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方法論記事

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

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DOI:

10.3791/53748

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2016年3月24日

 ,  , 
1ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of BioSciences, University of Melbourne

この記事について

サマリー

このプロトコルは、酵素(エンドキシラナーゼ)加水分解の前にREを2つのアミノベンザミドでタグ付けし、その後、質量分析(MS)および核磁気共鳴(NMR)を使用して得られたオリゴ糖を分析することにより、ヘテロキシランの還元末端(RE)および内部領域のグリコシル配列の構造特性評価に使用される特定の技術について説明しています。

要約

このプロトコルは、ヘテロキシランのグリコシル配列（単数または複数）を終了（RE）を低減し、内部領域の特徴付けのために使用される具体的な手法について説明します。脱糊小麦胚乳細胞壁は、アルコール不溶性残留物（AIR）1として単離し、順次水（W-ゾルFR）で抽出し、Ratnayake らによって記載されているように、1％のNaBH 4（KOH-ゾル金曜日）を含む1 M KOH ら （2014年）2。 2つの異なるアプローチは、（ 図1の概要を参照）を採用しています。最初に、インタクトなW-ゾルAXSは、元のRE主鎖糖残基にタグを2ABで処理し、次いで、それぞれ、オリゴ糖の還元2AB標識REと内部領域との混合物を生成するためのエンドキシラナーゼで処理しました。第2のアプローチでは、KOH、ゾルFRが最初に、続いて2ABで標識されたオリゴ糖の混合物を生成するために、エンドキシラナーゼで加水分解されます。両方から酵素的に放出（（非）タグ付けされた）オリゴ糖W-及びKOHゾルFRSは、MALDI-TOF-MS、RP-HPLC-ESI-QTOF-MSおよびESI-MS nの組み合わせを用いて実行されるその後のメチル化との両方の天然及びメチル化オリゴ糖の詳細な構造解析です。エンドキシラナーゼは、KOH、ゾルAXSもまた、アノマーの設定に関する情報を提供し、核磁気共鳴（NMR）によって特徴付けられる消化しました。これらの技術は、適切なエンドヒドロラーゼを用いた多糖の他のクラスに適用することができます。

概要

ヘテロキシランは、草の主壁とすべての被子植物3-6の二次壁の主要な非セルロース多糖類である多糖類のファミリーです。キシランの骨格は、その種類及びグリコシル（グルクロン酸（グルクロン酸）、アラビノース（ARAF））および非グリコシル（O-アセチル、フェルラ酸）の組織型、発生段階および種7に応じ残基の置換パターンが異なります。

小麦の壁は（ コムギ L.）の胚乳は、主にアラビノキシラン（AXS）（70％）と、（1→3）で構成されている（1→4）-β-D-グルカン（20％）、セルロースおよびheteromannansの少量で（2％ずつ）8。キシランバックボーンは、主に（主にO-2位およびより少ない程度にO-3位）置換モノおよびジ置換α-L-アラと（O-2およびO-3位）様々-未置換であってもよいですF残基9。ヘテロの還元末端（RE）（例えば、トウヒ（ ドイツトウヒ ））（例えば、 シロイヌナズナ ）双子葉植物からキシラン10と裸子植物11は、特徴的な四糖のグリコシル配列を含みます。 -β-D-XYL のp - （1→3）-α-L-RhaでのP - （1→2）-α-D-GalのP A-（1→4）-D-XYL pを。 （生物学的および工業用）ヘテロキシランの生合成と機能を理解するには、完全なタイプと置換のパターンだけでなく、還元末端（RE）のシーケンスを理解するためにキシランの骨格の配列を決定することが重要です。

端部（RE）とヘテロキシランの内部領域のグリコシル配列を低減する構造的特徴のために使用される特定の技術は、この原稿に記載されています。技術は、酵素（エンドキシラナーゼ）加水分解する前にヘテロキシラン鎖の還元末端（RE）（2アミノベンズアミド（2AB）で）タギングフォアに依存しています。特にRE配列決定のためのこのアプローチは、ました最初のニューヨーク研究所10,12-13によって報告されたが、現在は内部領域のシーケンシングを含むように拡張および分離のそのソースに関係なく、すべてのヘテロキシランにも等しく適用可能である確立された技術の組み合わせです。このアプローチは、（利用可能な）適切なエンドヒドロラーゼを用いた多糖の他のクラスに適用することができます。

