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方法論記事

CD146の単離

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DOI：

10.3791/53782

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2016年6月17日

 ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

この記事について

サマリー

このプロトコルは、酵素消化、密度勾配分離、プラスチック接着およびCD146 +磁気ビーズ選択を使用することにより、ラットから原発性肺常駐間葉系間質細胞を得るための分離技術について説明します。

要約

間葉系間質細胞（MSC）は、ますます肺疾患を含む、疾患の広い範囲でそれらの治療の可能性のために認識されています。外因性の細胞治療のための骨髄や臍帯MSCの使用のほかに、居住者組織のMSCの修復と再生の可能性が注目もあります。また、彼らはおそらく正常な臓器発達における役割を持っている、と疾患における役割、線維性自然との特にそれらを起因しています。これらの居住者組織MSCの研究のための主要なハードルは、これらの細胞の単離および同定するための明確なマーカーの欠如です。ここで説明する分離技術は、肺常駐のMSC（L-のMSC）の複数の特性が適用されます。ラットの屠殺時に、肺を除去し、血液を除去するために複数回洗浄します。メスによる機械的解離後、肺をコラゲナーゼタイプI、中性プロテアーゼおよびDNアーゼI型obtaineのミックスを使用して、2〜3時間のために消化され、D単一細胞懸濁液は、その後の密度勾配媒体（密度1.073グラム/ミリリットル）で洗浄し、積層されています。遠心分離した後、間期からの細胞を洗浄し、培養処理フラスコに播種しました。細胞は、生理的な5％O 2、5％CO 2条件下で4〜7日間培養します。線維芽細胞（CD146 - ）を枯渇させると、CD146 +細胞についてのみ、L-MSCの（CD146 +）、正の選択の人口を確保するために磁気ビーズ選択を介して行われます。要約すると、この手順は確実に、さらにin vitro試験および操作のための主要なL-MSCの集団を生成します。なぜなら、プロトコルの性質上、それは容易に他の実験動物モデルに変換することができます。

概要

間葉系間質細胞（MSC）は、ますます肺疾患を含む、疾患の広い範囲でそれらの治療の可能性のために認識されています。外因性の細胞治療のための骨髄や臍帯MSCの使用のほかに、居住者組織のMSCの修復と再生の可能性が注目もあります。開発中は、肺を含め、間充織は、発達の手がかりの重要な源であり、レジデントMSCは、このの中心である可能性が高い候補です。また、証拠は、常駐のMSCは、癌1,2および線維症3を含む 、成人病に乱されていることが浮上しています。これらの居住者組織のMSCの研究のための主要なハードルは、これらの細胞4の単離および同定するための明確なマーカーの欠如です。幹細胞抗原-1（SCA-1）組織幹細胞の種々のマーカーとして、マウスにおいて同定された、およびL-MSCの5の単離に用いることができるが、残念ながらあり他の種6にオルソログを知られていません。研究者らは、肺組織または体液のいずれかからL-MSCの単離のための別の単離方法の様々な報告しています。 / CD45 - / - CD90 +細胞7、CD31 - / CD45 - /上皮細胞接着分子（EpCAM） - / SCA-1 +細胞8、多剤耐性トランスポーターこれらは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）CD31について選択に基づいた方法によって異なります細分化した組織13のうちプラスチック接着11,12および移行へのATP結合カセットG（ABCG2）陽性細胞9またはヘキスト33342色素流出10、。

