弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

サマリー

ここでは、マウスの皮膚から骨髄細胞を分離し、マラリア原虫のスポロゾイトの皮内注射後にリンパ節を排出するためのプロトコルについて説明します。採取した細胞のフローサイトメトリーは、寄生虫に対する皮膚およびリンパ節の炎症反応を特徴付けるための信頼性の高いアッセイを提供します。

要約

マラリア原虫のスポロゾイト段階は、蚊に刺さを介して哺乳動物宿主の皮膚に接種されたときにマラリア感染が開始されます。非常に運動性の寄生虫は、肝細胞に侵入し、赤血球感染形式に変換するための肝臓に到達していないだけ。それはまた、皮膚に、それが認識され、居住者及び/又は動員骨髄系細胞によって分解することができる注射部位を、排出近位リンパ節に移動します。生体内イメージングは、明るい蛍光のLys-GFP陽性の皮膚中の白血球および排出リンパ節におけるスポロゾイトおよびCD11c ⁺細胞間の相互作用の早期動員を報告しました。ここでは、回復特定し、マウスの皮膚に動員し、マウスモデルにおいてスポロゾイトの投与量を免疫の皮内注射後のリンパ節を排出している骨髄細胞サブセットを列挙するための効率的な手順を提示します。表現型の特徴用いたマルチパラメトリックフローサイトメトリー提供しますマラリア原虫感染に対する炎症反応の初期にダイナミックな細胞変化を評価するための信頼性の高いアッセイ。

概要

マラリアは年間50万人以上を殺害し、世界最悪の感染症の一つです。 マラリア原虫 、疾患の原因物質による感染は、前赤血球（PE）相によって開始されます。このフェーズでは、雌ハマダラカ蚊によって宿主の皮膚に注入されたスポロゾイトは、血流を介して肝臓に到達し、赤血球に感染し、疾患の症状を引き起こす寄生形態に内部に肝細胞を区別する。

マラリア原虫のPE段は、抗マラリアワクチン接種のための特権標的を表します。実際、このような放射線弱毒化スポロゾイト（RAS）などのこれらのステージに対する弱毒化ワクチンを、生きて、遺伝的に逮捕された寄生虫（GAP）または化学的予防及びスポロゾイト（CPS）は、げっ歯類とヒト宿主^1-9の両方を保護する能力を実証しています。齧歯類モデルでは、ほとんどのワクチン接種研究は、静脈内免疫を利用して行われます、防御効力の点でゴールドスタンダードです。しかし、皮膚のステージの説明と保護を誘発するのに皮膚関連の流入領域リンパ節（DLN）の重要性は、PE相の私達の認識を変え、注入の皮内経路の重要性を強調しています。 P.の生体内イメージングげっ歯類の皮膚に注入ベルゲイのスポロゾイトは、接種物のみ〜25％が血流を介して肝臓に到達したことを示しています。残りの〜75％は、近位DLN（〜15％）と少量変換し、皮膚細胞^12,13の内側週間生きている残ることができる皮膚^{（〜50％）10,11、}の間で分配します。また、その後の研究は、皮内免疫化後の効果的な防御免疫の確立は、主に寄生虫特異的CD8 ⁺ T細胞が^14,15脾臓または肝臓-dLNsにわずかしか活性化され、皮膚DLNに起こることを説明しました。

同時にほとんどの研究は、はるかに少ない皮膚に注入生きた弱毒寄生虫、先天性免疫系との特にそれらの相互作用の運命について知られている、防御免疫応答の確立に関与するエフェクター細胞の特徴付けに集中しています。具体的には、CD8 ⁺ T細胞への寄生虫抗原取り込み、プロセシングおよび提示に関与する抗原提示細胞の特徴付けは、PE抗原捕捉は、皮膚及びDLNコンパートメントの両方において発生する可能性があることを知って、非常に重要です。前の生体内イメージング研究は、スポロゾイトと樹状細胞との間の初期の相互作用がDLN ^10,17で観察された感染蚊に刺され¹⁶次肌に明るい蛍光のLys-GFP陽性細胞の早期流入を説明しました。より最近では、蚊によって皮膚に接種スポロゾイトは、皮膚の両方の樹状細胞および制御性T細胞の運動性を増大させることが報告されていますマウスを、抗原提示細胞の減少数は、DLN ¹⁸で観察されました。

