構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

サマリー

T細胞免疫シナプスにおける糸状アクチンの流れ速度と方向性を調査するために、生細胞の超解像イメージングと全反射蛍光を組み合わせ、時空間画像相関分光法で定量化します。

要約

繊維状アクチンは運動性と、免疫細胞において、免疫学的シナプスとして知られている重要な細胞 - 細胞相互作用の形成を含む細胞プロセスの大部分において重要な役割を果たしています。 F-アクチンは、サブ膜性小胞のダイナミクスとタンパク質のクラスタリングを含む、細胞の膜に分子の分布を調節する役割を果たしていると推測されます。標準の光学顕微鏡技術が一般化し、回折限界の観測を行うことを可能にする一方で、クラスタリングと分子流を含む多くの細胞および分子事象は、これまでの標準的な光学顕微鏡の分解能以下の長さスケールでの集団で発生します。超解像の撮像方法構造化照明顕微鏡で全内部反射蛍光を組み合わせることによって、T細胞の免疫シナプスにおけるF-アクチンの二次元の分子流を記録しました。定量化resulを生成時空間画像相関分光法（STICS）を塗布し、速度ヒストグラムと流れ方向と大きさを表すベクトル・マップの形でTS。このプロトコルは、詳細のサブ回折レベルのフローベクトルを生成する超解像画像とSTICS技術の組み合わせを記載しています。この技術は、シナプス形成の際にT細胞の周囲全体に対称的に逆行し、求心あるアクチンの流れを確認しました。

概要

この実験の目的は、画像にあり、免疫学的シナプス（IS）形成中の流れの方向と大きさを確立するために、回折限界を超えて、T細胞を生きにfilamentous-（F-）アクチンの分子流を特徴付けます。この技術は、抗CD3-および抗CD28抗体でコーティングしたカバースリップを活性化する人工シナプスを形成したJurkat T細胞を画像化する、全内部反射蛍光（TIRF）モードでの構造化照明顕微鏡（SIM）を使用して行われます。 T細胞とその標的との間にある形; T細胞受容体（TCR）活性化の際に^1,2抗原提示細胞（APC）。これは、適応免疫系は、感染に対する免疫応答を生成するかどうかを決定するための最初のステップであるため、刺激に対する誤った応答の結果は、多くの疾患を引き起こす可能性があります。 T細胞APC相互作用の重要性は十分に立証されているが、成熟の役割（複数可）は、最初のTCR SI後のgnal内在化は、まだ完全には理解されるべきです。

細胞骨格は、TCR活性化（形質膜と細胞骨格アクチン^3,4に依存するシグナル伝達分子の制御での分子の動き）に連結された2つのプロセスを支援するために考えられているように、細胞骨格は、空間的及び時間的に再配置する方法を理解する手順を解明しますシナプス形成時の分子の再編成。 F-アクチンの逆流は、この転座は、信号停止やリサイクルのために不可欠であると考えられている、免疫学的シナプスの中心に向かってTCRクラスターを囲いすると考えられています。 T細胞活性化⁵の微妙なバランスを助けます。

標準的な蛍光顕微鏡法は、細胞 - 細胞相互作用を含む多くの生物学的事象についての洞察を提供し続けて柔軟なツールであるが、それは正確にDIFFRより近くに存在する複数のフルオロフォアを解決するためのシステムの能力によって制限され互いの行動制限（≈200nm）で。細胞内の多くの分子のイベントは、分子の密な集団を伴い、休止中または特定の刺激によりいずれかの動的再配置を示すように、従来の光学顕微鏡は、完全な画像を提供していません。