本明細書に提示された方法の利点は数倍です。穏やかな酵素消化および密度勾配14を使用することによって 、人はMSCを含むが、上皮または内皮細胞を排除密度範囲のすべてのセルを取得します。その後のプラスチック接着ステップはmesenchことを保証しますymal細胞が付着し、白血球を除去すること、文化にとどまります。これらの細胞はCD146を発現しないように最も重要なのが、CD146 +選択ステップは、線維芽細胞の排除を可能にします。細胞接着分子CD146の発現を正に多分化と相関し、したがって、間葉細胞集団15-19からの線維芽細胞を取り除くための良好なマーカーです。それは唯一のMSCにもlipofibroblasts 5,20では発現されないので、これは、選択マーカーとしてCD90を使用よりも有利で ​​す。それが細胞に緩やかにあるように、このプロトコルでは、我々は明示的、磁気ビーズ選択を選択している、と全体の手順は無菌状態で行うことができます。成長方法とは対照的に、この分離方法の別の重要な利点は、それが成長法の月以上とは対照的に、6-10日比較的高速であることです。 3〜5日最初の単離後に、間葉系人口は、CD146 + SELEの準備ができています ction。別の3〜5日後、CD146 +細胞を、実験のために使用される準備ができているか、後の使用のために凍結することができます。 MSCは、長期のex vivo培養 19内の線維芽細胞に向かって分化転換として文化の減少時間は、細胞の品質が向上します。最後に、ためのプロトコルの性質のため、消化酵素とインキュベーション時間の選択を調整するだけで適切な抗体を選択することによって、あるいは他の器官系に他の種に​​この方法を適用することができます。

この分離方法の詳細なプロトコルは、以下に与えられ、CD146 +亜集団の単離およびその後の選択の概略図を、それぞれ図1Aおよび 1Bに設けられています。さらに、詳細はこれらの細胞を凍結し、解凍、継代のために含まれています。

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図1肺間葉細胞（A）の単離およびその後のCD146 +細胞選択（B）の概略分=分。 EDTA =エチレンジアミン四酢酸; 2 番目のAb =二次抗体; α-CD146抗体=一次抗CD146抗体; -ve細胞= CD146陰性細胞; +は= CD146陽性細胞ve細胞。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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プロトコル