説明したように、本 ​​研究では、脱糊小麦胚乳細胞壁は、アルコール不溶性残留物（AIR）として単離し、順次水（W-ゾルFR）で抽出し、1MのKOHを、1％のNaBH 4（KOH-ゾル金曜日）を含みますRatnayakeでら （2014年）2。 FRSは、次に、メチル化され、両方のネイティブとメチル化オリゴ糖の詳細な構造分析は高速液体クロマトグラフィーを用いて、MALDI-TOF-MSの組み合わせを用いて実行ESI-QTOF-MS結合さW-及びKOH、ゾルの両方から放出されたオリゴ糖RP C-18カラムを使用してオンラインクロマトグラフィー分離およびESI-MS nを。エンドキシラナーゼは、KOH、ゾルAXSは、核磁気共鳴（NMR）によって特徴づけられた消化しました。

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プロトコル

2 - アミノベンズアミドとのW-ゾルAXSの還元末端の1標識は、（RE）シュガー残渣（2AB）

  1. それらの蛍光誘導体多糖主鎖の還元末端を変換するために65℃で2時間、1 MのNaBH 3 CN（シアノ水素化ホウ素ナトリウム）（pHは5.5）の存在下で2AB（0.2 M）とW-ゾルAXSインキュベートします。
    注意：それは水と接触しているときのNaBH 3 CNが有毒シアン化ガスを放出するように、次のステップは、ドラフト内で行うべきです。
    1. 1 MのNaBH 3 CN溶液を調製するためにマイクロ遠心管（1.5mL）中（1mL）中のNaBH 3 CN（62.8 mg）を秤量し、水に溶解します。 65で加熱することにより、1 MのNaBH 3 CN溶液（1 ml）に2AB試薬（27.2 mg）を溶解  °C、10％酢酸でpHを5.5に反応混合物（0.2 M 2AB、1 MのNaBH 3 CN）のpHを調整し、。
    2. W-ように反応混合物を200μl（0.2 M 2AB、1 MのNaBH 3 CN）を追加しますキャップ付きガラス管におけるL AXS（1 mg）を、ボルテックスミキサーを用いて混合します。 65で2時間インキュベートします ドラフト内でCを°。 RTにサスペンションを冷却し、4巻を追加します。無水エタノールの。
    3. 多糖類を沈殿させるために冷蔵（4°C）O / N中の懸濁液を置きます。
    4. 遠心分離（1500×gで、10分、RT）、上清を除去します。各洗浄の間に遠心分離し、無水エタノール（4×）、アセトン（1×）およびメタノール（1×）で広範囲にペレットを洗浄。 40°CO / Nで真空乾燥しました。
      注：大規模な洗浄は、残留2ABを削除します。

2 AB標識W-ゾルAXSからのキシロオリゴ糖の2世代

  1. 2ABは、マイクロ遠心チューブ内の酢酸ナトリウム緩衝液（100mMの、pHが5）（1.5ミリリットル）の500μlのW-ゾルAXS（1 mg）を標識した溶解させます。エンドキシラナーゼの4単位（GH 11を、[M1]）を追加し、37℃でインキュベート  16時間Cを°。
  2. 反応MIXTを加熱することにより酵素活性を破壊します沸騰水浴中で10分間URE。 RTにサスペンションを冷却し、キャップ付きガラス管に移します。 4巻を追加します。無水エタノールおよび任意の未消化多糖類を沈殿させるために冷蔵（4°C）O / N中の懸濁液を置きます。
  3. 遠心分離（1,500×gで、10分間、RT）未消化多糖類（ペレット）を分離し、生成されたキシロオリゴ糖（上清）をエンドキシラナーゼします。きれいなガラス管に上清を除去し、温水浴（40℃）に配置します。
  4. エンドポイント体積（〜500μL）に、窒素ガス気流下でエタノールを蒸発させます。 4時間-80℃上清を凍結し、キシロオリゴ糖を回収するために凍結乾燥機で凍結した上清を乾燥させます。

