マウス海馬アストロサイトにおける性差後<em&gt;インビトロ</em&gt;虚血

サマリー

星状細胞は、中枢神経系（CNS）において最も重要な主要なプレーヤーの一つです。ここでは、 インビトロ虚血後の男性と女性の新生児の仔にアストロサイト機能の基礎となるメカニズムを研究するために、有性海馬アストロサイト培養プロトコルの実用的な方法を報告しています。

要約

低酸素症/虚血（HI）関連脳損傷後のアストログリオーシスは、新生児における罹患率及び死亡率の増加に役割を果たしています。最近の臨床研究では、脳損傷の重症度は、セックスは依存しているように表示されていることを示しており、男性の新生児は、同等の脳損傷で、女性に比べて、 より深刻な神経学的転帰が得られ、HI-関連の脳損傷の影響をより受けやすいこと。有性海馬アストロサイトの高度に濃縮された集団を分離し、維持するための信頼性の高い方法の開発は、新生児HIの病理学的結果における性差の細胞の基礎を理解することが不可欠です。本研究では、再酸素化に続くインビトロ虚血、酸素-グルコース欠乏のモデルに供される性別特定海馬星状細胞培養物を作成するための方法を記載します。その後の反応性アストログリオーシスはimmunostaiで調べましたグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）とS100BのためのNing。この方法は、個別に、新生児HI以下の男性と女性の海馬アストロサイトの役割を研究するための有用なツールを提供しています。

概要

星状細胞は、中枢神経系（CNS）において最も重要な主要なプレーヤーの一つです。証拠の成長体は、アストロサイトの役割は、ニューロンのサポートを提供するよりもあることを示しています。実際には、生理的条件下でアストロサイトの役割は、このような、中枢神経系の血流^2を規制、開発軸索¹の移動を案内するシナプス間質液³のpHホメオスタシスを維持し、血液脳関門に参加するように、非常に複雑になることがあります⁴とシナプス伝達^5。病理学的条件の下では、アストロサイトは、反応性アストログリオーシス（傷害からの距離に対する）における形態、数、位置、地形と呼ばれるプロセスで傷害に応答し、アストロサイトの機能は、異種の方法^6,7に変更されることがあります。多分新生児の罹患率と死亡率に貢献する新生児低酸素性虚血性脳症後に見られる星膠症 8まで。

最近の臨床と実験研究は、脳損傷の重症度に比べて男性の新生児は、より深刻な神経学的転帰が得られ、低酸素/虚血（HI）関連脳損傷の影響をより受けやすいこと、セックス依存性であることが表示され、ことを示しています同程度の脳損傷^9-11とメス。傷害の局在は妊娠期間と期間と侮辱の重症度に依存するが、海馬は用語新生児HI後にCNSにおいて最も一般的に行なわ地域の一つであり、海馬アストログリオーシスを増加させたアップレギュレーションのによって確認されていますグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）新生児HI ^7,10,12,13後の3日間。アストロサイトの機能における性差は、脳虚血^14,15後の両方の新生児と成人の齧歯類に示しました。また、 インビトロ虚血にオスアストロサイト感受性は増加セル画によって示されました文化¹⁶の女性皮質アストロサイトと比較してリットル死。

セックスの違いは、 子宮内開始し、死亡¹⁷まで継続します。過去10年間、細胞培養およびin vivoでの研究の実験条件で男女を含むことの重要性は、医学およびNIHの研究所の重点は生理学的および病理学的条件^17,18に見られる性差に基本的な知識を求めるようになっています。有性海馬アストロサイトの集団を分離し、維持するための信頼できる方法の開発が新生児HIの病理学的結果における性差の細胞の基礎を理解することが不可欠です。本研究は、誘導、酸素/グルコース欠乏（OGD）と再酸素化（REOX）以下のGFAP免疫反応性アストロサイトの役割を評価するために、新生児マウスからの濃縮された性特異的海馬星状細胞培養物を準備する技術を提供するように設計されました細胞培養環境でHI。この技術は、正常酸素および虚血条件下新生児男性および女性における海馬アストロサイトに関連する任意の仮説を試験するために使用することができます。