すべての手順は、オタワ大学の動物実験委員会（動物の倫理プロトコルOHRI-1696）によって承認されました。動物のケアは、機関のガイドラインに従って行いました。

肺間葉系幹細胞の単離1。

  1. 50ミリリットルチューブに酵素ミックスを調製する：これらの金額は、成体マウスやラットの仔の肺に十分2500 UコラゲナーゼIおよび500 UのDNAse Iを、30 U中性プロテアーゼで重量を量ります。使用するまで4℃で分離し、店舗の日に準備します。
  2. ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により13日目に犠牲仔ラット（0.2ミリリットル、65 mg / mlで）。無意識を確立するために、つま先ピンチ反射を使用してください。以下に概説するように、動物の死亡は、胸を開くことによって保証されます。
  3. 非常に慎重でないという、70％エタノールで動物を噴霧することによって皮膚を消毒し、慎重にダイヤフラムで開始し、吻側側に切断、手術用はさみを使用して、胸郭を開きます肺を損傷します。止血クランプを使用して開いた胸郭を広げ、あるいは胸部へのアクセスを提供するために、胸郭を切り取ります。
  4. 心を除去することにより、動物を放血。心を削除するには、小さなピンセットで胸腺と心をつかみ、手術用ハサミでこれらを切り取ります。これ以上の血液が切断大動脈と肺動脈から出てくるしなくなるまでその直後、ガーゼで血液を吸収します。
  5. 次のように胸部から肺を削除します。吻側側の手術用ハサミで気管を切断、その後、小さな鉗子で気管を保持します。そっと胸のうち肺パッケージを引きながら、肺を解放するために胸郭に沿って背側の任意の結合組織を切り取ります。
  6. 手術用ハサミでダイヤフラムに沿って切断することにより大動脈食道から肺を断ちます。今、肺は胸郭から完全に自由であることをガーゼで優しく残りの血液を除去。
  7. シュールで気管や気管支を削除します外科用ハサミ、注意深く冷35 mlの30％クエン酸 - リン酸 - デキストロースアデニン（CPDA-1）抗凝固剤（26.30グラムのクエン酸三ナトリウム二水和物3.27グラムのアスコルビン酸一水和物2.22グラムのモノナトリウムリン酸二水素を含有する50mlチューブに肺葉を転送します血液及び破片を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で使用する前に0.22μmのメンブレンフィルターを用いて滅菌濾過溶液）; 31.80、G 1 L中のD-グルコース、0.275グラムのアデニン精製H 2 O。
  8. 30％CPDA-1 / PBS中で5分間洗浄した後35 mlの滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）（RT）を含む新たな50mlチューブに肺を転送し、クエン酸を除去するために穏やかに反転させます。 35を含むチューブに移しmlのダルベッコPBS +ナトリウム - ピルビン酸+グルコース（DPBS ++）（RT）。各洗浄工程は、約5分を取る必要があります。
    注：塩化カルシウム二水和物132.4ミリグラム、塩化マグネシウム六水和物100mgを、塩化カリウム（無水）200はM：DPBS ++は、商業的に順序付けられたかのように構成することができるが21以下G、1 Lにおけるリン酸二水素カリウム（無水）200mgを、塩化ナトリウム（無水）8,000ミリグラム、リン酸ナトリウム二塩基（無水）1,144.5 mgであり、D-グルコース1000mgの、ピルビン酸ナトリウム36 mgの精製されたH 2 O、pHは7.3。滅菌濾過溶液、使用前に0.22μmのメンブレンフィルターを用いました。
  9. （37℃に予め温めておいた）++ 10mLのDPBSを添加し、溶解するまで穏やかに反転させて酵素ミックスを溶解します。
  10. 新しい50ミリリットルチューブに肺を転送し、細かくみじん切りまでメスを用いて、管の壁に肺を切ります。いずれかの熱ミキサー、振とう水浴、または水に（しっかりとチューブを閉じ、穏やかに攪拌しながら38℃でインキュベート、（10ミリリットル酵素ミックス/成体マウス/ラットの仔の肺あたりの）組織に酵素ミックスを追加します。定期的な手動攪拌しながら浴）。胎児組織60分、若年/成人組織90-120分、線維性成体組織120-150分：期間は、組織の種類によって異なります。
  11. 二価の陽イオンワットをキレート化することによって消化を停止i番目の200エチレンジアミン四酢酸μlの（EDTA、0.15 M、pHは7.4。滅菌フィルター使用前に0.22μmのメンブレンフィルターを用いた溶液）。
  12. 20 5mlの％ウシ胎児血清（FBS）/ PBSを追加し、新しい50mlチューブに100μmの細胞ストレーナーを介して全体の懸濁液を渡します。 40ミリリットルに総容量をもたらし、10ミリリットルの5％FBS / PBSでチューブとセルストレーナーを洗浄します。
  13. 500×gで、室温で5分間遠心します。
  14. 上清を除去し（ペレットがはっきりと見えるはず）、40ミリリットルの5％FBS / PBS中に再懸濁し、遠心分離工程1.13を繰り返します。
  15. 4ミリリットルの5％FBSで再懸濁/ PBS（RT）と慎重の上に3ミリリットルの密度勾配メディアレイヤ（1.073グラム/ cm 3）を15ミリリットルチューブ14インチ良好な中間相を得るためには、単一細胞懸濁液の積層は非常に低速で> 45°の角度で発生することが重要です。
  16. 900×gで遠心分離し、20分間、培地（5/10）加速、無減速、19°C。
  17. 中に存在する細胞を収集10ミリリットル滅菌PBSでそれらをterphaseし、懸濁します。
  18. 500×gで、21℃で5分間遠心します。
  19. 上清を除去し、10mlに細胞ペレットを再懸濁し、予め温め完了L-MSC培地（最小必須培地イーグル、アルファ修正（αMEM）、500ミリリットルαMEM、20％体積/体積あたり2モルのL-グルタミンを補ったFBS 1％容量/容量のペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB.
  20. 遠心分離工程1.18を繰り返します。その後、予熱した新鮮な培養培地10ミリリットルで上清と再懸濁を削除します。
  21. この段階での細胞の大部分は、プラスチック接着性ではないので、高密度に血球計又は自動化細胞カウンター板を用いて細胞を数えます。正確なプレーティング密度は、ラット仔の肺からの細胞は1-2 xの播種密度で十分に密であるのに対し、成体マウスの肺の細胞を、10 5細胞/ cm 2で播種され、例えば 、動物種や年齢によって異なります10 4細胞/ cm 2 。 0.2ミリリットルL-MSCの培養培地/ cm 2とを使用してください 。
  22. 培養L-MSCを加湿した5％O 2、5％CO 2雰囲気中37℃。
  23. PBSで一度すすいだ後培地最初の播種後24時間、続いて3日ごとに変更します。細胞は、起源の動物に応じて、平均して3〜5日かかる80〜90％のコンフルエンスまで培養する必要があります。高い合流は、線維芽細胞への分化を推進していきます。

