ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化

サマリー

糸状アクチン(F-アクチン)は、スピノジェネシス、シナプス可塑性、およびシナプス安定性において重要な役割を果たします。したがって、F-アクチンpunctaの定量化は、シナプス構造の完全性を研究するための有用なツールです。このプロトコルは、低密度の初代皮質ニューロン培養物でファロイジンで標識されたF-アクチンプンクタを定量化する手順を説明しています。

要約

（F-アクチン）繊維状アクチンタンパク質はspinogenesis、シナプス可塑性、およびシナプスの安定性に大きな役割を果たしています。樹状F-アクチン豊富な構造の変化は、シナプスの完全性と接続性の変化を示唆しています。ここでは、初代ラット皮質ニューロン、F-アクチン斑点のためのファロイジン染色、およびその後の定量化手法を培養するための詳細なプロトコルを提供します。まず、E18ラット胚の前頭皮質は、その後、低密度の細胞培養物中に少なくとも12〜14日間、in vitroで増殖させた神経細胞を解離します。実験的治療に続いて、皮質ニューロンがのAlexaFluor 488ファロイジンで染色され、微小管結合タンパク質2（樹状F-アクチン斑点標識する）（MAP2を、神経細胞や樹状突起の整合性を検証するために）。最後に、特別なソフトウェアがランダムに選択された神経細胞の樹状突起を分析し、定量化するために使用されます。 F-アクチン豊富な構造は、二次樹枝状の枝に識別されます（長さの範囲25-75＆＃181; m）を連続MAP2免疫蛍光を持ちます。ここで紹介するプロトコルは、実験処理に続いて、樹状シナプス構造の変化を調査するための有用な方法となります。

概要

この研究の主な目的は、ニューロンの樹状突起ネットワークのシナプス完全性の測定（推定）の信頼性の高い方法を開発することです。ここでは、ファロイジン染色および特殊な（NIS-要素）ソフトウェアを使用して、その後の分析と樹状突起の免疫細胞化学（ICC）の検出の組み合わせを用いて、ラット初代培養神経細胞におけるF-アクチン涙点の定量化について説明します。

標識ファロトキシンは、大小両方のフィラメント（F-アクチン）に対して同様の親和性を有するが、いくつかのアクチン抗体¹とは異なり、単量体の球状アクチン（G-アクチン）に結合しません。ファロイジンの非特異的結合は、このように細胞イメージングの間に最小限の背景を提供し、ごくわずかです。ファロイジンは、典型的には、ファロイジンによるF-アクチンのはるかに強い標識化を可能にする蛍光顕微鏡用の細胞タンパク質を標識するために使用される抗体よりもはるかに小さいです。このように、神経細胞におけるF-アクチンの局在の詳細な画像をすることができます標識されたファロイジンを使用することによって得られます。

神経細胞の樹状突起のファロイジン（F-アクチン）染色は、成熟した棘、非とげシナプス²と未熟棘を含む樹枝状構造の多様性を表す離散的「ホットスポット」や明るい「斑点」を生成します。未熟棘薄い糸状仮足及びパッチの形態のいくつかの形態を含み、そしてspinogen....

プロトコル

全ての動物プロトコルを見直し、サウスカロライナ大学の動物実験委員会（保証番号：A3049-01）によって承認されました。

1.低密度胚性神経文化

1. 初代皮質神経細胞培養のための準備
   1. ソリューション：
      1. 10 mlのホウ酸緩衝液中のポリ-L-リジン5mgを溶解することによりポリ-L-リシンストック溶液を調製します。
      2. 49ミリリットルホウ酸緩衝液中で1ミリリットルポリ-L-リジンストックを希釈して使用液を調製します。
      3. 395ミリリットルのdH ₂ Oで開始し、その後、全ての成分（ホウ砂の1.24グラムのホウ酸+ 1.9グラム）を加えることによりホウ酸緩衝液、pH 8.4を準備します。 1MのNaOHにより8.4にpHを調整します。 400ミリリットルに調整し、ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでろ過します。
      4. 445ミリリットルのdH ₂ Oで始まるとすべての他の成分（50ミリリットル10X HBSS証券+ 1.2グラムHEPES）を追加することで、HBSS溶液、pHが7.2を準備します。 1NのHCl、BRIにより7.2にpHを調整しますNGに500ミリリットルとは、ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでろ過します。
      5. 10％ウシ胎児血清を含むDME....

