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方法論記事

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

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DOI:

10.3791/53806

⸱

2016年3月3日

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

この記事について

サマリー

この作品は、神経堤を介したヒト多能性幹細胞から色素沈着し、成熟したメラノサイトを生成し、無フィーダー、25日のプロトコルを使用して中間段階のメラノブラストするためのin vitroでの分化プロトコルを記述します。

要約

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、正常条件と疾患条件の両方でのヒトの発達をin vitroで研究するためのプラットフォームを表しています。研究者は、培養条件を操作して発生中に見られるシグナルを再現することにより、hPSCの目的の細胞タイプへの分化を指示することができます。そのような細胞タイプの1つはメラノサイトであり、これは神経堤(NC)起源の色素産生細胞であり、紫外線照射から皮膚を保護する役割を果たします。このプロトコルは、現在利用可能なhPSCからのin vitro Neural Crest分化プロトコルを拡張したもので、NCを完全に色素沈着したメラノサイトにさらに分化させるものです。メラノサイト前駆体は、デュアルSMAD阻害条件下でWNT、BMP、およびEDN3シグナル伝達の活性化因子に時限的に曝露することにより、Neural Crestプロトコルから濃縮することができます。得られたメラノサイト前駆体は、次いで精製され、選択培地での培養により完全に色素沈着したメラノサイトに成熟されます。得られたメラノサイトは完全に色素沈着し、成熟メラノサイトに特徴的なタンパク質に対して適切に染色されます。

概要

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、疾患モデル、薬物スクリーニング、および細胞置換療法1-6のためのスケーラブルな方法で正常な分化を模倣するためのプラットフォームを提供します。特に興味深いのは、hPSCsは、患者のサンプルが不足している単離することが困難またはまれ/一過性の細胞型を研究するための道を開きます。また、人工多能性幹細胞（性IPSC）のユニークなメカニズム1,2,7-11を解明するために、患者特異的に開発し、疾患モデルを研究する研究者を有効にします。 hPSCsからメラノサイトの分化のための以前に公開されたプロトコルは、分化の6週間まで必要とし、L-のWnt3a細胞12からの馴化培地で細胞を培養することを含みます。 1プロトコル第1雲母らによって提示。、ここでは説明は3週間で色素沈着細胞を生成し、馴化培地に関連した曖昧さや矛盾を削除します。

メラノサイトのareは神経堤、脊椎動物に特有の細胞の遊走集団から派生します。神経堤は、原腸陥入時に定義され、神経および非神経外胚葉の間で国境を接する、神経板のエッジで細胞の集団を表しています。神経胚形成の間に、神経組織が ​​神経管13,14の結果背側正中線に収束神経ひだを形成するために、神経板から進化します。

神経堤細胞は脊索の向かい、神経管の屋根板から出て、分化した細胞の多様な集団を生じさせるために離れて移行する前に、間葉への移行上皮を受けます。堤細胞の運命は、胚の体軸に沿って屋根板の解剖学的位置によって部分的に定義されています。神経堤細胞誘導体は、中胚葉（平滑筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞）および外胚葉細胞（メラノサイト、シュワンCの両方の特性系統を含みますells、ニューロン）14。神経堤幹細胞は、転写因子SOX10をアップレギュレートおよびp75とHNK1に対する抗体を用いて蛍光活性化セルソーティングにより単離することができます。

メラノサイトになることを運命づけられた神経堤細胞は、メラノブラストのステージを通過し、KITとMITF（小眼球症関連転写因子）をアップレギュレート6,21 MITFは、メラニン細胞の開発のマスター調節因子であり、メラノサイトの開発の多くを制御する役割を担う転写因子であります22- 24。人間melanoblastsは、彼らが毛膨らみまたは表皮中のケラチノサイトに囲まれた成熟した、色素性メラノサイトの前駆体として機能する（色素形成単位）のいずれかに存在し、表皮の基底層に移行します。色素性メラノサイトへのmelanoblastsの分化・成熟は、メラニン産生経路（TYRP1、TYR、OCA2の毛球と表現の植民地とそれに付随し発生し、PMEL）25,26。

