このプロトコルは、酵素消化、密度勾配分離、プラスチック接着およびCD146 +磁気ビーズ選択を使用することにより、ラットから原発性肺常駐間葉系間質細胞を得るための分離技術について説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
間葉系間質細胞（MSC）は、ますます肺疾患を含む、疾患の広い範囲でそれらの治療の可能性のために認識されています。外因性の細胞治療のための骨髄や臍帯MSCの使用のほかに、居住者組織のMSCの修復と再生の可能性が注目もあります。また、彼らはおそらく正常な臓器発達における役割を持っている、と疾患における役割、線維性自然との特にそれらを起因しています。これらの居住者組織MSCの研究のための主要なハードルは、これらの細胞の単離および同定するための明確なマーカーの欠如です。ここで説明する分離技術は、肺常駐のMSC（L-のMSC）の複数の特性が適用されます。ラットの屠殺時に、肺を除去し、血液を除去するために複数回洗浄します。メスによる機械的解離後、肺をコラゲナーゼタイプI、中性プロテアーゼおよびDNアーゼI型obtaineのミックスを使用して、2〜3時間のために消化され、D単一細胞懸濁液は、その後の密度勾配媒体（密度1.073グラム/ミリリットル）で洗浄し、積層されています。遠心分離した後、間期からの細胞を洗浄し、培養処理フラスコに播種しました。細胞は、生理的な5％O 2、5％CO 2条件下で4〜7日間培養します。線維芽細胞（CD146 - ）を枯渇させると、CD146 +細胞についてのみ、L-MSCの（CD146 +）、正の選択の人口を確保するために磁気ビーズ選択を介して行われます。要約すると、この手順は確実に、さらにin vitro試験および操作のための主要なL-MSCの集団を生成します。なぜなら、プロトコルの性質上、それは容易に他の実験動物モデルに変換することができます。
概要
間葉系間質細胞（MSC）は、ますます肺疾患を含む、疾患の広い範囲でそれらの治療の可能性のために認識されています。外因性の細胞治療のための骨髄や臍帯MSCの使用のほかに、居住者組織のMSCの修復と再生の可能性が注目もあります。開発中は、肺を含め、間充織は、発達の手がかりの重要な源であり、レジデントMSCは、このの中心である可能性が高い候補です。また、証拠は、常駐のMSCは、癌1,2および線維症3を含む 、成人病に乱されていることが浮上しています。これらの居住者組織のMSCの研究のための主要なハードルは、これらの細胞4の単離および同定するための明確なマーカーの欠如です。幹細胞抗原-1（SCA-1）組織幹細胞の種々のマーカーとして、マウスにおいて同定された、およびL-MSCの5の単離に用いることができるが、残念ながらあり他の種6にオルソログを知られていません。研究者らは、肺組織または体液のいずれかからL-MSCの単離のための別の単離方法の様々な報告しています。 / CD45 - / - CD90 +細胞7、CD31 - / CD45 - /上皮細胞接着分子（EpCAM） - / SCA-1 +細胞8、多剤耐性トランスポーターこれらは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）CD3....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべての手順は、オタワ大学の動物実験委員会（動物の倫理プロトコルOHRI-1696）によって承認されました。動物のケアは、機関のガイドラインに従って行いました。
肺間葉系幹細胞の単離1。
- 50ミリリットルチューブに酵素ミックスを調製する：これらの金額は、成体マウスやラットの仔の肺に十分2500 UコラゲナーゼIおよび500 UのDNAse Iを、30 U中性プロテアーゼで重量を量ります。使用するまで4℃で分離し、店舗の日に準備します。
- ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により13日目に犠牲仔ラット（0.2ミリリットル、65 mg / mlで）。無意識を確立するために、つま先ピンチ反射を使用してください。以下に概説するように、動物の死亡は、胸を開くことによって保証されます。
- 非常に慎重でないという、70％エタノールで動物を噴霧することによって皮膚を消毒し、慎重にダイヤフラムで開始し、吻側側に切断、手術用はさみを使用して、胸郭を開きます肺を損傷します。止血クランプを使用して開いた胸郭を広げ、あるいは胸部へのアクセスを提供するために、胸郭を切り取ります。
- 心を除去することにより、動物を放血。心を削除するには、小さなピンセットで胸腺と心をつかみ、手術用ハサミでこれらを切り取ります。これ以上の血液が切断大動脈と肺動脈から出てくるしなくなるまでその直後、ガーゼで血液を吸収します。
- 次のよう....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
MSCは、密度およびプラスチック付着の最も信頼性の高い物理的特性の二つは、L-MSCを含んでいる肺の間葉系細胞画分を得るために、この手順の最初の部分で使用されています。密度勾配相間は、肺間葉系細胞に加えて、単球およびマクロファージが含まれますが、文化の3〜5日に続いてプラスチック接着は肺間葉系細胞が残っていることを保証します。実際、この細胞集団は、古典的MSC表面マーカーCD73、CD90およびCD146を発現し、中に存在する任意の白血球はもはや存在していないことを示すマーカーCD34、CD45、主要組織適合遺伝子複合体II型（MHCII）-RT1B、CD11bおよびCD79A、のために否定的です細胞集団（ 図2A）。興味深いのは、CD146 +サブセットのうち、44.4〜65.7％の範囲もまたCD73 +及びCD90 +（データは示していない）ということです。また、この細胞集団は可能ですコロニー形成単位（CFU）の効率その30％が一般に、骨髄MSCの、あるいは他のMSC.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