我々は、白血球の皮膚とそれに対応するDLNで募集サブセットだけでなく、RAS ¹⁹の用量を免疫の皮内注射後の寄生虫と相互作用するものを同定し、より正確に定量化することを目的としました。この文脈において、我々は両方の組織から骨髄細胞（CD45 ⁺のCD11b ^+）を単離し、マルチ=パラメトリックフローサイトメトリーによって関心の亜集団を特徴とします。 リーシュマニアの主要な皮膚感染²⁰の初期の段階で説明した免疫応答と一致して、注射をスポロゾイトする主な宿主応答は、炎症性単球（CD45 ⁺のCD11b続い多形核好中球（CD45 ⁺のCD11b ⁺ Ly6G ⁺ Ly6C ^int型 ）の連続した募集で構成されてい⁺ Ly6G ^- differentiに基づいて識別されているLy6C ^+）Ly6GおよびLy6C表面マーカーのアル表現。

ここでは、感染した蚊の唾液腺から抽出されたRASの用量を免疫の皮内注射後のマウスの皮膚とDLNから骨髄細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。再現性の皮内注射し、組織処理は、感染組織内の細胞集団を浸潤の表現型の変化を定量化するための重要なステップです。以下に詳述するアプローチは、皮膚やマラリア原虫にDLN炎症反応を評価するための信頼性の高いアッセイを提供し、様々な実験系に拡張することができます。

プロトコル

すべての手順は、パスツール研究所の委員会や地元動物実験に関する倫理委員会（倫理委員IDF-パリ1、パリ、フランス、契約番号：2012から0015）によって承認された際は適用される基準および規則に従って行いました。

1.材料および試薬

1. 以前²¹記載されているように3〜5日出現とリアの後に感染したマウスを餌に女性ハマダラカ蚊（Sda500株）を使用します。
2. 構成的熱ショックタンパク質70（HSP70）プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を発現する寄生虫原虫ベルゲイ ANKAクローンを使用します。これは、寄生虫のライフサイクル²²を通して明るい蛍光が得られます。
3. 雌のC57BL / 6JRjマウス（7週齢）を使用します。
   注：記載されているプロトコルで使用されるすべての試薬 ​​は、 マテリアル/機器のできる Tに記載されています。

_title "> 2。蚊唾液腺からの放射弱毒化スポロゾイトの単離

1. 感染血液食事の後18-25日の間、収集し、以前に²¹記載されているように氷上で15 mlのチューブに蚊をコールド麻酔。慎重にチューブを反転させてペトリ皿に移します。氷の上で昆虫を維持し、γ-又はX線照射の12 kradの線量に蚊を公開します。
2. 以前に^21を説明したように、照射蚊の唾液腺からの弱毒化スポロゾイトを分離します。氷上で1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の（15μL程度）小音量で感染した唾液腺を収集し、静かにスポロゾイトを解放するためにそれらをつぶします。
   注：彼らの強い発現によって証明されるように重要では小容量で高濃縮寄生虫懸濁液の注入は、事前に選択され、十分に感染した蚊の数が多いから、唾液腺の十分な数を収穫することが不可欠です緑色蛍光。
3. 塊と蚊の破片を除去するために、低接着1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに適合した35μmのセルストレーナーキャップを介してスポロゾイトサスペンションをフィルタリングします。
4. 以前に^21を説明したように、単離されたスポロゾイトの合計数をカウントし、83,000スポロゾイト/μLを得るために、冷1×DPBSで寄生虫懸濁液の濃度を調整します。次のステップを継続しながら氷上で寄生虫を保管してください。
5. ネガティブコントロールとして使用される非感染蚊から唾液腺の同等の数を収集し、手順2.2と2.3で説明したようにサンプルを処理します。懸濁液中の唾液腺抽出物の類似の濃度を得るために、上記のように試料を希釈します。
   注：スポロゾイトは、2時間の最大氷上で保存することができます。しかし、理想的にはそれらは唾液腺を粉砕後1時間以内に注入されています。