患者からのヒトメラノサイトとmelanoblastsを分離すると、高価な困難や量に制限です。このプロトコルは、細胞選別せずに明確に定義され、迅速な、再現可能なスケーラブル、かつ安価な方法でメラノサイトまたはメラノサイト前駆体にhPSCsを（誘起または胚）を区別するために研究者を可能にします。プロトコルは、色素異常症を有する患者からのiPS細胞の分化時に疾患特異的な欠陥を識別するために以前に使用されました。

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プロトコル

注：ここで説明メラノサイトプロトコルが最初雲母らによって実証されました。

1.培養培地の調製、コーティングされた料理とhPSCsのメンテナンス

  1. ミディアム準備
    注：最大2週間、暗所で4℃ですべてのメディアを保管してください。殺菌のためのすべてのメディアをフィルタリングします。
    1. DMEM / 10％FBSを準備します。 885 mlのDMEM、100mlのFBS 10mlのペニシリン/ストレプトマイシン、5mlのL-グルタミンを混合します。殺菌のためのフィルタ。
    2. hESCの培地を準備します。 800 mlのDMEM / F12を200ml KSR、5mLのL-グルタミン10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液、βメルカプトエタノールに、1ml、5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを混ぜます。 10ng / mLのFGF-2を追加し濾過した後。
    3. KSR-分化培地を準備します820ミリリットルノックアウトDMEM、150ミリリットルKSR、10ミリリットルのL-グルタミン、10ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシン、10ミリリットルMEM最小必須アミノ酸溶液およびβメルカプトエタノール1ミリリットルを混ぜます。殺菌のためのフィルタ。
    4. N2-分化培地を準備します。 12グラムDMEM / F12粉末Iを溶解しnは980ミリリットルのdH 2 O 1.55グラムのグルコース、2グラムの重炭酸ナトリウムおよび100 mgのアポヒトトランスフェリンを追加します。 25 mgのヒトインスリンおよび40μlの1N NaOHで2ミリリットルのdH 2 Oを混ぜます。溶解した後、培地に混合物を追加します。 100μlのプトレシン二塩酸塩、60μlの亜セレン、100μlのプロゲステロンを追加します。フィルタリング前のdH 2 Oで1リットルに最終容量を持参。
    5. フルメラノサイト媒体を準備します。 50％Neurobasal培地、30％の低グルコースDMEM、および20％MCDB201を兼ね備えています。この追加するには：0.8％ITS +、250 nMのL-グルタミン、100μMのアスコルビン酸（L-AA）、50 ngの/ mlのコレラ毒素、50 ngの/ mlのSCF、0.05μMのデキサメタゾン、100 nMのEDN3、4 ngの/ mlのFGF2 。滅菌フィルターその後、残りの試薬を追加：2％B27サプリメント、25 ngの/ mlのBMP4、3μMCHIR99021、500μMのキャンプを。
  2. 培養皿のコーティング
    1. このようなマトリゲルとしてゼラチン状タンパク質を用いて塗布行います。 1 mlの部品への開口部、アリコートを凍結マトリゲル時繰り返し凍結融解cを避けるためにycles。解凍し、19ミリリットルDMEM / F12と1ミリリットル凍結アリコートを再サスペンド。 10cmの皿にプレート5 mlです。 RTで1時間の皿をインキュベートします。すぐに細胞をプレーティングする前に、ゲル状のタンパク質を吸引し、DMEM / F12で洗浄します。
    2. ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩/マウスラミニン-I /フィブロネクチン（PO /ラム/ FN）を使用してコーティングを行います。含むPBSでコーティング皿を15μg/ mlのポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩。加湿インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートします。吸引液とを1μg/ mlのマウスラミニンIおよび2μg/ mlのフィブロネクチンを含むPBSでコーティングする前にPBSで3回プレートを洗浄します。加湿インキュベーター中、37℃で皿O / Nインキュベートします。
      1. 細胞をプレーティングする前に、溶液を吸引し、プレートを組織培養フード内蓋なしで完全に乾燥してみましょう。プレートは約10〜15分間乾燥することができます。
        注：結晶構造が目で表面に現れたときに料理が乾燥し、細胞播種の準備ができています。区画ESは限り液体が蒸発しないように、PBSで2週間培養器でLAM / FNを含有して維持することができます。プレートは、数時間室温で乾燥させ維持することができます。
  3. hPSCsのメンテナンス
    注：hPSCsは、ヒトES細胞培地中の0.1％ゼラチンと、有糸分裂不活性化したマウス胚性線維芽細胞（MEF）上で維持されています。細胞は、すべての6-8日に分割する必要があります。
    1. 被覆5分間室温でPBS中の0.1％ゼラチンで10cmディッシュ。
    2. 37℃の水浴中で急速に凍結したMEFを解凍します。
    3. ゼラチンを吸引し、細胞をプレー。 DMEM / 10％FBS中〜50,000細胞/ cm 2の密度でプレートしたMEF。 hPSCsを追加する前に37°CO / NでのMEFをインキュベートします。
    4. 準備されたMEFプレートからDMEM / 10％FBSを吸引し、PBSでプレートを洗浄し、hPSCsと10ミリリットルのhESC培地を追加します。通路1の割合でhPSCs：5/10前継代の密度に応じて。
      注：hPSCsを融解または単細胞として継代されている場合、SUP最初の継代まで、10μMY-27632二塩酸塩（ROCKI）でplement。
    5. mlの10新鮮なhESCの培地で毎日細胞を養います。
    6. 分化した細胞、不規則な境界線、または透明の中心28を含んでいるように思われる任意の多能性コロニーを削除分化を開始する前に。機械的に除去すると、解剖顕微鏡を用いて層流フードの下にピペットで不規則なコロニーを吸引します。