プロトコル

注：この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の勧告に従って行きました。動物プロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン、施設内動物管理使用委員会の大学によって承認されました。ここで提示された初代星状細胞培養プロトコルは、張Y ¹⁹ らとCengiz P ²⁰ らによって提示されたプロトコルから採用されている。いくつかの変更を加えて。

1.海馬解剖とアストロサイトの文化

1. 2 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）それぞれで満たされた氷の上で手術用はさみ、滑らかな細かい鉗子、平坦な先端の鉗子、ペーパータオル、廃棄バッグ、70％エタノールと2解剖皿（直径3.5cm）を含むすべての必要な試薬および材料を準備します。 + DMEM + 5％ウマ血清：手術用機器の事前手続きへ（オートクレーブ）滅菌されていることを確認し、他のすべての材料（アストロサイトメッキ媒体を用います1％ペニシリン-ストレプトマイシン、ウマ血清、HBSS、0.25％トリプシン、カバーガラス、ペトリ皿、15/50 mLチューブ、T25フラスコ、 など ）予め滅菌など。
2. 静かに保持し、スプレー、マウスの子犬の頭と首を70％エタノールでシャープな滅菌ハサミを使って首をはねる[ 図1（1）]。
3. 脳[ 図1（2-3）]を公開するために頭皮に沿って小さなハサミで頭蓋骨を前方ために後方から正中切開を行います。
4. 小さなはさみで鼻に首から慎重に頭蓋骨をカットします。そして、頭蓋底から頭蓋を切断する小脳に嗅球と下に頭蓋前方をカット。
5. 頭蓋底に小さな切開を行い、正中線に沿って切断。頭蓋骨を剥がすために滅菌フラット先端鉗子を使用してください。湾曲した鉗子の助けを借りて、脳幹を削除します。頭蓋から脳を削除し、最初の解剖皿に置く[ 図1（4-9）] ²1。
6. 湾曲した鉗子を使用すると、脳の腹面が上を向くように脳を反転した後、鋭利な無菌手術用刃[ 図1（10,11）]との両半球を分離します
7. ピールバック大脳半球と慎重には、海馬、内側頭葉[ 図1（12-14）]の小さい、タツノオトシゴ状の構造を明らかにするために、無菌の平らな湾曲鉗子で膨らみ、中脳と視床組織を取り除きます。
8. 海馬ローブ[ 図1（15,16）]の両方を取り外し、慎重に微細な鉗子で引いて、葉から髄膜を分析。このステップは、髄膜細胞および線維芽細胞によって最終的な星状細胞培養物の汚染を避けることができます。
9. HBSSで充填された第2皿に準備された海馬のローブを移し、氷[ 図1（17,18）]の上にそれを返します。カバの製造方法 - 単一のマウスからプールの両方の海馬のローブ（P2 P0）campalの星状細胞培養物。これは、アストロサイト、適切な密度を提供します。鋭い無菌手術用ブレード（約4倍）を用いて、海馬葉をみじん切りに。
10. 皿から吸引しHBSS 1 mLのピペットに取り付けられた滅菌チップを使用し、0.25％トリプシンの3 mLを加え混ぜ、15 mLの滅菌コニカルチューブに移し、穏やかに振盪しながら20分間37℃で組織をインキュベートします。
11. 5分間、300×gで遠心分離管。慎重に真空ラインに取り付けられた滅菌ガラスピペットを用いて上清を吸引。組織片が均質化するまで、火災研磨したガラスピペットを用いて - （30回20）メディアと粉砕物をメッキ10 mLのアストロサイトを追加します。
