指向進化方法でサッカロマイセス・セレビシエ：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

監督分子進化は、酵素^1、2を設計するため、堅牢な高速かつ信頼性の高い方法である。ランダム変異、組換えおよびスクリーニングの反復ラウンドを通じて、酵素の改良されたバージョンは、非天然で、小説の反応で、新しい基板に作用を生成することができます環境は、さらに新たな代謝目標^3-5を達成するために、細胞を支援します。指向性進化に使用されたホストのうち、ビール酵母サッカロマイセス・セレビシエは、原核生物のカウンターパート^6,7でそうでなければ利用できない複雑な真核生物タンパク質の機能発現のためのソリューションのレパートリーを提供しています。

細胞生物学研究で徹底的用い、この小さな真核生物のモデルは、指向進化⁸によって酵素を設計するための重要な特徴であるその全ての翻訳後修飾、操作および形質転換効率の容易さの点で多くの利点を有します。また、高周波S.における相同DNA組換えのその効率的なプルーフリーディング装置に結合されたセレビシエは、複雑な人工的な経路^9-12への単一の酵素とは ​​異なるシステムの進化を促進する、 生体内でのライブラリの作成 ​​および遺伝子アセンブリのための可能性の広い配列を開きます。私たちの研究室では、酵母における異なるリグニナーゼの分子進化（天然木の崩壊の際にリグニンの分解に関与する酸化還元酵素^）13-14のためのツールと戦略を設計する過去十年間を費やしてきました。この通信では、我々は準備するための詳細なプロトコルとS.の画面変異体ライブラリーを提示します、簡単に他の多くの酵素に変換することができます-モデルflavooxidase、 -アリール-アルコールオキシダーゼ（AAO ^15）のためセレビシエ 。酵母細胞装置^16、によって支援：（相同in vivo でグループ化することによって、変異原性組織再結合過程モーフィング）プロトコルは、集束指向進化の方法を含みます培養液¹⁷中に分泌AAO活性を検出するために、フェントン反応に基づいて、ダ非常に敏感なスクリーニングアッセイ。