分化のためのhPSCsの2めっき

注：分化条件は、10cmの皿に記載されています。

  1. ステップ1.3.1で説明したように分化を開始する前に、10センチメートルマトリゲル料理を準備します。
  2. 分化のためのメッキhPSCsは、通路の準備密度（〜80％コンフルエント）、ヒトES細胞培地を吸引、PBSで洗浄し、細胞に、0.05％トリプシン-EDTAの3ミリリットルを追加でhPSCsの板を起動すると。
  3. 精力的に皿horizo​​ntallを振ります2分間のyのMEFは、単一細胞としてリフトオフまで顕微鏡下で可視化しながら。 HPSCコロニーをコロニーとして付着したままでなければなりません。
  4. MEFのが持ち上げられた後、トリプシンを吸引するがhPSCsのコロニーをデタッチする前に。
  5. プレートに10μMのY-27632の二塩酸塩を含有したhESC培地10mlを追加し、コロニーの上に上下にピペッティングして細胞を切り離します。
  6. ステップ2.1で調製した10cmディッシュからマトリゲル液を吸引し、塊を除去するために、DMEM / F12で洗浄します。マトリゲルプレート上に2：1の比率でhPSCsをプレート。 10ミリリットルまで、10μMY-27632二塩酸塩を含有したhESC培地を追加します。 37°CO / Nでインキュベートします。
    注：このめっきは/ cm 2で約100,000細胞をもたらすはずです。

神経分化の3誘導

注：hPSCsが80％コンフルエントである場合に分化が（0日目）に開始されるべきです。細胞は、ヒトES細胞培地を毎日供給することができます。分化を開始するまで、10μMのY-27632の二塩酸塩を含みます。

  1. 0日目および1日目に、100 nmのLDN193189と10μMのSB431542を含むKSR-分化培地10mlで細胞を養います。
  2. 2日目に、100 nmのLDN193189、10μMのSB431542および3μMのCHIR99021を含むKSR-分化培地10mlで細胞を養います。
  3. 3日目に、10μMのSB431542および3μMCHIR99021を含むKSR-分化培地10mlで細胞を養います。
  4. 4および5日目フィード15 75％のKSR-分化培地のmlおよび3μMCHIR99021を含む25％N2-分化培地での細胞上。
    注意：浮遊細胞の点で細胞死を大量に見ることが心配しないでください。これは正常であり、予想されること。
  5. 日に6と7フィード50％KSR-分化培地および50％N2-分化培地の15ミリリットルを持つ細胞は3μMCHIR99021、25 ngの/ mlのBMP4、および100nM EDN3を含む両方。
  6. 日8日そして9飼料25％KSR-分化培地と75％のN2-分化培地20mlを持つ細胞は3μMCHIR99021、25 ngの/ mlのBMP4、および100nM EDN3を含む両方。
  7. 11日目の細胞の再メッキに1.2.2に示すように日9および10にPO /ラム/ FNの料理を準備します。
  8. 3μMCHIR99021、25 ngの/ mlのBMP4、および100nM EDN3を含むN2-分化培地20mlで一日10フィード細胞上。