12. 5分間、300×gで遠心分離管。上清を吸引し、メディアをメッキ新鮮予め温めアストロサイトの2 mLを加え。新しい50 mLコニカルチューブに70ミクロンメッシュフィルター（セルストレイナー）を介して細胞を渡します。
13. の3 mLを含むポリ-D-リジン/ラミニンコーティングされた無菌のT25培養フラスコにプレート全体の細胞懸濁液メディアメッキアストロサイトは、その後、5％CO ₂インキュベーター中、37℃でフラスコをインキュベートします。
14. 昼間で吸引し、メディア全体I N-試験管内 （DIV）1、DIV 3およびDIV 7、新鮮なアストロサイトメッキ培地2mLで交換してください。アストロサイトメッキメディアを交換しながら、光学顕微鏡下たびに進行し、アストロサイトの合流を観察します。
    注：DIV 1では、すべての実行可能な星状細胞は培養フラスコの表面に付着され、神経細胞を含む死亡または瀕死の細胞は、上清中に浮遊しています。 DIV 3では、付着した細胞は、星状細胞層を形成するために分裂し始めます。支持条件の非存在下で、培養物は、任意のニューロン成長のほとんどを欠いています。 DIV 7では、アストロサイト層は約80 - 90％コンフルエントといくつかのミクログリアだけでなく、オリゴデンドロサイト前駆細胞アストロサイト層の上に存在しています。
15. 吸引除去し、フラスコからメッキ媒体、すすぎ、培地をメッキ新鮮予め温めアストロサイトの2 mLを加えNDアストロサイトがコンフルエント培養をサブするための準備ができているとき、DIV 11で再び削除します。
16. 静かに滅菌ガラスピペットを用いてフラスコを数回吸引トリプシンを回転させ、0.25％トリプシン2mLのを追加します。
17. 0.25％トリプシンの2 mLを加え、フラスコが4のための組織培養フードに座ってみましょう - RTで5分。
18. トリプシンを削除し、10分間、5％CO ₂インキュベーター内で37℃でフラスコを保ちます。 5 mLの培地をメッキアストロサイトを予め温め追加し、あなたの手のひらに対してフラスコをタップして星状細胞層を切り離し（3から4回）完全な分離を達成し、15 mLのコニカルチューブにアストロサイトを収集するために、穏やかな粉砕しました。
19. 遠心管は、5分間300×gで、上清を吸引し、1mLの新鮮なアストロサイトメッキ媒体を追加します。
20. 血球計数器に細胞懸濁液の10μLを追加し、倒立位相差顕微鏡（10倍対物レンズ）を使用して、大きな中央グリッド面積（1ミリメートル^2）で細胞を数えます。ムルtiply 10 ⁴でミリリットル当たりの細胞数を推定します。 One T25フラスコは〜1×10 ⁶合計解離した細胞が得られます。シード〜1×10 24ウェル培養皿のウェル中の12ミリメートル直径ポリ-D-リジンプレコーティングしたガラスカバースリップ上に2 mLのアストロサイトメッキ培地中で⁵個^の細胞。
21. 5％CO ₂インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 14（セクション2） - DIV 12でOGD / REOXを実行します。
22. ミクログリアを欠い海馬培養が望ましい場合DIV 11まで5 mMのL-ロイシンメチルエステル（LME）塩酸塩DIV 3で星状細胞培養物を扱います。 LMEのインキュベーションの後、対象の文化の汚染ミクログリアを除去するために（1時間300 rpm）し振とうします。
    注：LMEが増殖ミクログリア^22を除去する方法として広く使用されてきた小グリア細胞毒性剤です。