3. KOH-ゾルAXSからのキシロオリゴ糖の生成と2ABラベリング

  1. （セクション2.1から2.4）のようにキシロオリゴ糖を生成するために、エンドキシラナーゼとKOH-ゾルAXS（GH 11、[M1]）を扱います。
  2. endoxトリート（セクション1.1.1-1.1.2）上記のようにylanaseは2ABの反応混合物（0.2 M 2AB、1 MのNaBH 3 CN）でKOH-ゾルAXSからキシロオリゴ糖を生成しました。
  3. きれいなガラス管に上清を除去し、温水浴（40℃）に配置します。エンドポイント体積（〜500μL）に、窒素ガス気流下でエタノールを蒸発させます。 4時間-80℃上清を凍結し、キシロオリゴ糖を回収するために凍結乾燥機で凍結した上清を乾燥させます。

4. MALDI-TOF-MS

  1. MALDIマトリックス溶液の調製
    1. チューブ（MALDIマトリックス溶液）中の0.1％ギ酸を含む50％のアセトニトリル（500mL）中に2,5-dihydroxbenzoic酸（DHB）の小さなスクープを追加します。それは迅速に溶解場合、DHBの別の小さなスコップを追加し、ボルテックスを用いて混合します。注：MALDI-マトリックス溶液の最適濃度は10μgの/μlである-1。
  2. MALDIターゲットプレートの調製
    1. aqueoを堆積させます私たちのオリゴ糖（ネイティブ）のサンプル（5〜10μgの）（W-ゾルおよび/またはKOH-ゾル）MALDIターゲットプレート上に。独立したチップを用いて0.3μlのMALDI-マトリックス溶液を加え、ピペッティングにより混合します。混合物を室温で乾燥することができます。
      注：適切に乾燥した試料は、スポットの中心に向かって指して長い針状結晶で構成する必要があります。デポジットはサンプルがあまりにも濃厚であるか、またはその塩からなることができるいずれかの粘着性および/またはべたつくであれば、そのような堆積物は、良好なスペクトルを生成する可能性は低いとサンプルをさらに精製する必要があります。
    2. MSソースにターゲットプレートを導入し、正（+ IVE）イオンモードで動作します。 70％を超えるにレーザーパワーを調整し、イオン源2でイオン源1と16.3キロボルトで19.0 kVのに加速電圧を調整します。 MALDI-ターゲットプレート上のサンプルスポットを選択して、レーザーショットを開始し、開始をクリックします。
      注意：ターゲットのすべての領域は、信号を得られません。特定のスポットのみのいずれかに起因するいくつかのレーザーショットのための信号を与えますサンプル/マトリックス混合物または結晶の特性の枯渇。
      1. 良好な信号対雑音比を得るために取得し、平均約200ランダムスペクトル中にターゲットの異なる領域にレーザーを移動します。

5. ESI-QTOF-MS

  1. 3.5μmのビーズ; RPのC-18カラム（75μmのX 150ミリメートルを使用してオンラインクロマトグラフ分離して飛行時間（QTOF）MS機器を四重極エレクトロスプレーイオン化（ESI）と結合されたナノHPLCを使用して、エンドキシラナーゼ、生成されたオリゴ糖（ネイティブ）を分析サイズ）。
    1. バイアルにエンドキシラナーゼが生成した水性オリゴ糖の混合物を移し、HPLCオートサンプラーに置きます。プログラム60分間にわたって、それぞれの移動相、0.1％（v / v）の水中のギ酸およびアセトニトリル中の0.1％（v / v）のギ酸を5-80％で溶出勾配を、。
    2. 0.2μL/分の流量を調整します。スキャン範囲内で正イオンモードを調整します300-1,600 のm / zと0.5のスキャンのスキャン速度の/次のように、第2のESI源条件を使用：カーテンガス10、GS1 4、ソース温度100℃で、イオンスプレー電圧2,300 V、デクラスタリング電位50をV.ランLCクロマトグラフプログラムと溶出オリゴ糖。得られたトータルイオンクロマトグラム（TIC）は、ソフトウェアによって自動的に保存されます。
    3. 保存TICを開き、抽出クロマトグラムを選択します。コマンドラインで期待塊（ 例えば、271、403、535、667、799および931メートル/ z）を入力します。入力してくださいクリックしてクロマトグラムをスキャンします。製造元の指示14に従って、ソフトウェアを使用してESI-QTOF MSクロマトグラムデータの選択イオンスキャンを処理します。