1.変異体ライブラリーの構築

1. 選択領域は、利用できる結晶構造または相同性モデル¹⁸に基づいて計算アルゴリズムの助けを借りて、モーフィングに供されます。
   1. ここでは、ランダム突然変異誘発および組み換え（メット[α1] -Val109、Phe392-Gln566）、高忠実度PCRによる遺伝子（844塩基対）の残りの部分を増幅しながら（ 図1）のためのエリンギからAAOの2つの領域をターゲットにしています。
      注：いくつかのセグメントは独立に、または組み合わせた方法¹⁶にモーフィングによって研究することができます。
2. 突然変異誘発PCRによって標的領域を増幅します。定義された領域のPCR反応を重畳することにより、セグメント間の領域（約50塩基対ずつ）のオーバーラップを作成します。
   1. DNAテンプレート（0.92 ngの/μl）を含む50μlの最終容量中の標的セグメントの変異原性PCRを準備し、90 nMのオリゴセンス（セグメントM-IIのためのセグメントMIとAAO-BP用RMLN）、90 nMのAntisenseプライマー（セグメントM-IIのためのセグメントMIとRMLCためのAAO-92C）、0.3mMのdNTP類（0.075 mMの各）、3％（v / v）ジメチルスルホキシド（DMSO）、1.5のMgCl _2、0.05ミリモルのMnCl ₂および0.05 U /μlのTaq DNA ポリメラーゼ 。プライマー配列は、図1に詳述されています。
   2. 以下のPCRプログラムを使用してください：2分（1サイクル）、95℃を。 45秒、45秒、50℃、45秒間74℃（28サイクル）95℃、そして10分（1サイクル）74°C。
3. 超高忠実度ポリメラーゼで非変異領域を増幅し、変異原性セグメントおよび/または線状化ベクターのオーバーハングを重ね、対応する領域を含みます。
   1. 含む50μlの最終容量で反応混合物を準備します。DNA鋳型（0.2 ngの/μl）を、250 nMのオリゴセンスHFF、250 nMのオリゴアンチセンスHFR、0.8mMのdNTP類（0.2 mMの各）を、3％（v / v）ジメチルスルホキシド（DMSO）およびDNAポリメラーゼではiProof 0.02 U /μlの。プライマー配列は、中に詳述されています<強い>図1。
   2. 以下のPCRプログラムを使用してください：30秒（1サイクル）98℃を。 10秒間、98℃、55℃45秒（28サイクル）のための25秒、72℃;そして10分（1サイクル）72℃。
      注：43 bpの（プラスミド-M1領域）の1.2と1.3の重なりに記載された条件では、 46塩基対（M1地域-HF領域）。 47塩基対（HF地域-M2領域）および61塩基対（M2 region-プラスミド）は酵母においてインビボスプライシングに有利になるように（ 図1）に設計されています。
   3. 製造業者のプロトコルに従って、商業用ゲル抽出キットを用いて、すべてのPCR断片（変異原性および非変異）を精製します。
4. 約50塩基対のフランキング領域は、標的遺伝子の5 '末端および3'末端に相同であるが作成されるように、ベクターを線状化。
   1. 2μgのDNA、7.5 U のBam HI、7.5 U のXhoI、バッファBaの 20μgのBSAおよび2μLを含む線形化反応混合物を準備します20μlの最終容量中メートルHI 10倍。
   2. 2時間40分間37℃で反応混合物をインキュベートします。その後、80℃で20分間不活性化を進めます。
5. 残留環状プラスミド（ 図2）の混入を避けるために、アガロースゲル抽出により線状化ベクターを精製します。
   1. 同様に隣接するだけでなく、レポーターで反応混合物のアリコート（5μl）を：セミ分取低融点アガロースゲル（V 0.75％、ワット）のメガウェルに消化反応ミックスをロードします。
   2. ランDNA電気泳動（電極間の5 V / cmで、4ᵒC）とは、メガウェルに対応したアガロースゲルを分離し、1×TAE中4ᵒCでそれを保存します。
   3. 分子量ラダーと記者とのレーンを染色。 UV光の下でバンドを可視化。ニック線状化ベクターの場所の位置。
      注：精製線形化ベクターの品質がcritiであるよう酵母で成功組換えおよびアセンブリのための校正係数、セミ分取のDNA電気泳動用ゲル染色を避けます。ゲル抽出用染料およびUV照射の使用は、 インビボ組換えの効率を損なう、DNAベクターの安定性に影響を及ぼし得ます。毒性EtBrを染料の代わりに、ゲルレッドおよびSYBR染料は、一般に、ゲル染色のために使用されます。
   4. それを単離することができるように、UV光の不存在下で、染色されたレポーターレーンにニックのガイダンスを使用して、メガウェル断片で線状化ベクターを識別する。
   5. アガロースから線状化ベクターを抽出し、製造業者のプロトコルに従って、商業用ゲル抽出キットを用いて、それを精製します。
      注：抗生物質や栄養要求性マーカーと使用高コピーエピソームシャトルベクター：この例では、酵母GAL1プロモーターの制御下で、ウラシル独立し、アンピシリン耐性pJRoC30ベクトルを採用。
6. 等モルマイルを準備PCR断片の固定装置および2で線状化ベクターと混ぜる：線状化プラスミドの無未満100 ngので、1の比（等モルのライブラリ/オープンベクトルのテスト異なる比率は、良好な変換収率を達成するために）。
   1. それらの濃度および純度を決定するために、260 nmおよび280 nmでのPCRフラグメントの吸光度および線状化ベクターを測定します。
7. 商業酵母形質転換キットを用いてDNA混合物で酵母コンピテント細胞を形質転換製造業者の指示に従って（供給するための表を参照のこと ）。
   1. ここでは、欠損およびURA3プロテアーゼを使用^-依存S.セレビシエ株、BJ5465。 （下記参照）スクリーニング時に内部標準として親の環状ベクターで細胞を形質転換します。また、PCR断片の不存在下で線状化ベクターを形質転換することにより、背景をチェックしてください。
      注：最初の低分泌レベルを検出する場合には、Sを使用しBJ5465のようなセレビシエプロテアーゼ欠損株は、培養上清中の活性タンパク質の蓄積を促進します。標的酵素は、高グリコシルを受ける場合は、グリコシル化欠損株（小さ ​​いマンノースオリゴマーを装着することができるだけである例えば、ΔのKRE2）の使用が適切なオプションである可能性があります。
8. プレートは、SCドロップアウトプレート上の細胞を形質転換し、3日間30℃でそれらをインキュベートします。プレート（ウラシルを補充したSCドロップアウトプレート上）URA3 ^- S.スクリーニングのための陰性対照として、プラスミドを欠くセレビシエ細胞（下記参照）。