超解像画像を使用することは、研究者は、様々な技術を用いて、回折限界を回避することができました。 PALM及びSTORM ^6,7は約 20ナノメートルの精度で分子の位置を解決する能力を有している単一分子の局在顕微鏡（SMLM）のような、しかし、これらの技術は、多くのフレームの上に画像を構築し、長い取得時間に依存しています。一般に、これは修正されるべきサンプルを必要とするかの構造は、低移動度を示すするため、単一のフルオロフォアは、複数のポイントと誤解されていません。誘導放出の枯渇（STED）イメージングは、非常に選択的共焦点励起^8、必要なスキャンにより超解像を可能にするがアプローチは、ビューの全細胞のフィールド全体で遅くなることがあります。 STEDはまた、枯渇ビームのパワーの増加により高い解像度のために重要な光毒性を示します。

構造化照明顕微鏡（SIM ^{9）は、標準的な}蛍光顕微鏡の解像度を倍にすることのできる、これらの方法に代わるものを提供し、現在のSMLM技術よりも生細胞イメージングとの互換性です。これは、ビューの全細胞フィールドの広視野システムの低いレーザパワーを使用しています。取得速度を増加させ、標準的な蛍光団標識と互換性があります提供。 SIMの広視野性質はまた、<100nmの軸方向寸法における侵入深さで、非常に選択的励起のための全反射蛍光（TIRF）の利用が可能になります。

画像相関分光法（ICS）は、蛍光強度の変動を相関させる方法です。 ICSの進化。時空間イ​​ム年齢相関分光法（STICS ^10）は、時間と空間における細胞内の蛍光シグナルを相関させます。相関関数を経由して、遅れているフレーム内の周辺画素との画素強度を相関させることにより、情報が流れ速度や方向性について得られます。静的オブジェクトはSTICS分析を妨害しないように、不動のオブジェクトフィルタは、ピクセル強度の移動平均を減算することによって動作しており、実装されています。

ここに提示技術は、生細胞における分子流¹¹を定量するために、超解像顕微鏡データに適用される画像相関分光法の最初の実証であると信じられています。この方法は、STICS分析^{12を介して} Fアクチンフローの回折限界画像化を改善し、光の回折限界を超えた空間分解能で取得されたデータから、生細胞中で二次元の分子流を決定したい研究に適するであろう。

プロトコル

注：画像の前日1と2テイク場所をステージ。イメージングの日前またはで使用するすべてのメディアやサプリメントが平衡化されていることを確認します。平衡は、5％CO ₂に設定したインキュベーター中で37℃にメディアやサプリメントの加温することによって達成されます。全ての細胞培養作業やカバーガラスメッキ工程は層流フードの下で無菌状態で行われます。

1.細胞トランスフェクション

1. 蛍光融合は、F-アクチンGFP標識及びイメージングのために構築コードするプラスミドを用いた実験の前に24時間を画像化するT細胞をトランスフェクション。注：細胞トランスフェクションの前に24時間を分割する必要があります（前の画像へ48時間）は、細胞が最適な健康状態で、それらの対数増殖期にあることを確認します。
   1. 平衡化インキュベーターに6ウェルプレートの1ウェルにRPMIサプリメントの5ミリリットル（RPMI 1640 + 10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン（オプション））を配置します。
   2. 2×10 ⁷のT細胞のカルトをペレット5分間327×gで遠心分離管を使用して、RPMIサプリメントで37°C +5％CO ₂でured及び予熱したエレクトロポレーション培地の等量で洗います。注：エレクトロ媒体（消耗品を参照）緩衝液および補助剤を含有する低血清培地です。
   3. 5分間327×gで再ペレット化した後、エレクトロポレーションメディア500μlの細胞を再懸濁し、ゆっくりと、キュベットに追加の標識F-アクチンのためのPCRグレードのdH _{2 O中に} 5μgのプラスミドを追加します。
   4. 静かに電気のアーク放電を引き起こす可能性があり、メディア内の細胞を均一に分配するために、メディア内の気泡の除去を確実にするためにフードワークスペース上のキュベットをタップします。
   5. 290Ωへのエレクトロポレーション装置と設定された電圧300 Vへと容量をオンにします。 20ミリ秒のための指数関数的減衰を使用してエレクトロポレーションサンプル。注：最適化は、異なるセル、異なるプラスミド構築のために必要とされてもよいです。
   6. トランスフェクションのプロトコルは、一旦続行する前に、完全な1分間氷上で、店舗の細胞。
   7. 慎重にステップ1.1.1から平衡化したRPMIサプリメントの5 mLを含む6ウェルプレートにキュベットから細胞を転送します。
   8. 37°C〜+ _5％CO 2で細胞O / Nインキュベートします。