皮膚ラへのスポロゾイトの3インジェクション耳のヤー

1. ケタミンの腹腔内注射によって動物を麻酔（50mg / kgの）/キシラジン（5mg / kg）の混合物。マウスは無意識の状態であることと、角膜の乾燥を防ぐために、眼に眼軟膏を適用するために5-8分待ちます。両方のリアの足に優しいつま先のピンチを実行することによって、麻酔の深さを評価します。
   注：麻酔の投与量は、20分未満継続するので、次のステップが迅速に行わなければなりません。
2. 以前に実体顕微鏡（ 図1A）下に置かれた明確なテープで腹側を固定することにより、マウスの耳介を安定させます。優しく血管系の損傷を避けるために、耳を押します。
3. 再懸 ​​濁した寄生虫¹⁰の0.6μlの10μlのシリンジ/ 35ゲージの面取り針をロードします。
4. 表皮の下に、注意深く耳（ 図1A）の背側に針を挿入することにより、4注射部位（部位あたり0.15μL）でスポロゾイトサスペンションを提供し、とベベルアップ、任意の血管を避けるように注意しながら。針は、それを削除する前に、注入物質の逆流を防止するために数秒のために真皮内に残ることを許可します。手順（ 図1Bおよび1C）の最後に各注射部位の特性丘疹を観察します。
5. 注入後、慎重にテープから耳を削除します。
6. 手順3.2から3.4に従うことによって寄生虫の同用量と反対側の耳に注入します。
7. 単独の注射と真皮における蚊材料の堆積によって媒介される炎症反応を評価するために、1×DPBSの0.6μlあるいは非感染蚊から1×DPBS +唾液腺抽出物0.6μlのいずれかでの2つの追加のマウスを注入します。
8. ケージに戻ってそれを置く前に、麻酔からのマウスの回復を監視します。
   注：皮膚における適切なスポロゾイト堆積は、蛍光顕微鏡検査（ 図2Aおよび図2Bによってモニターすることができますprevisously ²³記載されているように）、マウスを用意しています。

4.皮膚及び流入領域リンパ郭清

1. ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 25 mMの400 U / mlのコラゲナーゼおよび50μg/ mlのデオキシリボヌクレアーゼ（DNアーゼ）を補充した4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、次のように標準培地（SM）を調製。
2. DLNサンプル用ウェル当たり4.5ミリリットルSM +70μmのセルストレーナー（プレートA）および皮膚サンプル用ウェル当たり4.5ミリリットルSM（プレートB）と氷上で2 6ウェル平底組織培養プレートを準備します。
3. スポロゾイト接種後の所望の時点では、ケタミン（125mgの/キログラム）/キシラジン（12.5ミリグラム/キログラム）混合前に頸椎脱臼の腹腔内注射によってマウスを麻酔。マウスは臨床死の兆候を示しているとすぐに解剖を開始していることを確認します。
   注：骨髄細胞動員の動態は、INJ後の異なる時点で検査することができますection（以前に^14を説明するように、すなわち 2時間、4時間および24時間）。
4. 汚染の可能性を減少させるために70％エタノールを接種し、耳と対応するネック領域を消毒します。
5. 滅菌はさみやピンセットを用いて、無菌的に周囲の脂肪を収集せずに、近位耳のDLNを分析。 jugulo-carotidian溝の最初の切開を行い、手術現場から毛を取り除きます。周囲の組織に比べて灰色がかった表示されますDLNを露出させるために2鉗子で切開を伸ばします。
6. その除去を容易にするために鉗子でDLNの上に慎重に結合組織を挟みます。リンパ組織（ 図3Aおよび3B）の下に鉗子を置くことによってDLNを抽出します。よく含む4.5ミリリットルSM +70μmのセルストレーナー（プレートA）にDLNを置きます。
7. 無菌鋭いハサミやピンセット（ 図4A）を使用して、全体の接種耳を収穫。 SEPARピンチと2鉗子（ - 4E 図4B）で終わるカットを離間さによって耳の背側と腹側の側面を食べました。両方の組織は完全培地中に浸漬されていることを確認することも含む4.5ミリリットルSM（プレートB）にそれらを配置します。
   注：実験の信頼性を向上させ、関心対象の細胞の数を増加させるために、プール2は、サンプルあたり同じマウスからの耳又は2 dLNs注入しました。
8. 耳と1×DPBSまたは唾液腺抽出物のいずれかを接種したマウスのdLNs並列に収穫し、処理。負の単一の染色補正コントロールのナイーブマウスから採取した2つの追加の耳とリンパ節サンプルを含みます。