スクリーニングアッセイ2.ハイスループット（図3）

1. ピペットロボットの助けを借りて、ウェルあたり50μlの最少培地で（2,000クローンのライブラリーを分析するために23プレート）を滅菌96ウェルプレートの適切な数を埋めます。
2. プレートアウトSC-dropから個々のコロニーを選択し、96ウェルプレートに転送。
   1. S. ^-各プレートには、URA3でH1内部標準と同様に親のタイプと列番号6に接種陰性対照としてプラスミドなしでセレビシエ細胞（SC培地にウラシルを補いました）。
      注意：まあH1はウラシルを補充し、ドロップアウトメディアと特異的に充填されています。ウェル細胞を含まない培地を含むブランクもまた、追加の無菌対照として調製することができます。
3. 彼らのふたでプレートをカバーし、パラフィルムでラップ。 30°C、湿度の高いシェーカーで225rpmで、80％の相対湿度で48時間プレートをインキュベートします。
4. パラフィルムを外し、分注ロボットの助けを借りて、各ウェルに発現培地160μlを添加、プレートを再密封し、さらに24時間のためにそれらをインキュベートします。
   注：他の場所で¹⁹報告されているように最小培地および発現培地を調製します。分泌レベルは、T、およびそれに応じて研究中の遺伝子に応じて変えることができます彼インキュベーション時間は、すべてのウェルにおける細胞増殖を同期させるために、それぞれの場合に最適化されなければなりません。
5. 4℃で10分間、2,800×gで遠心分離プレート（マスタープレート）。
6. 転送ロボットマルチステーションを処理液を用いてレプリカプレートにマスタープレート中のウェルから20μlの上清。
   一般的に酵母中での異種発現のために使用されるシグナルペプチドによって標的タンパク質の天然のシグナルペプチドを交換することをお勧めし酵素の分泌を有利にする（ 例えば、α因子プレプロリーダー、SからK ₁キラートキシンの指導者注： セレビシエ 、または両方のペプチド^13）のさえキメラバージョン。代替的に、天然のシグナルペプチドは、排他的に、酵母での分泌のために進化することができます。
7. ピペッティングロボットの助けを借りて、100 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0中の2mM のp -methoxybenzylalcohol20μlのを追加します。 96私たちと簡単にプレートをかき混ぜますLLプレートミキサー、室温で30分間、それらをインキュベートします。
8. _{2（SO 4）2、100μM}キシレノールオレンジ、250μMのFe（NH _4）：ウェル中のFOX混合物の最終濃度（分注ロボットでは、それぞれのレプリカプレートにFOX試薬の160μlを添加し、ミキサーで簡単にかき混ぜますおよび25mM H ₂ SO _4）。
   1. このような有機共溶媒（DMSO、エタノール、メタノール）またはソルビトール¹⁷としての感度を向上させる試薬には、いくつかの添加剤を加えます。ここでは、100 mMの（ 図4）の最終濃度になるようにソルビトールを添加することにより反応を増幅します。
9. プレートリーダーで560 nmでプレート（エンドポイントモード、T _0）を読みます。
10. 色が発症するまで室温でプレートをインキュベートし、再び（トン_1）吸収を測定します。
    1. インキュベーション後のABS値との差から相対活性を計算し、最初の測定のそれはパレに正規化各プレートについてNTALタイプ（Δtの₁ -トン_0）。
11. 偽陽性を排除するために、2つの連続した​​再上映に最高の変異ヒットを施します。
    注：典型的には、再上映プラスミド¹⁹を新鮮な酵母細胞の形質転換に続いて、大腸菌における酵母、増幅および精製からのプラスミドの単離を含みます。選択された各クローンはpentaplicateで再スクリーニングされます。