6. ESI-MS nは

  1. シリンジを用いてナノスプレーチップに50％アセトニトリル中のサンプルごとのO-メチル化オリゴ糖の1から2μLを挿入（Pettolino ら 1によって記載されるようにメチル化）。トリムMSに取り付けられた個別のナノスプレーホルダーに適合するようにガラスカッターを使用してナノスプレーチップ。
  2. 正への期待質量範囲（200-1,500 メートル/ z）及びカーテンガス10、イオンスプレー電圧を1900 Vでの極性に応じて質量を設定します。
  3. 関連するウィンドウを開くには、[取得]ボタンを押して、全イオンスキャン（ESI-MS 1）を得るために、データファイル名を入力します。その後、STOPボタンを押してください。
  4. 関心のピークを断片化するプロダクトイオンからのスキャンタイプを変更します。質量範囲（200〜900メートル/ z）を断片化し、調整するために関心の質量（ 例えば、885メートル/ z）を入力します。取得ボタンを押して、親イオンの全体の断片化（885メートル/ z）を達成し、フラグメントイオンスキャン（ESI-MS 2）を取得する（アップおよび/ ​​またはダウン化合物]タブ内の）衝突エネルギーを調整します。
  5. 関心のフラグメントイオン（ 例えば、711メートル/ z）の質量を入力し、質量範囲（200〜720メートル/ z）を調整します。取得ボタンANを押しますD前駆体イオン（711メートル/ z）の全体の断片化を達成し、フラグメントイオンスキャン（ESI-MS 3）を取得する衝突エネルギーを調整します。

7. H 1 NMR分光法

  1. プラスチック試験管（15ミリリットル）中2 O（1.0ミリリットル、99.9％）Dにオリゴ糖のエンドキシラナーゼ生成混合物（KOH-ゾル、天然型）（〜500μgの）を溶解します。 4時間-80℃で、懸濁液を凍結し、キシロオリゴ糖を回収するために凍結乾燥機で凍結されたサスペンションを乾燥させます。
  2. 完全にD 2 OとH 2 Oを交換するために二度7.1を繰り返します
  3. D 2 O（0.6ミリリットル、99.9％）で乾燥したオリゴ糖を溶解し、内部標準としてアセトン0.5μlの（D 2 O中の5％）を追加します。 NMR試料管に重水素化オリゴ糖を転送します。
  4. トップによって試料を含むNMRチューブを保持し、プラスチック製のスピナーにサンプル管を挿入します。サンプル深度ゲージでスピナーを置きます。膿サンプルの頂部および底部の深さゲージの中心線が等しいことを保証するために、試料の深さを調整するために、サンプルチューブをH又は引きます。
  5. 深さゲージを取り外し、クライオプローブを備えた600 MHzのNMR分光計に取り付けたオートサンプラーにサンプルを挿入します。
  6. ログインとオープン分光器制御ソフトウェア。サンプルファイル名を入力します。既存のデータセットを開き、新しい名前でそれを保存するために「EDC」コマンドを使用します。オートサンプラにサンプルの位置番号を入力し、「ENTER」キーを押します。
    注：それは、プローブの上部に配置されます磁石ボアに優しく試料管をドロップします「ENTER」ボタンを押します。
  7. コマンドラインで「EDTE」と入力して所望のサンプル温度を設定します。次のステップに進む前に、所望の値に到達するために試料温度を待ちます。入力したコマンドラインで「ロック」と、適切な溶媒（D 2 O）を選択します。 ＆＃を待ち34;ウィンドウの下部に表示されるように、完成した」というメッセージをロックします。
  8. コマンドラインで「atmm」と入力し、atmmメニューバーの上部にある「最適化」をクリックします。選択されたチャネル（この場合は1 H）のためのプローブのチューニングおよびマッチングのために開始を選択します。
  9. 均一な磁場は、コマンドラインで「ZG」と入力して、Enterによってsample.Acquireの周りに信号を得られるまで微調整が磁場に作られていたシミングプロセスのためのコマンドラインで「topshim」と入力します。
  10. 2.225 ppmのアセトンの内部標準を基準にして1 H化学シフトとメーカーの指示に従って、ソフトウェア15を使用してスペクトルを分析します。