2. OGD / REOXトリートメント

1. カバースリップから培地を吸引し、接着性アストロサイト培養物（DIV 12から14）を含有し、3回すすぎ静かにカバースリップを（mM単位）を含有する1mLの等張OGD液（pH7.4）で数回保持24ウェル培養皿回転させることによって：0グルコースを、21のNaHCO _3、120のNaCl、5.36のKCl、0.33のNa ₂ HPO _4、 0.44 KH ₂ PO _4、1.27のCaCl _2、および0.81のMgSO _4。
2. カバースリップをカバーし、94％のN _{2、1％O 2}および5％CO _2を含有_する低酸素培養器中で2時間インキュベートするウェルに0.2mLのOGDの溶液を加えます。静かにガス交換を容易にするために、低酸素状態の最初の30分間オービタルシェーカー（50回転）と混合。
3. 5.5 mMグルコースの追加を除き、OGD液と同一の緩衝液中の5％CO ₂および大気中で2時間の正常酸素対照細胞をインキュベートします。
4. REOXについては、吸引OGD液と培地をメッキアストロサイトの2 mLを加え。 5時間、37℃で5％CO ₂大気中でインキュベートします。

3.免疫細胞化学染色

1. 真空ラインに取り付けられた滅菌ガラスピペットを用いて培地を吸引し、すぐに0.1 Mトリス緩衝生理食塩水（TBS）の1mLのを添加することによってカバースリップを一度リンス（154ミリモルのNaCl、16mMのトリズマ塩基、84 mMのトリス-HCl、pH7.4）でウェルに。吸引し、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）を2mLを加えます。 RTで15分間インキュベートします。
2. 吸引し、0.1 M TBSの1 mLを加え、次に2分間、ロッキングシェーカー上に置きます。 3回繰り返します。溶液（10％のヤギ血清、0.1 M TBS中10mg / mLのBSA、0.025％トリトンX-100）をブロック1ミリリットルを加え、ロッキングシェーカー上にて37℃で30分間インキュベートします。
3. 60分間およびウサギポリクローナル抗S100B（1：500）またはウサギポリクローナル抗HIF1α（200 1）：吸引して溶液と一次マウスモノクローナルを追加抗GFAP抗体（ブロッキング溶液中で500倍希釈の0.2 ml）をブロックしますロッキングシェーカー上で37℃で。
4. マウス月：あるいは、いくつかの星状細胞は、ウサギポリクローナル抗IBA1（200 1）とインキュベートします文化純度にアクセスするためのoclonal抗MAP2。
5. 吸引した一次抗体および0.1 M TBS 1mLのを追加し、2分間、その後、吸引用のロッキングシェーカー上に置くことによってカバースリップをすすぎます。二回繰り返します。
6. ロッキングシェーカー上にて37℃で60分間、ブロッキング溶液中で二次ヤギ抗ウサギ488結合抗マウス568結合抗体の200倍希釈1の0.2 mLを加え。
7. 吸引した二次抗体と2分した後、吸引用のロッキングシェーカー上、0.1M TBSと場所の1ミリリットルを追加することにより、カバースリップをすすぎます。二回繰り返します。
8. スライド乾燥機の上に位置するスライド上に配置することにより、ウェル・ドライからカバースリップを削除します。 VECTASHIELDの一滴に反転させることによって新しいスライドにマウントカバースリップは、DAPI（1.5 ngの/μL）でマウンティング培地をhardset。
9. どちらか20X乾式または60X油浸対物レンズを用いた共焦点顕微鏡の画像カバースリップ。 DAPI用の画像（512×512）を取得（405 nmの元/ 450 nmのEM）と蛍光色素488（488 nmの元/ 515 nmのGFAP抗体をタグ付けしました。EM）。 20Xと60Xグループ内で一定収集パラメータを保管してください。

PCRを使用して4.セックス決意

1. 50mMのNaOH中で45分間95℃で熱子犬つま先や指の切り抜きと1 Mトリス、pHを6.8等量の中和。
2. MyogとSRY遺伝子のためのプライマーの5ピコモル、1×反応緩衝液、0.2mMの各デオキシヌクレオチドおよび8 UのTaqポリメラーゼ：以下の混合物の19μLに抽出したDNA溶液1μLを追加します。
3. プライマー配列を使用します。 SRY 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 '、5'CATGACCACCACCACCACCAA3'とMyog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ^{'、5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3」23。}
4. 1分間、72℃で15秒間、58℃で15秒、アニーリング95℃で3分間の変性の後、30サイクルの95℃、伸び：以下のPCRプロトコールを実行します。この30サイクルの後、反応物を1分間の最後の72℃の伸長で終了します。
5. 個別のPCR製品は、電気泳動、エチジウムブロマイドを含む2％アガロースゲル上で、紫外線照射下で可視化します。 （ 図2A）。 注意！臭化エチジウムは、潜在的な発がん性物質であり、慎重に処理し、金融機関の規制に従って適切に処分しなければなりません。