リンパ節から5細胞の単離

1. 穏やかな攪拌下で15分間、37℃+ 5％CO ₂でのリンパ節（プレートA）にインキュベートします。コラゲナーゼおよびDNアーゼACTIを中和するために、ウェルあたり10 mMの最終エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を追加vities。氷の上で次の手順を実行します。
2. 5mLのシリンジプランジャーの先端を用いてリンパ節を解離します。残っているすべてのまでストレーナーに対して円運動でEnterキーを押して、白の結合組織です。
3. 500μlの1×DPBS + 2％ウシ胎児血清（FBS）+ 2mMのEDTAで二回セルストレーナーを洗浄します。 15ミリリットルチューブにウェルのボリューム全体を転送します。
4. 500μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAでも二回を洗浄し、15ミリリットルチューブにボリュームを移します。氷の上にチューブを保管してください。

耳の皮膚から6細胞の単離

1. 穏やかな攪拌下で1時間、37℃+ 5％CO ₂で耳のリーフレット（プレートB）をインキュベートします。
   注：インキュベーションの20分後、組織消化を促進し、残りの40分間バックインキュベーター内のサンプルを入れて小片にハサミで耳のリーフレットを切りました。単一細胞はインキュベーション時間の終了時に培地中に観察することができます。
2. 10mMの最終を追加ウェルあたりEDTA、コラゲナーゼおよびDNアーゼ活性を中和します。氷の上で次の手順を実行します。
3. 耳組織断片とよく1ミリリットルピペットを用いて、70μmのセルストレーナーを含む新しい培地中の全容量を転送します。より簡単に耳組織断片を収集するためにチップの先端から2〜3ミリメートルをカット。
4. 5ミリリットルの注射器プランジャの先端を使用して、耳の組織断片を解離します。残っているすべてのまでストレーナーに対して円運動でEnterキーを押して、白の結合組織です。
5. 500μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAで二回セルストレーナーを洗浄します。
6. 70μmのセルストレーナーを介して50ミリリットルチューブに入ってものボリューム全体を転送します。
7. 500μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAとをよくすすぎ、50ミリリットルチューブにボリュームを移します。チューブを氷上に保管してください。
   注：皮膚およびDLN組織から全細胞を分離する別の手順を図5にまとめます。

タイトル "> 7。数及び採取した細胞の生存率

1. 4℃で450×gで5分間、皮膚とDLNサンプルを遠心分離し、上清を捨てます。静かに300μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAでペレットを再懸濁。
2. 血球計数器を用いて皮膚及びDLNから単離された細胞の総数をカウントするために、各試料の少量を収集します。細胞生存率を決定するために、0.04％トリパンブルーを追加します。

非8.ブロッキング抗原特異的結合

1. 非標識CD16 / CD32のFc-ブロック抗体10μg/ mlを追加します。 （長く行くことができます）、4℃で20分間インキュベートします。
2. 冷たい1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAの2ミリリットルを追加します。 4℃で450×gで5分間サンプルを遠心し、上清を捨てます。静かに+ 2％FBS + 2mMのEDTA300μlの1×DPBSでペレットを再懸濁し、氷上でサンプルを維持します。

9.染色皮膚及びリンパ節骨髄細胞

1. 以前にブロックされたスキーをインキュベートn及びDLNライブ/デッド・トラッカー（ すなわち 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールまたはDAPI）、抗CD45および抗CD11b特異的抗体で細胞を単離しました。
   注意：利息の骨髄細胞亜集団、特に希少なものを豊かにするためには、CD45 ⁺細胞およびリンパ球は、それぞれ皮膚から精製することができるか、細胞選別を容易にする磁気ビーズによってDLNから枯渇。 DLNから単離された細胞のほとんどがCD45 ⁺であるので、抗CD45の使用は必須ではありません。他のマーカーは、正または負のゲーティング戦略により対象の骨髄細胞の亜集団を同定するために含めることができます。このプロトコルでは、DLNに動員骨髄細胞を^、CD8α+細胞（全T細胞コンパートメントは、抗CD3特異的抗体を用いて標的とすることができる）を除くことによって濃縮しました。
2. 暗所で4℃で30分間インキュベートします。 500μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTA、遠心分離機4℃で450×gでサンプル5分を追加し、supeを捨てますrnatant。二回洗浄ステップを繰り返します。
3. 300μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAを含む試料を再懸濁します。 35μmのセルストレーナーを通してFACSチューブにボリューム全体を転送します。 100μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAでフィルターを洗浄します。
4. フローサイトメーターで染色した細胞を実行します。死細胞とダブレットを排除する^-ゲートは、単一細胞（FSC-W DAPI）を生きます。プロットCD45 ⁺のCD11b ⁺皮膚（ 図6A）のためのイベントと（CD45 ^{+）CD8α -} DLN（ 図6B）のためのCD11b ⁺イベント。

