ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

サマリー

技術は全体のゼブラフィッシュ胚におけるホスホ - エピトープを免疫染色した後、一次繊毛のように小さな細胞構造の二色の蛍光共焦点の局在化を行うことが記載されています。固定およびイメージングのための技術は、特定のタンパク質の出現または活性化の位置と速度を定義することができます。

要約

細胞の急速な増殖は、遺伝子の組織特異的発現およびシグナル伝達ネットワークの出現は、すべての脊椎動物の初期胚発生を特徴付けます。動態および信号の場所 - であっても、単一の細胞内 - 胚では、重要な発達遺伝子の同定を補完します。免疫染色技術は、一次繊毛のように小さな構造に細胞内および動物全体の信号の速度を定義することが示されているが記載されています。レーザー走査型共焦点複合顕微鏡を用いた定着、撮像処理画像のための技術は、わずか36のような時間で完了することができます。

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、手頃な価格とヒト疾患に関連する脊椎動物種の研究を行うことを求める研究者のための望ましい生物です。遺伝的ノックアウトまたはノックダウンは、実際のタンパク質産物の損失によって確認されなければなりません。タンパク質損失のような確認ここに記載された技術を用いて達成することができます。シグナル伝達経路への手がかりはまた、翻訳後リン酸化によって修飾されたタンパク質と反応する抗体を使用して解読することができます。エピトープのリン酸化状態を維持し、最適化することは、この決意することが重要であり、このプロトコルによって達成されます。

本研究では、開発の最初の72時間と共局在クッパーの小胞（KV）における繊毛と関連する様々なエピトープ、腎臓および内耳中に胚を固定するための手法について説明します。これらの技術は、切開を必要としない、単純であり、比較的短時間で完了することができます。単一の画像に共焦点画像スタックを投写することは、これらのデータを提示する有用な手段です。

概要

>jove_content<ここで述べられている技術は、受精、原腸陥入、体節形成、体幹、目、脳、臓器の形成など、初期発生中に発生するイベント中のCa²⁺シグナルの下流ターゲットを定義しようとした研究の結果です。^1-3 胚性Ca²⁺シグナル伝達の当初の発見は、イクオリン⁴やフラ-2などの天然および人工のCa²⁺指標の使用に依存していました。⁵ 現在の技術でも、Ca²⁺の過渡的な上昇を検出するには面倒な分析ツールが必要であり、そのようなCa²⁺信号のターゲットは明らかになりません。

この研究室では、CaMK-IIとして知られるCa²⁺/カルモジュリン依存性(多機能)プロテインキナーゼを介して作用するCa²⁺シグナルを調査しています。この酵素は、中枢神経系に豊富に存在し、もともと長期増強の調節因子として同定されています。⁶ CaMK-IIは脳特異的ではなく、無脊椎動物を含む動物界全体の種の全生涯および体全体にわたって広く発現し、高度に保存されています。^7,8 CaMK-IIは、Thr²⁸⁷で自己リン酸化する能力により、Ca²⁺レベルが低下した後でも自身の活性を維持する独自の能力を持っています。この自己リン酸化状態では、CaMK-IIは脱リン酸化されるまで、Ca²⁺/CaM非依存的に活性を維持します。⁶ したがって、リン酸化CaMK-II(Thr²⁸⁷)の局在化により、自然で関連性のあるCa2⁺の上昇が発生した細胞を特定できます。

自己リン酸化(P-Thr²⁸⁷)哺乳類CaMK-IIに対する抗体は十分に特徴付けられており、当初は脳組織に活性化されたCaMK-IIを局在させるために使用されました。⁹ ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は7つのCaMK-II遺伝子^10,11を持ち、そのタンパク質産物はこの領域にMHRQE[pT²⁸⁷]VECLKの配列を含んでいる。^10,11 この配列は、このウサギポリクローナル抗体(MHRQE[pT]VDCLK;Upstate/Millipore)であるため、この抗体がゼブラフィッシュCaMK-IIと交差反応したことは完全な驚きではありませんでした。この研究室では、この抗体がゼブラフィッシュのCaMK-IIと自己リン酸化およびCa2⁺/CaM非依存的な活性に比例して反応することを示しました。¹² さらに、パン特異的なCaMK-II抗体もゼブラフィッシュのCaMK-IIと交差反応することが示されています。¹³