結果

生理学的または病態生理学的条件の下で有性アストロサイト機能の役割を理解することは非常にインビトロ条件下でこれらの細胞を培養することによって明らかにされています。有性培養を行うことの重要な態様は、使用前に、マウスの仔の性別を決定することです。我々は遺伝的PCRによって、および視覚的評価（ 図^2）16によってマウスの性別を決定します。 PCRを用いセックス決意の方法論はMcCliveとシンクレアから修正を加えて採択された、迅速、簡単でかつ再現性の高い方法²³である。 図2Aは 、PCRを使用してセックス決意の代表的な結果を示しています。 PCR産物は2つの代表的なP1男性と女性の尾切れ端から抽出したDNAを用いて作製しました。反応は441 bpおよび女性specifのオス特異的なバンドを生成SRYとMyog遺伝子のための多重プライマー対を含み、それぞれ245塩基対のICバンド。新生児の視覚決意（P 1から3）肉眼...

ディスカッション

生理学的および病理学的条件の下での特性とアストロサイトの機能における性差を研究するために、細胞培養における有性初代星状細胞の調製は、利用するための重要なツールです。本研究では、in vitroで新生児から有性海馬アストロサイトの高濃縮均質な集団（P0-P2）C57BL / 6（野生型）またはK19F（GFAPヌル）仔マウス高効率と文化に再現性のある方法を報告しています。この方法論を確立することは、研究者は、 インビトロ虚血後有性海馬アストロサイトの生理学的および病理学的機能を理解するのに役立ちます。

単一細胞懸濁液を達成するために消化された組織の粉砕し、その後、トリプシン処理中に無菌性および海馬ローブの適切な消化の維持を含め、この方法論を確立する上で2つの重要なステップがあります。初代星状細胞の予防から汚染されたばかり培養プロセス全体を通じて最大の課題の一つです。細菌および/または真菌は、技術を実行しながら、適切なケアが採用されていない場合は無駄な培養細胞をレンダリングすることができ、汚染の2つの一般的なモードです。したがって、実験の成功を確保す...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アストロサイト培養培地
DMEM、高グルコース	cellgro	10-013-CV
馬血清	Gibco	26050-070	最終濃度:10%
ペニシリン-ストレプトマイシン	Cellgro	30-002-CI	最終濃度:1%
L-ロイシンメチルエステル塩酸塩	Aldrich	L1002-25G	最終濃度:5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS	Life Technologies	14170-088
Trypsin	cellgro	25-050-CI	最終濃度:0.25%
その他
70%(vol / vol)エタノール	Roth	9065.2
Poly-D-Lysine(PDL)12 mm丸型カバースリップ	コーニング	354087
ウォーター	シグマ	W3500	細胞培養グレード
PBS	cellgro	21-040-CV	細胞培養グレード
0.05% トリプシン-EDTA	ライフテクノロジー	25300-062
70 μm 滅菌セルストレーナー	フィッシャーサイエンティフィ	ック22363548
3.5 cm シャーレ	BD ファルコン	353001
15 mL ファルコン チューブ	BD ファルコン	352096
50 mL ファルコン チューブ	BD ファルコン	352070
鉗子、罰金	デュモン	2-1032; 2-1033	# 3c; # 5
鉗子、フラットチップ	KLS Martin	12-120-11
13 cm 手術用ハサミ	Aesculap	BC-140-R
共焦点顕微鏡	Nikon	A1RSi
遠心分離機	Eppendorf	5805000.017	5804R
オービタルシェーカー	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
抗IBA1	和光	019-19741	ウサギモノクローナル
抗MAP2	Σ	M2320	マウスモノクローナル
抗HIF1α	abcam	ab179483	ウサギモノクローナル
抗S100B	Σ	HPA015768	ウサギポリクローナル
抗GFAP(カクテル)	バイオレジェンド	837602
ベクタステインエリートABCキット(ウサギIgG)	Vector Labs	PK-6101	4種類の試薬が含まれています
ヤギ抗ウサギ Alexa-Fluor 488	Invitrogen	A11070
ヤギ抗マウス Alexa-Fluor 568	Invitrogen	A11004

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