PからAAO エリンギは、リグニンを攻撃開始するために、H 2 O 2との真菌のペルオキシダーゼを供給する外flavooxidaseです。 AAOの2つのセグメントがその活性およびSにおけるその発現を高めるためにモーフィングにより集束指向性進化に供しましたセレビシエ 19。 S.によって抱い外国酵素のにかかわらずセレビシエ 、酵母に変異ライブラリーを構築する最も重要な問題は、断片と線状化ベクターへのそれらのクローニングの間のスプライシングを優先するように、特定の重複領域のエンジニアリングに関するものです。現在の例では、各PCR反応のために、すべてのフラグメントは、酵母in vivoでのスプライシングを促進するために、約50塩基対のオーバーハングを有していました。セグメント数が組み立てられ、線状化ベクターにクローン化する上での組換え事象の数が依存している（ すなわち、2つの交差事象は、との間で行われました図1）; 3 PCRセグメントは、非変異誘発segment-に隣接する2つの変異原性のセグメントに加えて線状化ベクターを持つ2つの追加のクロスオーバーを-THE。彼らは形質転換効率は向上しませんが我々の経験によると、50塩基対より長い重複配列は、内部の組換えの可能性を減少させます。

突然変異荷重は、異なる風景を有する変異体のライブラリーをサンプリングし、親酵素活性の<10％を有するクローンの数を算出し、さらに、アクティブおよび非アクティブな変異体（ 図5A）のランダムサンプルを配列決定することによって、それらをチェックすることにより調整しました。分散S.係数の決意するためセレビシエ細胞は、親AAOで形質転換し、プレートアウトSC-ドロップ上にプレーティングしました。個々のコロニーを96ウェルプレートおよびクローンの活動に採取し、接種した新鮮な調製物から評価しました。変異原性サンプル2（ のTaq /のMnCl 2 0.05 mm）をライブラリー構築およびスクリーニングのための出発点として選ば ​​れました。

AAOの生物学的活性は、反応媒体中のH 2 O 2濃度を増加させるように、我々は、H 2 O 2の小さな変化を定量化するために高感度かつ正確なアッセイの検索しました。 FOXは、フェントン反応20、に基づいて、化学的な方法となるHによる酸化2 O 2ドライブの青紫色の複合体を形成するキシレノールオレンジと鉄の反応3+（O -cresolsulfone-フタ3 '、3' ' -ビス（メチルイミノ）二酢酸ε560 = 1.5×10 4 M -1 cm -1 で ）。鉄酸化工程は明らかεとラジカルの増殖を増加させる、アッセイの感度を高めるためにソルビトールを添加することにより増幅された560 = 2.25×10 5 M -1 cm -1で（FIグレ4）。