名

この抗体は、ゼブラフィッシュのCaMK-IIが、左右の非対称性の確立に必要な繊毛器官であるゼブラフィッシュクッパー小胞（KV）の片側の細胞で優先的に活性化されることを実証するために使用されてきました。¹² この抗体を用いて、CaMK-IIがKVの左側にある4つの隣接する細胞において、臓器の位置が決定されるのと全く同じ発生段階で一過性に活性化されることを実証するために使用されました。¹² クッパー小胞(KV)に加えて、自己リン酸化(P-T²⁸⁷)は、腎臓、ニューロマスト、内耳などの他の繊毛組織の特定の細胞内部位にも存在していました。^12,13ゼブラフィッシュの腎臓では、P-T^287-CaMK-IIは繊毛管細胞の頂端境界に沿って、および総排泄腔繊毛内で濃縮され、そこでそれらの組み立てに影響を与えます。¹³ 最後に、発達中の内耳では、P-T^287-CaMK-IIは繊毛の基部に強く集中しており、Delta-Notchシグナル経路を介して細胞分化に影響を与えます。¹⁴ 要約すると、活性化CaMK-IIの検出は、細胞内Ca²⁺放出の部位を特定し、潜在的な新しいシグナル伝達経路を明らかにしました。

これらの発見は、活性化された(P-T²⁸⁷-自己リン酸化)CaMK-IIを局在する高感度で正確な方法の開発に完全に依存していました。ゼブラフィッシュのKV、腎臓、内耳を固定し、免疫染色する方法が記載されています。この手法の制限事項についても説明します。これらの技術は、脊椎動物の初期の発達において、リン酸化エピトープだけでなく、任意のエピトープの2つの蛍光チャネルで高解像度の画像を取得しようとする研究者にとって有用であるはずです。

プロトコル

このプロトコルでのゼブラフィッシュの手順は、バージニア・コモンウェルス大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。

試薬の調製

1. 4％PFA / PBS。ドラフト内でパラホルムアルデヒドの8グラム（PFA）を秤量します。まだドラフト中ながら、50℃まで撹拌しながら加熱し、H _{2 O}を蒸留〜80ミリリットルで乾燥PFAを溶解します。 PFAが完全に溶解され、溶液が明確になるまで新鮮な1NのNaOHの10滴 - 攪拌しながら、3を加えます。暑さから削除し、100ミリリットルの2×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。蒸留H ₂ Oで200ミリリットルにボリュームをもたらしますRTに冷却し、使用前に7.4のpHを確認します。 4℃で暗所に保管したが1週間以内に使用します。
2. 任意のサプリメントなしで、100％メタノールを使用してください。任意のサプリメントなしで、95％エタノールを使用してください。
3. リン酸緩衝トゥイーン（PBT）を準備します。 0.1％のTween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を補います。 0を追加します。PBS 1×100mlに20％のTween-20のストック溶液5ml。室温で保管してください。
4. リン酸緩衝トリトンX（PBTx）を準備します。 0.1％トリトンX-100を含むPBSを補います。 100mlのPBSに20％トリトンX-100株の0.5ミリリットルを追加します。室温で保管してください。
5. 10％NGS / PBTxを準備します。正常ヤギ血清（NGS）ブロック非特異的結合部位。 -20℃で分量を保存NGS。使用するには、9ミリリットルPBTxに1ミリリットルを追加します。
6. 50％グリセロール/ PBSを準備します。 2×PBSおよび100％グリセロールの徹底的に等しい部分を混ぜます。室温で保管してください。