CD146 +肺間葉系幹細胞の2.選択

  1. 二次抗体と磁気ビーズのコーティング
    1. 無菌状態で凍結バイアルコート丸底で10μgの二次抗体/100μlの磁気ビーズの割合でビオチン化二次抗体を用いた磁気ビーズ、滅菌2ミリリットル。予想0.5×10 6細胞あたり10μlの二次抗体を使用し、100μlの磁気ビーズおよび10μg抗体の最小値を使用します。
      注：の比率ビーズの体積当たりの使用tibodiesはメーカー間で異なる場合があり、選択のビーズについては、製造元の説明書を参照してください。このプロトコルでは、このプロトコルの最適化に使用されたビーズと抗体について、表1を参照してください。
    2. 室温で、30回転/分（rpm）で30分間回転サンプルミキサーでインキュベートします。
    3. 1.5ミリリットルの滅菌0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）でビーズを再懸濁/ PBSと3ミリリットルへの転送は、丸底チューブ（チューブフローサイトメトリー）。追加の1.5ミリリットル、0.1％BSA / PBSでクライオバイアルをすすぎ、3ミリリットルチューブに移します。
    4. 適切な磁石上にチューブを置き、すべてのビーズが管の後壁に取り付けられ、溶液が透明になるまで2分待ちます。流出を削除し、3ミリリットルと0.1％BSA / PBSで2回洗って繰り返します。
    5. 光から保護して4℃で3ミリリットルの0.1％BSA / PBS中のビーズや店舗を、再懸濁します。 5日以内にご使用ください。
  2. CD146 + L-MSCをラベリング
    1. 穏やかな非トリプシン溶液を用いてPBSでリンスした後、間葉細胞を収穫。
      注：ボリュームは培養フラスコのサイズ（0.2ミリリットル/ cm 2の培地またはPBS）に依存します。
      1. 培養培地を除去し、滅菌PBSで細胞を3回すすいでください。
      2. 穏やかな非トリプシン溶液の適切な量を追加する（ 表1参照）。細胞が分離するまで、 表1の溶液を使用する場合、ほぼ、インキュベーター中で37℃で10分間インキュベートします。
      3. L-MSC培地、500×gで5分間遠心分離を添加することによって酵素を不活性化します。
    2. 0.1％BSA / PBS中で、再懸濁細胞を上清を除去し、血球計または自動細胞カウンターで細胞を数えます。
      注：0.1％の体積は、BSA / PBSを培養フラスコの大きさに依存する：5または10ミリリットル、0.1％BSA / PBSを目指します。
    3. 繰り返し手順2.2.2と3ミリリットル0.1％BSA / PBS（ブロック解除で細胞の専用の量を懸濁特定の結合部位と）生きている細胞を保持します。細胞を氷上に保管してください。
    4. 一次抗CD146抗体で3ミリリットル丸底チューブを用意し、氷上に保ちます。
      注：細胞の専用の量に添加される一次抗体の濃度は、使用される抗体に依存します。提案した抗ラットCD146抗体は 、表1を参照してください 。
    5. 一次抗体とチューブにステップ2.2.3からの細胞の総容量を追加します。閉じるしっかりと15 rpmで、4℃で回転サンプルミキサーで30分間インキュベートします。
    6. 500×gで、4℃で5分間遠心細胞は、3ミリリットル0.1％BSA / PBSで上清と再懸濁細胞ペレットを削除します。繰り返し遠心分離ステップ。
    7. セクション2.1の指示に従って調製し、15 rpmで、4℃で回転サンプルミキサーで30分間インキュベートした二次抗体をコーティングしたビーズを含む3ミリリットル溶液中の細胞を再懸濁します。
  3. CD146 + L-MSCを選択
    1. 磁石で標識されたCD146 + L-MSCを含むチューブを置きます。陽性細胞は、チューブの背面に描画されます。チューブの移動やビーズに触れることなく、ゆっくりと滅菌パスツールピペット（これらは実験計画に基づいて収集または廃棄することができるのいずれか）と陰性細胞と上清を収穫。
    2. 磁石からチューブを外し、3ミリリットルの10％BSA / PBSで細胞を懸濁します。ステップ2.3.1で説明した選択手順を繰り返します。 4回（Σ5選択ステップ）。
    3. 予め温めておいたL-MSCの培養液中にCD146 + L-MSCを再懸濁し、磁石に戻ります。
    4. 上清を除去し、適切なサイズの培養フラスコ中のL-MSC培地とプレートで再懸濁（0.2ミリリットル/ cm 2）でした。経験則として、同じサイズの培養フラスコ中のプレート細胞は、そこから細胞がビーズを選択する前に解除されました。 CD146 + L-MSCの数、したがって、播種密度、意志ソース動物の年齢、種および株に依存します。常に〜5,000細胞/ cm 2の播種密度を目指します。
      注：ビーズは、細胞増殖を妨害しないであろうと、細胞が増殖するにつれて徐々に消えます。