2.コートカバーガラスとプリ暖かいイメージングサプリメント

1. 抗体で被覆カバースリップは、T細胞刺激を誘導します。
   1. コー​​ト200μlのPBS中1μg/ mlのαCD3およびαCD28で8ウェルカバースリップの各チャンバ。
   2. 4°のCO / Nで保存します。あるいはまた、コートカバースリップを2時間前にカバースリップに温度変化を最小にすることによって画像化プロセス中にドリフトを低減するために画像化し、37℃のインキュベーター中で維持します。
2. 0.1μmのサブ回折蛍光マイクロスフェアとカバーガラスの試験サンプルを作成します。
   1. 塊を避けるために、ビーズの渦原液。
   2. 番目の新しい、きれいなカバースリップオン（製造者の指示に従ってなど）表面にステップ2.1.1で使用されているもの、ピペット5μlの蛍光マイクロスフェア原液として電子と同じタイプ。
   3. ピペットチップでカバーガラスの上にマイクロスフェア液を広げます。
   4. PBSのようなメディアをマウントする200μLを適用した後、乾燥することができます。
      注：封入剤は、イメージング、細胞サンプルに使用することを一致している必要があります。
3. HBSSを平衡化、37℃+ _5％CO 2でするように事前に暖かいO / N培養器に配置することにより、遠心分離管中（以下、「HBSSサプリメント」と呼ば+ 20mMのHEPES、）。
   注：HEPESを添加すると、CO ₂の入力とのインキュベーションチャンバーを使用して、この補充をスキップする場合、CO _{2をバッファリング}することです。