2.胚の固定

1. 繁殖 、野生型（ABおよびWIK）またはトランスジェニック（ 例えば 、βアクチン。：CAAX-GFP）を取得します。自然交配を通じて胚を。必要であれば、説明したように、構築物またはモルホリノで胚を注入する^。15,16
2. 胚を上げる。胚を収集し、説明したように色素沈着をブロックするために28.5°C 0.003％の1-フェニル-2-チオ尿素の存在下で（PTU）でインキュベートする^。17 P>
3. 胚は、所望の発達段階^{、18に達した}とき。修正 、   MESABを使用して胚を麻酔、できるだけ多くのシステムの水を除去し、3のために、新鮮な4％PFA / PBSを追加 - RTで4時間。注：時々未満20時間後に受精（HPF）、前dechorionationに固定します。 20 HPF後の回では、解剖顕微鏡下で細かい点鉗子の2ペアを使用して固定する前にdechorionate。
4. ソリューションを変更する。説明したように、ワイドボアピペットを用いて胚を移す^。17変更ソリューションを1.5ミリリットルキャップされたマイクロ遠心チューブに、単に胚は、遠心分離することなく、重力によって沈降させることによって。
5. ポスト固定剤 3の後- 。4時間、少なくとも48時間、-20℃で100％のメタノールとストアと置き換え、PFA / PBSを削除します。注：最大P-のCaMK-II免疫反応性については、1週間に合計メタノール蓄積時間を制限します。

"> 3。免疫染色胚全体

1. キャップされた1.5ミリリットルのマイクロチューブに各実験条件について10胚の最小値を置き、それらにラベルを付けます。
2. 胚が解決することができます。削除し、メタノールを破棄し、次のステップに示すように、エタノールの濃度を減少さ0.5 mlを含有する進行性の洗浄で再水和します。各ステップは、ロッキングで5分間の洗浄です。
3. 次第にこれらの5の溶液で再水和：66％エタノール/ 33％PBTx、33％エタノール/ 66％PBTx、100％PBTx、100％PBTx（これはPBTxの最初の繰り返しである）、100％PBTxは（これは、第二の反復でありますPBTx）。
4. 最後PBTx洗浄を削除してください。 0.5ミリリットル10％NGS / PBTxを追加します。緩やかに揺り動かしながら、室温で少なくとも1時間インキュベートした後、溶液を除去し、廃棄します。
5. 10％NGS / PBTxで希釈することにより、一次抗体溶液を準備します。共免疫染色した場合、最初のより高い親和性の抗体を使用しています。 500：この研究のために、1を希釈したマウス抗アセチル化チューブリンモノクローナル抗体とインキュベートします。 examplのためeは、10個のサンプルがある場合、10％NGS / PBTx 3 mlのストック抗体溶液の6マイクロリットルを結合し、各チューブに、この0.3 mlで分配します。
6. すべての胚を浸漬する各チューブに希釈した一次抗体の0.5ミリリットル - 0.2を追加します。 RTで穏やかなロッキングO / Nでインキュベートします。
7. 午前中は、抗体溶液を除去し、廃棄します。過剰の一次抗体を洗い流すために0.5ミリリットルの2％NGS / PBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。
8. 頭上の照明を暗くし、各条件は、少なくとも0.5ミリリットルを含むように、10％NGS / PBTxに適切な蛍光結合二次抗体を希釈します。マウス抗アセチル化チューブリン一次抗体と、緑色蛍光色素のヤギ抗マウスIgG 1で使用：500希釈。
9. 穏やかに暗闇の中で室温で揺らしながら4時間二次抗体をインキュベートします。今から、プロセスのサンプル淡色表示灯の下で、暗い容器にまたはアルミホイルで包むことによってインキュベートします。
10. インキュベーションの終了時に、二次抗体溶液を除去し、廃棄します。洗浄するために0.5ミリリットルの2％NGS / PBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。
11. 共免疫染色した場合、最初の一次抗体とは異なる種から第二の一次抗体を得ます。これらの研究では、赤色蛍光色素コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG二次抗体によってウサギ抗ホスホのCaMK-II抗体に従います。
12. ウサギ抗リンのCaMK-II抗体1:20に希釈します。胚の各チューブについて、その後、0.3ミリリットル10％NGS / PBTxにサスペンドストック抗体溶液の15μlを添加します。
13. 胚が浸漬され、ライトが淡色表示されていることを確認してください。暗闇の中で、室温で穏やかにロッキングO / Nでインキュベートします。
14. 薄暗い照明の下で午前中は、抗体溶液を除去し、廃棄します。 0.5ミリリットルの2％NGS / PBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。
15. 薄暗いオーバーヘッドライトを保ち、適切な蛍光conjuを十分に希釈します各条件は、少なくとも0.5ミリリットルを含むように、二次抗体をゲーティング。 500 10％NGS / PBTx：本研究では、赤色蛍光色素コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG二次抗体（赤色チャンネル）1を希釈。
16. 穏やかに暗闇の中で室温で揺らしながら4時間第二の二次抗体をインキュベートします。
17. このインキュベーションの終わりと薄暗い照明の下で、二次抗体溶液を除去し、廃棄します。 0.5ミリリットルPBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。撮像手順に応じてPBTxまたは50％グリセロール/ PBSのいずれかに保管してください。