NC仕様のための液滴4.再プレート

  1. 11日目吸引ラム上/完全に準備されたPO / LAM / FNプレートと乾燥からFN。
  2. 、11日目の細胞から培地を除去し、PBSで洗浄し、そのような10cmの皿当たりのAccutaseとして4ミリリットルの細胞剥離液を追加します。 37℃で25分間インキュベートします。
  3. 皿にフルメラノサイト培地5mlを追加し、すべての細胞がプレートから浮き上がるまで、手動で10ミリリットルピペットでピペッティングして細胞を再懸濁します。 15ミリリットルチューブにサスペンションを転送します。
  4. スピン200×gで5分間、細胞ダウンとフルメラノサイト培地1ml当たり2×10 6個の細胞で細胞を再懸濁します。血球計数器または同等の技術上のトリパンブルー排除を用いて細胞数を計測します。
  5. 乾燥PO /ラム/ FN 10cmの皿に（彼らは触れず）互いに近接板10μlの滴。プレートは十分に乾燥された場合は、液滴が明確に定義されたエッジを持って実行しないでください。
    注：これは、拡張用の皿の中の部屋を維持しながら、細胞を再播種する際に重要である細胞のための高密度ローカル環境を作成します。
  6. ゆっくり（付着細胞を乱さない）全メラニン細胞培地10mlを追加し、液滴は、細胞が付着することを可能にするために10から20分間室温で放置します。インキュベーターに皿を移動します。

5.メラニン前駆細胞を拡大

  1. 2〜3日ごとにフルメラノサイト培地を供給し続けます。
    注：色素沈着がワット表示されるように開始する必要があります最初の週の終わりまでに、細胞のクラスターをithinと第二週によって非常に明確になります。このようなこれらの初期の小さな、暗いクラスタを識別するために一枚の紙のように白い背景の上にプレートを表示します。プレート全体が均一に着色さになるまで、細胞は、（ 図2Bを参照）、時間をかけて徐々に着色さになります。
  2. 〜1の割合で週に一度継代細胞：6（液滴としてメッキが、この段階ではもはや必要ではありません）。細胞を解離し、フルメラノサイト培地中で再めっきの前に、プレーン神経基本培地で2回洗浄するためのAccutaseを使用してください。 PO / LAM / FNプレート上の細胞を維持します。
    注：我々は、全メラノサイト媒体は維持し、ヒトES細胞とIPSC由来メラノサイトを拡大するのに最適であることを見出しました。しかし、細胞は、市販のM254培地中で簡単に培養することができるが、簡略化されたメディアは死んで、プレートをリフトオフ細胞のリスクを増大させます。

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結果

このプロトコルは、インビトロ無フィーダー、コスト効率の良い、そして再現可能な方法でhPSCsから完全に着色され、成熟したメラノサイトを導出するための方法を提供します。 HPSC由来のメラノサイトのために以前に確立された牙らプロトコルとは対照的に、概説したプロトコルは、馴化培地を必要とし、時間の要件を減少しません。牙らのプロトコルは、WNT3A産生マウス細胞株からの馴化培地を利用し、色素沈着6,12を視覚化するために6週間までかかりました。バイアスメラノサイト運命に向かって神経堤幹細胞（melanoblasts）のために、我々は（CHIR）初期のパルスの後にBMPおよびTGFβ阻害剤（それぞれLDNとSB）を除去し、その後、Wntシグナルの活性化を維持しながら、一日6時シグナリング外因性のBMP4とEDN3を紹介します6。その結果melanoblastsはKITとMITFの発現、ならびにSOX10 exprのメンテナンスを特徴とすることができますession 6。