3.顕微鏡セットアップ

1. TIRF-SIMの顕微鏡のステージトップインキュベーターをオンにして、完全に発熱体のベースをカバーするために顕微鏡のリザーバ内に十分な蒸留水を配置します。水が電子を許可します37℃にquilibrate。また、37℃に設定した対物レンズに加熱カラーを追加します。
   注：セットアップの感度に、これらの手順は非常に前の晩に行われている原因の光学部品は、安定した温度での撮像の前にあります。
2. 顕微鏡の光路にTIRF 488互換性のある格子ブロックを配置し、所定の位置に固定します。
   1. TIRF-SIMモードの正しい光路に係合するように、それぞれのレーザベッド、顕微鏡ステージ上で「シングル」の位置にチャネルモードとファイバケーブルを切り替えます。注：このステップをスキップするソフトウェアのウィンドウ内のエラー（ 図1A）につながります。
3. すべての顕微鏡とコンピュータのコンポーネントの電源をオンにし、取得制御ソフトウェアを開きます。
   1. OCパネルを開き、チタンパッド、N-SIMパッドとND取得窓（ 図1B）。 「OCパネル」でオプションを選択して「TIRF 488 '（ 図2B、黄色の矢印）。
   2. N-SIMパッド]ウィンドウで、「TIRF-SIM」と「移動」の設定（ 図2C、黄色の矢印）を選択します。ドロップダウンメニューから[設定]ボタン（ 図1C、黄色のボックス）を選択して、「（100X TIRFの488nmのための）TIRF 488」を選択し、「適用」と「OK」を押します。
   3. フレームレート50ミリ秒、読み出しモード、EMゲイン14ビットで3 MHzであり、1の変換ゲインとEMゲイン乗算器300（ 図1C、緑色のボックス）： 'にDU897設定」内のカメラの設定を設定します。
      注意：フレームレートの配慮のための代表的な結果を参照してください。
   4. 「N-SIMパッド」で、100×1.49 NA CFIアポクロマートTIRF目的を選択することにより、TIRF-SIM用顕微鏡の照明を校正10％に488nmのレーザパワーをオンにします。
      注：原画像の画素サイズは、ビューの512×512ピクセルのフィールドで、60 nmです。
   5. ほこりや油を除去するためにレンズティッシュを使用して、対物レンズを清掃してください。
4. TIRF-SIM焦点面を検索します。
   1. 可能な限り低いz面での目的で開始します。目的にレンズ油の滴を配置し、顕微鏡ステージにステップ2.2からの蛍光マイクロスフェアのサンプルを追加します。
   2. 顕微鏡のボディに位置パーフェクトフォーカスシステム（PFS）機能を選択します。
   3. PFSボタンが焦点面に到達したことを確認するために点滅しなくなるまでゆっくりz平面を通じて目的を上に移動。
   4. 制御ソフトウェア、画像PFSマイクロマニピュレーターホイールを使用して作られた最終調整のためのマイクロスフェアの「ライブ」ビューに切り替えます。
5. 75 nmのエバネッセント波以上の無焦点外の蛍光発光との均一な照明を観察します。
   注：確認構造化照明は、蛍光ミクロスフェアのサンプルから変動する照明パターンを観察することによって満たされます。
6. 蛍光ミクロスフェアのサンプルを測定し、改善されたイメージングRESOLUTを定量化強度プロファイルの半値全幅（FWHM）を観察することによってイオン。
   1. NIS-N-SIM分析モジュールがインストールされて、分析ソフトウェア（v4.20.01）を開き、「アプリケーション」を選択します - > '表示N-SIMウィンドウ」。
   2. TIRF-SIMデータセット（ 図2）が1に設定された照明モジュレーションコントラスト（IMC）と高解像度の雑音抑圧（HRNS）と、30のピクセルサイズで1,024×1024画素の再構成画像を生成するために、微小球サンプル画像を再構成しますNM。
   3. 1ピクセル（ 図3A、黄色のボックス）の幅のラインプロファイルツールを使用して、単一の微小球の中心を通る線を引きます。
   4. FWHMボタン（ 図3B、黄色のボックス）を選択し、その強度の最小値が続くガウス分布の最大強度、でクリックします。
   5. ミクロスフェアのFWHMを確認100nmで（ 図3C）の範囲です。注：解像度ACHをievedイメージング生物学的サンプルは、標識効率およびバックグラウンド蛍光からの信号対雑音比に応じて変化します。

イメージング4.サンプル調製

1. カバースリップの準備。
   1. 冷蔵庫やインキュベーターからステップ2.1からαCDコーティングしたカバースリップを取得し、各ウェルからαCD3およびαCD28を含有するPBSを除去します。
   2. ステップ2.3からカバースリップの各ウェルに予め温めておいたHBSSサプリメントの200μLを加えます。最小限のαCD3およびαCD28を溶液中に放置されていることを確認するために洗浄し、削除します。 HBSSサプリメントの別の200μlをカバーガラスのウェルに追加します。
   3. 石油や微粒子を除去するためにレンズティッシュでカバースリップの下側を清掃してください。
2. ステップ3.4に見られるような顕微鏡ステージ上の位置カバーガラスとは、PFSのz平面を使用してカバースリップのTIRF焦点面を見つけます。
3. 細胞調製物。
   1. メディアコンの200μLをピペットマイクロ遠心チューブにステップ1.1.8からトランスフェクトされた細胞をtaining。
   2. 20秒間268×gでマイクロ遠心機で細胞をペレット化し、細胞培地を除去します。
   3. ステップ2.3から200μlの予め温めたHBSSサプリメントで細胞を再懸濁し。