4.共焦点イメージングと処理

1. イメージングのためのマウント胚。スライドガラス上に5胚 - 1を配置します。メインカバースリップとチャンバーの両側にカバースリップの断片を使用してスライド間のチャンバを作成します。典型的には、4つの＃1カバーガラスをシールすることなく、これらのスペーサ・スタックを作るために使用されます。
   注：いいえマウンティング培地は必要ありません。
2. 100Xの油浸を使用します目的は、透過光を用いて、焦点に単一胚をもたらすために。ライトをオフにします。共焦点顕微鏡をオンにします。適切なレーザー（緑色および/または赤色）がオンし、リモートフォーカスアクセサリーが締結されていることを確認してください。
3. 共焦点プログラムをオンにします。 「獲得バー、「適切な目的を選択します。 「XY基本」バーでは、1024ボタンをクリックすることで、1024に画像サイズを設定します。
4. 「レーザーおよび検出器」バーでは、各チャネルのレーザーおよび検出器をオンにするために、赤488ボックスと緑の568のボックスをクリックしてください。培地にピンホール設定し、可視化するために、各チャネルの「ゲイン」バーのゲインを調整します。
5. 「取得設定」バーでは、画像の収集を開始するために「ライブ」をクリックします。 「表示設定」バーで、「ライブ」ウィンドウの中央に「インテグラズームを強制」チェックボックスをオフにします。
6. 「設定の取得」バーで、「Z」タブで、画像のレイヤーをステップ。 NUを選択した後光学切片のmberは、画像に組み込むz平面の「中心」にいくつかのポイントに移動します。
7. 「Z」タブの下で、小さな赤い「リファレンス」ボックスをクリックします。これは、「センター」として選ばれた時点で、RFAをゼロにします。 （0.25ミクロンと2.0ミクロンの間に理想的である）、「ステップサイズ」と表示されたボックスで、層の厚さを選択します。 「ファイルサイズ」ボックスに注意を払い、1ギガバイトに制限しよう。
   注：典型的には、0.5の最大40光学切片 - 1.0μm以下が得られるが、セクションの数は、経験的に決定することができます。
8. 画像の上部極端を見つけるには、次の「トップ」に丸をクリックして、zの層を通って移動します。今すぐ次の「下」に丸をクリックして、コンピュータはセンターバックとして層に画像を撮影します。再度、画像の下極端を見つけるために、層を通って移動します。
9. レーザーを停止するには、「取得設定」ボックスに再び「ライブ」をクリックします。取得。このパネルでは、平均およびZスタックをラベルされた赤のボックスをクリックします。これらのボックスは緑色に変わります。
10. 「取得設定」ボックスで、画像のシリーズ全体を取得するために「シングル」をクリックします。それは両方のチャネルで、全体のzスタックを走査のように進行状況を監視することができます。
11. 、保存ボリュームウィンドウをクリックし、クリックして「名前を付けて保存」で、ファイルに名前を付けます。 「.ids」ファイルとして保存します。 zスタックがまだ開いている間のボリュームにファイルをレンダリングし、メニューをプルダウンして「ボリュームレンダリング」をクリックしてデータを選択します。 TIFFファイルとしてレンダリングされたファイルを保存します。これは、このマニュアルに示されている投影された画像です。