3.凍結細胞

  1. 以下の凍結培地を使用します、20％FBS、12.5％（0.9％のNaCl中10％ペンタスターチ）の60％ペンタスターチ溶液CPDA-1、2.5％のNaCl（0.9％）、5％ジメチルスルホキシド（DMSO）22。
    注：いないすべての成分が使用可能な場合は、5％DMSO、30％FBSおよび65％αMEMを含む溶液は良い選択肢です。
  2. 0.5×10 6細胞/ mlで、1ミリリットルそれぞれのクライオバイアル中にアリコートで細胞を再懸濁し、冷凍コンテナを使用して、-80℃でO / Nを凍結します。
  3. 翌日、液体窒素貯蔵タンクに移します。

4.解凍細胞

  1. 5分間37℃の水浴中で細胞のバイアルを解凍します。
  2. 10ミリリットル中に細胞を再懸濁し500×gで、21℃で5分間予熱した培地と遠心分離機。
  3. 上清を除去し、10ミリリットルの培養液中で細胞ペレットを再懸濁します。通気キャップ細胞培養における種子細胞を0.2ミリリットル/ cm 2の培地中5,000細胞/ cm 2でフラスコを処理し（例えば、75cm 2のフラスコ中で15 ml）を。
  4. 5％で培養細胞O 2、5％の収穫および/ ​​または実験的な使用のために80〜90％のコンフルエントになるまでCO 2。オーバー密集度は、分化を誘導します。 5,000細胞/ cm 2で播種したとき、L-MSCは、培養の3~4日以内に80〜90％コンフルエントに達します。

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結果

MSCは、密度およびプラスチック付着の最も信頼性の高い物理的特性の二つは、L-MSCを含んでいる肺の間葉系細胞画分を得るために、この手順の最初の部分で使用されています。密度勾配相間は、肺間葉系細胞に加えて、単球およびマクロファージが含まれますが、文化の3〜5日に続いてプラスチック接着は肺間葉系細胞が残っていることを保証します。実際、この細胞集団は、古典的MSC表面マーカーCD73、CD90およびCD146を発現し、中に存在する任意の白血球はもはや存在していないことを示すマーカーCD34、CD45、主要組織適合遺伝子複合体II型（MHCII）-RT1B、CD11bおよびCD79A、のために否定的です細胞集団（ 図2A）。興味深いのは、CD146 +サブセットのうち、44.4〜65.7％の範囲もまたCD73 +及びCD90 +（データは示していない）ということです。また、この細胞集団は可能ですコロニー形成単位（CFU）の効率その30％が一般に、骨髄MSCの、あるいは他のMSC...