5.イメージング細胞

1. 顕微鏡に細胞含有HBSSサプリメントを取り、優しく井戸の一つに200μLをピペット。
2. （PFSモードで）カバーガラスでTIRF焦点面に残っている間、カバーガラスに近づい蛍光細胞を追跡するために、顕微鏡の接眼レンズと落射蛍光照明を使用しています。
3. 細胞がカバーガラスに着陸すると、モニタに画像を持参し、細胞を確認するために、N-SIMパッドで「ライブ」モードに切り替えて、コンピュータ画面上の焦点です。
4. クリックして、ND取得ウィンドウを開き、「時間」タブを選択し、時間のコースを記録するには遅延なし、「所要時間」に「追加」と「間隔」設定10分に、1に設定される「ループ」。
   注：時間は、対象のプロセスに応じて変更することができます。 「遅延なし」で撮影したときSTICSソフトウェアは≈10フレームの画像スタックとの定量的な結果を抽出することができます。
5. ビーズサンプルと同一の取得設定では、ND取得窓に「今すぐ実行」を選択することにより、データの記録を開始します。

6. SIM画像を再構成します

1. イメージングの完了後、インストールされたNIS-N-SIM分析モジュールと、解析ソフトウェア（v4.20.01）を開き、「アプリケーション」を選択します - > '表示N-SIMウィンドウを」。
2. TIRF-SIMデータセットのために1に設定照明モジュレーションコントラスト（IMC）と高解像度の雑音抑圧（HRNS）（ 図2）と、1つ（またはバッチツール使用して複数の）再構成されたSIMの画像を生成するために生のSIMファイルを再構築します。
3. 再構成されたファイルを確認することで示さ30nmのピクセルサイズを有しています画像のステータスバー。
   注意：ピクセルサイズがSTICS分析に影響を与えませんが、ピクセル間の空間的相関を確保するためにPSFの空間分解能よりも寸法が少なくとも2倍小さくする必要があります。
4. STICS分析のための準備ができて、.TIFFファイルとしてデータをエクスポートします。

7. STICS分析

1. （;補足情報として利用できるワ​​イズマンラボ）STIC（C）S Matlabのソフトウェアパッケージをダウンロードし、解凍します。スクリプトstics_vectormapping.mは、単一チャネルSTICS分析の中核であり、コードの最初の30行は、マニュアルのセクション2.1で定義された入力パラメータを定義するために使用されています。このスクリプトを開き、TIRF-SIMデータ分析のための入力パラメータを定義します。これは、マニュアルの付録で説明するように、また、ローカルマシンMatlabのパスにサブフォルダとSTIC（C）Sフォルダを追加することが提案されています。
   1. コー​​ドの対応する行を編集して、データ分析のための入力パラメータを定義します
   2. ANAを実行するにはTIRF-SIMデータの溶解は、1ベクトルマップを生成ベクトルマップの時系列を得るためにフレームの最大数と1のライン32の時間的シフトをライン31に一時的なサブ領域に一時的なパラメータを設定するためにこれらのパラメータを変化させます。
   3. 不動除去フィルタについては、「移動平均」にパラメータ「フィルタリング」（23行目）を設定し、21に「MoveAverage 'パラメータ（ライン24）を設定します。
      注：それは分析されているフレームから直列フレームを減算に基づいているこの設定は、より遅く移動すると大きな蛍光信号のために働くことが示されています。
   4. 変更する行は33〜38は、出力ファイルと出力ベクトルマップのタイトルの名前と同様に、出力ディレクトリのパスを設定し、ベクトル地図画像を保存する必要がどのような形式で定義します。

ピクセルサイズ（ミクロン）	0.03ミクロン	19行目
フレームレート（秒）	1秒	ライン20
最大遅延時間（フレーム）	20フレーム	21行目
小区域のサイズ（ピクセル）	8ピクセル	29行目
圏の間隔（ピクセル）	1ピクセル	30行目