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結果

ら Ratnayakeから、2AB標識W-ゾルAXSのエンドキシラナーゼ消化は2AB標識REオリゴ糖と（2ABラベルなし）未標識の一連キシラン鎖（ 図1の内部領域由来のオリゴ糖の混合物を生成します。 2）。クロマトグラフィー手法一連のその後の異性体の複雑な混合物を分画するために使用されます。最後に、MSの技術は、その後、MS n個技術により配列決定された異性体の構造を同定するために利用されます。ここでは、むしろ包括的なよりも、アプローチの例を代表を提示します。

2AB標識された天然のW-ゾルAXS（ 図2A）由来のオリゴ糖のMALDI-TOF-MSスペクトルのシグナルは、標識されていない一連の表現のm / z 701、833、および965に非常に豊富な擬似分子イオンシリーズが挙げられます内部ニュートラル...

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ディスカッション

ほとんどのマトリックス相の細胞壁多糖類は、一見ランダムに植物種、発達段階および組織型3に応じて、非常に多様である（グリコシルおよび非グリコシル残基の両方を含む）の骨格を置換しています。多糖類は、第二の遺伝子産物であるので、それらの配列は、派生テンプレートされておらず、そのような彼らの配列決定のために、核酸およびタンパク質のために存在するとして単一の分析的アプローチは、したがって、ありません。精製された結合特異的加水分解酵素の利用可能性は、その後、クロマトグラフ分別することができるオリゴ糖の多糖を分解するための強力なツールを提供し、化学的および物理的な技術と組み合わせて使用​​される場合、完全に配列決定しました。課題は、その後、正常に対処することはまだある元の多糖類、配列1にこれらの複雑な混合物を再び組み立てることです。

ここでは、アプローチ（アプリケーションCAのその順序を記述しますnは構造的な還元末端（RE）の両方の特性評価およびヘテロキシランの内部領域のグリコシル配列（単数または複数）のための確立された酵素、化学的および物理的技術の統合に依存していること）...

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

>jove_content<このプロジェクトは、Commonwealth Scientific and Research OrganisationのFlagship Collaborative Research Programからの資金によって支援され、Food Futures Flagshipを通じてHigh Fibre Grains Clusterに提供されました。ABはまた、オーストラリア研究評議会(ARC)の助成金からARCセンターオブエクセレンス植物細胞壁（CE110001007)への支援を認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2 アミノベンズアミド (2AB)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)A89804
水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)247677危険、取り扱いに注意
ノ水素化ホウ素ナトリウム (NaBH3CN)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)156159危険、取り扱いには注意
endo-1,4-β-キシラナーゼM1(Trichoderma viride由来)(120101a)メガザイム(www.megazyme.com)E-XYTR1
重水素(D2O)Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com)151882
凍結乾燥機(CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plusカラム アジレント (2.1倍;100ミリメートル;1.8 µmビーズサイズ) 
MicroFlex マルディトフ MS  (モデル - MicroFlex LR)(Bruker Daltonics, Germany)(
ESI) -(QTOF) MS  (モデル#6520)(Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - イオントラップ (モデル#1100 HCT)(アジレント、カリフォルニア州パロアルト)。
Bruker Avance III 600 MHz -NMRBruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- ソフトウェア ブルカー 
GC-MS (型式 # 7890B)アジレント 
シア酸化

参考文献

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  15. Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
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  18. Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
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