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ディスカッション

hPSCsからメラノサイトの成功の分化のために以下の提案を考慮に入れなければなりません。何よりもまず、常に無菌培養条件下で動作することが不可欠です。さらに、多能性、完全未分化hPSCsで開始することが重要です。出発集団は、分化した細胞が含まれている場合、収率は常に汚染物質がメラノサイトに向けることができず、さらに適切に分化する細胞を破壊し得るよう低下します。

細胞が多能性幹細胞の維持のためのよく確立されたルールに従うことに注意してくださいまま確保すること。フィード通路定期的に継代する前に分化した細胞を除去するために、文化をグルーミング。分化のためのゼラチン状のタンパク質上に継代するとき、料理が正常に分化中に持ち上げから細胞を防止するために被覆されていることが重要です。

メラノブラストが異なりますentiationは、80％の細胞密度の周囲に開始すべきです。低すぎる密度が負の分化に影響を与えますしながら、高すぎる密度が増加し、細胞死につながります。継代すると、細胞をプレーティングする前に、任意の細胞剥離液を除去するために二回洗...

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開示事項

著者らは、開示することは何の利害を持っていません。

謝辞

この作品は、ジョアンナM.ニコライ財団からのメラノーマ研究者のためのフェローシップによってルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞F31下の国立衛生研究所によってサポートされていました。この作品は、さらにNYSTEMからの助成金やトライ機関幹細胞イニシアチブ（スター基金）を通じてサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
apo human transferrinSigmaT1147
アスコルビン酸 (L-AA)SigmaA4034100 mM
B27 (B27 Supplement)Invitrogen17504044
&β;-MercaptoethanolGibco-Life Technologies21985-02310 mg/ml
BMP4R&Dシステム314bp
CHIR99021Tocris-R&D Systems44236 mM
コレラ毒素ΣC805250 mg/ml
cAMP (cyclicAMP)ΣD0627100 mM
デキサメタゾンΣD2915-100MG50 μM
DMEM - ダルベッコの改変イーグル ミディアムGibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - ダルベッコの改変イーグル ミディアム: 栄養混合物 F-12Gibco-Life Technologies1133--032
DMEM/F12 粉末Invitrogen12500-096
EDN3 (エンドセリン-3, ヒト)American Peptide Company88-5-10B100 μM
フィブロネクチンBD バイオサイエンス356008200 μg/ml
ゼラチン(Mg/Caを含まないPBS)PBS
グルコースSigmaG7021
インスリンSigmaI2643
ITS+ユニバーサルカルチャーサプリメントプレミックス BD Biosciences354352
KSR (Knockout Serum Replacement)Gibco-Life Technologies10828-028
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-GlutamineGibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 mM
Low glucose DMEMInvitrogen11885-084
マトリゲル基底膜BD Biosciences354234DMEM/F12
MCDB201 MediumSigmaM6770
MEM 最小必須アミノ酸溶液Gibco-Life Technologies11140-080
マウス胚性線維芽細胞 (700 万細胞/バイアル)GlobalStemGSC-8105M
マウスラミニン-IR&D Systems3400-010-011 mg/ml
Neurobasal mediumInvitrogen21103049
Penicilin/StreptomycinGibco-Life Technologies15140-12210,000 U/ml
Poly-L Omithin HydrobromideSigmaP365515 mg/ml 
プロゲステロンΣP8783100% エタノール
Putrescine dihydrochlorideΣP5780
FGF2 (組換えヒト FGF 基本)R&Dシステム233-FB-001MG / CF10 mg / ml
SB431542トクリス-R&D Systems181410 mM
セレナイトΣS5261
重炭酸ナトリウムΣS5761
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) ペプロテック株式会社300-0750 Μg/ml
TYRP1 (G-17) 抗体Santa Cruz104431:200
TYRP2 抗体Abcam740731:200
Trypsin-EDTA (0.05%)Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 二塩酸塩Tocris-R&Dシステムズ125410 mM
ズヒトマトリックス ズ

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