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ディスカッション

プライマリL-MSCの単離と文化はより自分の機能や細胞レベルで他の細胞集団との相互作用、および肺の開発、健康と病気におけるその役割を理解するための機会を提供します。これらの細胞の特異的な単一のマーカーの欠如は、in situで 、これらの細胞を研究することはほぼ不可能、これは特に重要です。すべてのプライマリ細胞集団と同様に、1は、これらの細胞が長い彼らは（24に概説されている）の文化19に保持され、それらの文字を変更する可能性が高いということを覚えておいてください。それらの自然な状態にできるだけ近い状態でL-MSCを維持するために、37℃の加湿インキュベーター中、5％O 2、5％CO 2で培養することが非常に重要です。呼吸生理機能においては、一般的に分圧のドルトンの法則に基づいて、周囲空気の酸素分圧（21％O 2）が 160 mmHgであり、に低下することが認められている10〜肺胞空域25-27で1 mmHgで。成熟した肺では肺胞-動脈血のPaO 2勾配は〜3-4 m...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

JJPCは、カナダ衛生研究所(CIHR)のポスドクフェローシップによってサポートされています。MAMは、ドイツ国立学術財団-Studienstiftung des Deutschen Volkesからメリット奨学金を受けており、EFCNI(新生児ケアのための欧州財団)からの助成金によってサポートされています。BTは、CIHR、カナダ肺協会、幹細胞ネットワーク、およびイースタンオンタリオ小児病院研究所の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
中性プロテアーゼワージントンバイオケミカルコーポレーションLS02104単離の日に調製し、4°Cで保管してください。C
コラゲナーゼを使用するまで Iワージントン バイオケミカル コーポレーションLS004196分離の日に準備し、4 °Cで保管します。
DNAse ISigma-AldrichD5025分離の日に準備し、4°Cで保管します。
ペントバルビタールナトリウム(エウタニル)Bimeda-MTC Animal Health Inc、ダブリン、アイルランド-20-30 gのラットの子犬に0.2 mlを使用するまで、より大きな動物はもっと必要になる場合があります。
ダルベッコこのD-PBSに存在するカルシウムとマグネシウムが酵素消化を容易にするため、このタイプのD-PBSを使用するために非常に重要14287-072
フィコール-パケプレミアム (1.073 g/cm3)GE Healthcare17-5446-52密度勾配メディア。良好な間期を得るためには、単一細胞懸濁液の層化が>45°Cで起こることが重要です。非常に低速で角度を合わせ、その後の遠心分離は19°Cで行われます。
&アルファ;MEMSigma-AldrichM8042ウォーム 37 °C;使用前のC水浴
200 mM L-グルタミンライフテクノロジーズ 25030-164
100x 抗生物質-抗真菌ライフテクノロジーズ 15240-062ペニシリン/ストレプトマイシン/菌類
M-280 ダイナビーズライフテクノロジーズ 11205D磁気ビーズ
ビオチン化ポリクローナルウサギ-抗マウス IgGDako, Agilent TechnologiesE0464
DynaMag5-magnetLife Technologies12303Dです。注:磁石はメーカーに基づいて選択する必要があります選択したマグネットビーズの説明。
TrypLEエクスプレス Life Technologies12605-028穏やかな非トリプシン代替品は、1 mlのTrypLE express/25 cm2表面積を使用します。剥離後、10 mLのL-MSC培地で3 mLのTrypLE
抗ラットCD146抗体Lifespan Biosciences IncC3584112.5 μ0.5 x 106細胞あたりのl
タスパン(ペンタスターチ溶液)リストル-マイヤーズスクイブカナダ-地元の献血サービスまたは血液科を通じて入手できます。あるいは、0.9%NaClで1:1に希釈したPSI 20%ペンタスターチ溶液(Preservation Solutions、PST001)を使用することもできます。
Mr. Frosty 冷凍コンテナサーモフィッシャーサイエンティフィック5100-0001L-MSCを-80°Cで一晩冷凍すると生存率が向上します。ハ
を使用するまでC このタイプのD-PBSを使用することは非常に重要で、酵素消化を促進しますDynabeadsとの併用が推奨されている Magnetの後述の抗ラットCD146抗体と一致するビオチン化二次抗体.を不活性化するのに十分です。ペンブ

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