結果

我々は最近、Pの免疫化用量の針注射器注入を実証しましたマウス皮膚におけるベルゲイのスポロゾイトは、皮膚やDLN ¹⁹における炎症性単球が続く多形核好中球の連続的な動員を誘導します。プロトコルセクションは、耳の真皮（図1及び2）でスポロゾイトの多数の複数回の注射以下の両方の組織からのライブ骨髄細胞を正常に分離するために使用される手順を詳しく説明し、上記の。マルチパラメトリックフローサイトメトリーによる細胞浸潤を分析するために、図5にまとめたように最初の24時間以内に、DLN（図3）および皮膚注射部位（図4）を単離し、処理しました。全体的に、この技術は、私たちは平均10 ⁴ CD45 ⁺のCD11b ⁺ 2.10 ⁴のCD11b ⁺ライブ単一細...

ディスカッション

全スポロゾイトマラリアワクチンを用いたヒトの大規模なワクチン接種の観点では、克服すべき主な課題の一つは、成功した免疫化および保護^24,25を確実にするために最適化された経路および寄生虫投与方法を開発することです。ヒトでは、生きた弱毒寄生虫（LAP）によって媒介される防御効果の評価は、自然蚊に刺さ²と同様に、皮内、皮下^25,26およびIV免疫化の²⁷以下の行われています。げっ歯類²⁸および非ヒト霊長類²⁵に報告されているように、LAPのIV投与は、上記の経路に比べてより強い防御免疫応答を誘導します。それにもかかわらず、針と注射器を使用して、管理の非IVルートはまだ人間の質量予防接種のために、より適したままで、努力は現在、彼らの防御効果を最適化するために行われています。

マウスで行われた最近の研究で実証します特にIDルートの場合はD、より大きな容量で希釈した寄生虫の単回接種と比較して、複数の注入部位（4ポイント）が有意に増加した寄生虫の感染性のスポロゾイト...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン:イマルゲン® 1,000		Merial-50	mg / kg:以前のスポロゾイト注射 125 mg / kg:事前の犠牲
キシラジン:ロンプン® 2%	バイエル	-	5 mg / kg:以前のスポロゾイト注射 12.5 mg/kg: 事前犠牲
NanoFil シリンジ + 35 ゲージ針	World Precision Instruments	-	-
オムニカン® 50インスリン注射器 0.5ml/50 I.U.	B.ブラウンメディカル		9151125-MultiwellTM
6ウェル組織培養プレート –フラットボトム	BDファルコン		353046-70
& マイクロ;mセルストレーナー	BDファルコン	352350-2
ml シリンジ	テルモ	SS-02S-BLUE
MAXTM 15 ml ポリプロピレン コニカル チューブ	BD ファルコン		352097-BLUE
MAXTM 50 ml ポリプロピレン コニカル チューブ	BD ファルコン		352098-5
ml ポリスチレン丸底チューブ 35 µm セルストレーナーキャップ	BD ファルコン		352235-DPBS
1x CaCl2- および MgCl2--free	Life Technologies	14190-094-DMEM
1x + GlutaMAXTM	Life Technologies	31966-021-Clostridium
histolyticum 由来コラゲナーゼ、IV 型 0.5-5.0 FALGPA 単位/mg 固体	シグマ・アルドリッチ	C5138	400 U/ml
ウシ膵臓IV型由来のデオキシリボヌクレアーゼI	シグマ・アルドリッチ	D5025	50 & マイクロ;g/ml
EDTA二ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	E-5134	10 mM または 2.5 mM
FBS	Biowest	S1810-500-HEPES
緩衝液 (1M)	Gibco	15630-056	25 mM
トリパンブルーステイン (0,4%)	Life Technologies	15250-061	希釈率 1:10
抗マウスCD16/CD32(2.4G2クローン)	BD Biosciences	553142	10 µg/ml 最終 (1:50)
DAPI FluoroPureTM グレード	Life Technologies	D21490	1 µg/ml
final 抗マウス CD45 (30-F11 clone)	BD Biosciences	559864	希釈率1:200
抗マウスCD11b(M1/70クローン)	BD Biosciences	557657	希釈 1:400
抗マウス CD8α(5H10クローン)	ライフテクノロジーズ	MCD0830	希釈率 1:100
雌 C57BL/6JRj マウス (7週齢)	ジャンヴィエ研究所