | 12-106 | |
| 50 ml 血清ピペット | オリンパス プラスチック | 12-107 | |
| 6 ウェルプレート | コーニング | 353046 | |
| 12 ウェルプレート | コーニング | 353043 | |
| T25 フラスコ | TPP | 90026 | |
| T-75 フラスコ | TPP | 90076 | |
| 20 & マイクロ;l ピペットチップ | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 & micro;l ピペットチップ | Eppendorf | 22491148 | |
| 1,000 ピペットチップ | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% エタノール | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
参考文献
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- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
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- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
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