プライマリL-MSCの単離と文化はより自分の機能や細胞レベルで他の細胞集団との相互作用、および肺の開発、健康と病気におけるその役割を理解するための機会を提供します。これらの細胞の特異的な単一のマーカーの欠如は、in situで 、これらの細胞を研究することはほぼ不可能、これは特に重要です。すべてのプライマリ細胞集団と同様に、1は、これらの細胞が長い彼らは（24に概説されている）の文化19に保持され、それらの文字を変更する可能性が高いということを覚えておいてください。それらの自然な状態にできるだけ近い状態でL-MSCを維持するために、37℃の加湿インキュベーター中、5％O 2、5％CO 2で培養することが非常に重要です。呼吸生理機能においては、一般的に分圧のドルトンの法則に基づいて、周囲空気の酸素分圧（21％O 2）が 160 mmHgであり、に低下することが認められている10〜肺胞空域25-27で1 mmHgで。成熟した肺では肺胞-動脈血のPaO 2勾配は〜3-4 m.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
JJPCは、カナダ衛生研究所(CIHR)のポスドクフェローシップによってサポートされています。MAMは、ドイツ国立学術財団-Studienstiftung des Deutschen Volkesからメリット奨学金を受けており、EFCNI(新生児ケアのための欧州財団)からの助成金によってサポートされています。BTは、CIHR、カナダ肺協会、幹細胞ネットワーク、およびイースタンオンタリオ小児病院研究所の支援を受けています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 中性プロテアーゼ | ワージントンバイオケミカルコーポレーション | LS02104 | 単離の日に調製し、4°Cで保管してください。C |
| コラゲナーゼを使用するまで I | ワージントン バイオケミカル コーポレーション | LS004196 | 分離の日に準備し、4 °Cで保管します。 |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | 分離の日に準備し、4°Cで保管します。 |
| ペントバルビタールナトリウム(エウタニル) | Bimeda-MTC Animal Health Inc、ダブリン、アイルランド | - | 20-30 gのラットの子犬に0.2 mlを使用するまで、より大きな動物はもっと必要になる場合があります。 |
| ダルベッコこの | D-PBSに存在するカルシウムとマグネシウムが酵素消化を容易にするため、このタイプのD-PBSを使用するために非常に重要 | 14287-072 | |
| フィコール-パケプレミアム (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | 密度勾配メディア。良好な間期を得るためには、単一細胞懸濁液の層化が>45°Cで起こることが重要です。非常に低速で角度を合わせ、その後の遠心分離は19°Cで行われます。 |
| &アルファ;MEM | Sigma-Aldrich | M8042 | ウォーム 37 °C;使用前のC水浴 |
| 200 mM L-グルタミン | ライフテクノロジー | ズ 25030-164 | |
| 100x 抗生物質-抗真菌 | ライフテクノロジー | ズ 15240-062 | ペニシリン/ストレプトマイシン/菌類 |
| M-280 ダイナビーズ | ライフテクノロジー | ズ 11205D | 磁気ビーズ |
| ビオチン化ポリクローナルウサギ-抗マウス IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | |
| DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | です。注:磁石はメーカーに基づいて選択する必要があります選択したマグネットビーズの説明。 |
| TrypLEエクスプレス | Life Technologies | 12605-028 | 穏やかな非トリプシン代替品は、1 mlのTrypLE express/25 cm2表面積を使用します。剥離後、10 mLのL-MSC培地で3 mLのTrypLE |
| 抗ラットCD146抗体 | Lifespan Biosciences Inc | C35841 | 12.5 μ0.5 x 106細胞あたりのl |
| タスパン(ペンタスターチ溶液) | リストル-マイヤーズスクイブカナダ | - | 地元の献血サービスまたは血液科を通じて入手できます。あるいは、0.9%NaClで1:1に希釈したPSI 20%ペンタスターチ溶液(Preservation Solutions、PST001)を使用することもできます。 |
| Mr. Frosty 冷凍コンテナ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 5100-0001 | L-MSCを-80°Cで一晩冷凍すると生存率が向上します。ハ |
参考文献
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