（μMの範囲で）、このアッセイの検出限界（0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4μMH 2 O 2トリプリケートで標準96ウェルプレート中でブランク決意法により算出しました。 ）及びSからいくつかの上清を使用してプラスミド（ 図5B） - セレビシエは、URA3を欠いています。アッセイは、（H 2 O 2の8μMまで）ソルビトールの存在下では直線的であった、と直線性は、応答が弱かった（少なくとも、H 2 O 2の30μMまで）この砂糖の不在下でより持続的であったが（ 例えば、H 2 O 2の6μMで、4倍の増強は、（ 図5B） -ダーク橙その不在で0.24の吸光度から、ソルビトール-deep紫の存在下で得られました）。 ABSおよびAAO濃度との関係は、電子の増加量で評価しました。（酵母菌​​上清から）nzyme及び線形応答が観察されました。 R 2 = 0.997（ 図5C）。

FOX信号は培養液中の異なる要素によって明らかな干渉なしに数時間安定であったことは注目に値します。 FOXの予想感度は上清中AAOによって産H 2 O 2〜0.4μMでした ソルビトールの存在、およびその不在中〜2μMインチ

2000クローンの変異体ライブラリーを構築し、このアッセイでスクリーニングしました。いくつかのAAO変異体は、pの -methoxybenzylアルコールに対する顕著に改善された分泌および活性（ 図5D）19で同定されました。

図1。AAO進化のためのプロトコルをモーフィングAAOの2つの異なる領域がランダム突然変異誘発および組換えのために標的された：シグナルペプチド（SP）を含むM1（青、590塩基対）。 M2（イエロー、528塩基対）。 （灰色、844 bp）のHF領域は、高忠実度ポリメラーゼを用いて増幅しました。変異原性領域はAAO（PDB ID：3FIM）の結晶構造にマッピングした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

PCR産物および線状化ベクターの図2の製造 （A）分析用アガロースゲル（1％W：V）。レーン1および7、分子量マーカー（1kbのラダー）を含みます。 BamHIおよびXho I線状化ベクター、レーン2; PCRセグメントM1、レーン3; PCRセグメントM2、レーン4; PCRセグメントHF、レーン5; V INNheI（地域MI、HF及びM-IIでフルAAO遺伝子を含む）、レーン6（B）のベクトル線形化、レーン1および6分子の規格、1 KBラダーで線状に再組み立てベクトルをIVO。プラスミドミニプレップ、レーン2。 NheI、レーン3で線状化プラスミド; BamHIおよびXho I、レーン4で線状化プラスミド;プラスミド精製の ​​ための消化後ゲル抽出とクリーンアップによって得られた線状化プラスミド、レーン5（C）プロトコル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3.ハイスループットスクリーニングプロトコル。プロセスの概要。 大きい輸出自主規制を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のイオン。

図4. FOX方法。白色腐朽菌は、•OHヒドロキシルラジカルを生成するフェントン反応により木材の細胞壁を攻撃します。 FOX方法カップルこの反応はオレンジ（XO）をキシレノールし、XO-のFe 3+錯体の吸光度を560nmで測定します。鉄の酸化は、試薬混合物にソルビトールを添加することにより増幅される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5.変異原風景とは異なるエラープローンPCR条件およびスクリーニングアッセイの検証を使用してライブラリをモーフィングするため。（A NG>）モーフィング風景。破線はアッセイの変動係数を示しながら、水平の実線は、アッセイにおける親のタイプの活性を示します。パーセンテージは、親酵素活性の10％未満を有するクローンの数を示します。活動は、降順にプロットされています。 （B）FOXの検出限界は、ソルビトールの存在下（黒丸）でH 2 O 2の漸増濃度下および非存在下（白四角）で評価しました。 （C）AAO濃度（形質転換体の上清）とABS 560nmの間の線形相関。各点は、8回の実験の平均値に対応し、標準偏差を含みます。 （D）変異体ライブラリーの風景。他の場所で19報告されているように選択された変異体（影付きの正方形）を再スクリーニングしました。実線はAAO親のタイプの活性を示します。>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者らは、開示することは何もありません。