結果

ホスホ-エピトープを可視化するための最適な条件

ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質エピトープの免疫学的局在を記述する方法は、in situハイブリダイゼーションを介してmRNAをローカライズするためのものに比べて比較的疎でした。ゼブラフィッシュ胚の繊毛細胞におけるタンパク質のエピトープを局在化に使用される固定剤は、メタノールとDMSOの混合物である、4％PFA / PBSとデントの固定液が含まれている。RNAの¹⁹ローカライズ全体in situハイブリダイゼーション （WISH） に取り付けることによって、典型的にはPFAを用いて達成されます100％メタノールでストレージが続く^。20,21我々の研究は、WISH固定剤の組み合わせは、2〜7日後にメタノール中で時間を制限するとき、P-のCaMK-II抗体を用いた免疫学的局...

ディスカッション

PFA /メタノール法は、ゼブラフィッシュの開発中に、ホスホT ²⁸⁷ -CaMK-IIエピトープの免疫局在を最適化する第一の目的と本研究室で開発されました。このメソッドは、正常にゼブラフィッシュ^KV、12内耳¹⁴と腎臓を含むいくつかの繊毛器官の形成時にP-のCaMK-IIをローカライズ^。13、特にKV段階で、この技術が必要でした。この方法の成功は、b）は、リン酸化のCaMK-IIエピトープ及びc）の保存が抗体にエピトープのアクセシビリティを向上し、原因自家蛍光のa）の最小化との組み合わせに起因する可能性が高いです。

このアプローチの主要な制限は、メタノール中の記憶の時間です。 P-のCaMK-IIの免疫反応性は、-20℃でメタノール中で2日後に最大​​であるが、このエピトープの反応性は、メタノール中で1週間保存後に失われています。なお、この時点でリン酸基がHYであるかどうかは明らかではありませんdrolyzedまたは更なる変性はそれが免疫反応性を低下させるが発生します。 -20℃でメタノール...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU)	Sigma	P-7629	0.12% ストック溶液。システム水で1:40を希釈します
Alexa488 抗マウス	IgG ライフテクノロジー	ズ A11001	ヤギポリクローナル、1:500
Alexa488 抗ウサギ IgG	ライフテクノロジー	ズ A11008	ヤギポリクローナル、1:500
で使用 Alexa488 ファロイジン	ライフテクノロジー	ズ A12379	F-アクチンに優先的に結合
Alexa568 アンチマウス IgG	ライフテクノロジー	ズ A11004	ヤギのポリクローナル、1:500で使用
Alexa568 抗ウサギIgG	Life Technologies	A11011	ヤギのポリクローナル、1:500で使用
抗アセチル化 α-チューブリン	Sigma	T7451	マウス モノクローナル、1:500
で使用 抗リン酸化T287 CaMK-II	EMD Millipore	06-881	ウサギ ポリクローナル、1:20
抗総 CaMK-II	BD Biosciences で使用	611292	マウスモノクローナル、1:20エ
タノール	フィ	ッシャーS96857	ラボグレード、95%変性
鉗子	ファインサイエンスツール	11252-20	モン#5
ガラスカバースリップVWR		16004-330	#1 厚さ
顕微鏡スライドフィ	ッシャー12-550-15	標準ガラススライド
メタノール	フィ	ッシャーA411	庫に保管
マイクロ遠心チューブ	VWR	20170-038	キャップ付きチューブ、無菌ではない
正常なヤギ血清	ライフテクノロジー	ズ 16210-064	アリコート1mlチューブ、冷凍庫に保管
パラホルムアルデヒド	シグマ	P-6148	試薬グレード、結晶性
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	品質 生物学的	119-069-131	10xストック溶液またはラボで作られ
トリトンX-100	シグマ	BP-151	水中の10%溶液、RT
Tween-20	で保存 ライフテクノロジー	ズ85113	水中の10%溶液、
RTで保存 化合物顕微鏡	コン	E-600	振動のないテーブルC1
プラスにマウント 2レーザースキャン共焦点	ニコン	C1プラス	EZ-C1プログラムによって実行されますが、アップグレードは「エレメント」