2. Matlabのエディタウィンドウにスクリプトrun1ChannelSTICSを開きます。ラインこのスクリプトの1-23を実行して、画像シリーズをロードします。
   注：このスクリプトは、ロードし、前処理画像シリーズ、ベクトルマップと速度のヒストグラムをプロットし、多くのファイルのバッチ処理を実行するために使用することができます。必要な場合は、このスクリプトの行24〜26を用いて、関心領域の画像をトリミングしてください。
   1. STICS分析を開始するrun1ChannelSTICSのライン29-35を実行します。プロンプトが表示されたら、必要に応じて、関心領域（ROI）の特定の領域を示すためにポリゴンを選択します。 STICSは、これらの再解析したときに、境界アーティファクトが発生すると、ROIは、セル端と重なっていないことを確認してくださいgions。
   2. ベクトルマップを表示する行38-52を実行します。速度の大きさのヒストグラムをプロットするには、ライン53から72を実行します。

結果

顕微鏡の設定

成功したすべてを達成した後、研究者は、T細胞のシナプス（動画1）におけるF-アクチンの流れの構造化照明（SIM）イメージングを達成し、時空間画像相関分光法（ 図^4〜11）で、この分子流を定量化しています繰り返します。画像を記録する前に、サンプルの照明を確保する9原画像全体で均一であり、モアレ縞の形でその構造化照明は、試料（ 図5）で観察され、これらは両方の指標であるカバーガラスは、ステージ上で平坦であり、TIRF- SIMセットアップが適切に位置合わせされます。

これは、細胞が実験中に可能な限り健康を維持確保するために、低レーザパワー（≤10％）を維持することが重要です。蛍光式があっても、tの最適化の後、低い場合彼はステップをエレク...

ディスカッション

この技術は、画像の研究を可能にし、蛍光を発現する細胞において、以前に解決できない詳細を定量化します。我々の結果では、F-アクチンは、T細胞である、細胞内の中心に向かって細胞周囲から対称的に流れることを示しています。これらの知見は、1次元ラインプロファイルカイモグラフ^データ 13からの以前の結果と一致しており、2D超解像データ解析の能力を拡張します。

提示された技術は、経時的な単一の1次元の線を介して蛍光強度の変動をプロットに制限されカイモグラフイメージングからの進行です。比較では、現在の技術では、抽出された方向性と速度の両方で全細胞分子流の定量化を可能にします。スペックルイメージングはまた、2D環境内アクチン動態^14を示したが、スペックル技術は、正確なラベリング密度の難しさによって制限されるだけアクチンの亜集団を可視化することができ。

これらの結果を達成するために最も重要な手順は、SIM顕微鏡光学系および格子パターンの研究と整合することによって使用される特定の細胞のトランスフェクショ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
消耗品:
Jurkat E6.1細胞	APCC	ATTC TIB-152
RPMI	Life Technologies	21875-091
FBS	Sigma	F7524-500ML
ペニシリン-ストレプロマイシン	ライフテクノロジー	ズ15140-122
HBSS	Life Technologies	14025-050
HEPES	Life Technologies	15630-056
#1.5 8ウェルLabtekカバースリップ	NUNC、Labtek	155409
LifeAct GFPコンストラクト	同上	60101
OptiMem	Life Technologies	51985-042
抗CD3	ケンブリッジバイオサイエンス	317315
anti-CD28	BD Bioscience / Insight Biotechnology	555725
PBS	Life Technologies	20012-019
レンズオイル
名前	Company	カタログ番号	コメント
Equipment:
Gene Pulsar Xcell System	BioRad	165-2660
Cuvette (0.4cm)	BioRad	165-2088
遠心分離機 (5810R)	Eppendorf	5805 000.327
遠心分離機 (ヘレウス)	バイオフュージ ピコ	75003235
6 ウェルプレート	コーニング	3516
ステージトップインキュベーター	東海ヒット	INUH-TIZSH
ニコン N-SIM 顕微鏡	ニコン	コンタクト社
コンアナライズソフトウェア	ニコン	コンタクト社
インキュベーター (190D)	LEEC	お問い合わせ会社