結果

私たちは、個々の神経細胞の樹状突起を識別することを可能にする35ミリメートルのガラスボトムディッシュで低密度で存在する方法で、私たち第1の培養ラット皮質ニューロン、。 図1では 、微分干渉コントラスト（DIC）画像は、日4、6、10、14、21、in vitroで 27に胎児ラット皮質ニューロンの開発における形態学的変化を示しています。樹状突起の長さと数は、培養ラット初代神経細胞の成熟に伴って増加することに注意してください。ニューロンはわずか14日間熟成した後、実験に使用されています。

樹状突起とシナプスの変化を検出するために、我々は樹状突起のMAP2抗体検出とファロイジンFアクチンの標識を兼ね備えています。 F-アクチンのファロイジン標識は（20-30分）非常に急速であるので、視覚的にICCの抗体標識（ 図2に進む前にsynaptodendriticネットワークの整.......

ディスカッション

このプロトコルでは、我々は、私たちは、個々の神経細胞の樹状突起を識別することを可能にする35ミリメートルのガラスボトムディッシュで低密度で培養ラット皮質ニューロンを記述する。次に、我々は、樹状変化を検出するファロイジンとMAP2染色を使用します。その後、我々はF-アクチン斑点の変化を定量化するために特別なソフトウェアを使用していました。

F-アクチン斑点の変化を決定するために、個々の神経細胞の全体の神経回路網が明確に表示されている必要があり、これは、単一ニューロンから適切な二次樹枝状のセグメントを選択することができます。低密度めっきは、個々のニューロンを可視化するための両方、ならびにグリア細胞の存在を最小限にするために重要です。アストロサイトはまた、F-アクチンを含み、ニューロンマーカーなしで、F-アクチン陽性の涙点の分析を混乱させる可能性があります。低密度培養物およびNeurobasal培地の使用は、細胞培養物中で星状細胞の増殖を減少させるのに有用です。しかし、Fアクチンのタンパク質であることを警告与えニューロンに特異的ではない、などMAP2などの特定の神経細胞のタンパク質マー.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35 mm ガラス底皿 No. 1.5 カバーガラス	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lysine	Sigma	P9155
ホウ酸	シグマ	B0252
ホウ砂	シグマ	B9876
GlutaMax	ライフテクノロジー	ズ 35050-061	100X
グルコース	VWR	101174Y
HBSS	シグマ	H4641	10X
ニューロベース ミディアム	ライフテクノロジー	ズ 21103-049
B-27 サプリメント	ライフテクノロジー	ズ 17504-044	50X
抗生物質-抗真菌薬ソリューション	Cellgro	30004CI	100X
重炭酸ナトリウム	ライフ	テクノロジー25080
ナスはさみ	ワールド精密機器	500086
アイリスはさみ	ワールド精密機器	500216
アイリス鉗子	ワールド精密機器	15914
デュモン#7鉗子	ワールド精密機器	14097
デュモン #5 鉗子	世界の精密機器	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148
カバーガラス	VWR631-0137
レクサフルーア488ファロイジン	ライフテクノロジーA12379
正常な馬の血清	ライフテクノロジー	ズ26050-070
ポリクローナル抗MAP2	アブカム	Ab92434
レクサレッド594共役ヤギ抗チキンIgG	ライフテクノロジー	ズA11042
NucBlue 生細胞染色 ReadyProbes 試薬 Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements ソフトウェアパッケージ	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E 倒立蛍光顕微鏡	ニコンインスツルメンツ
0.2 μm Nalgene ナイロン メンブレン フィルター	Fishersci	151-4020

バンアチキンア