この作品は、神経堤を介したヒト多能性幹細胞から色素沈着し、成熟したメラノサイトを生成し、無フィーダー、25日のプロトコルを使用して中間段階のメラノブラストするためのin vitroでの分化プロトコルを記述します。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、正常条件と疾患条件の両方でのヒトの発達をin vitroで研究するためのプラットフォームを表しています。研究者は、培養条件を操作して発生中に見られるシグナルを再現することにより、hPSCの目的の細胞タイプへの分化を指示することができます。そのような細胞タイプの1つはメラノサイトであり、これは神経堤(NC)起源の色素産生細胞であり、紫外線照射から皮膚を保護する役割を果たします。このプロトコルは、現在利用可能なhPSCからのin vitro Neural Crest分化プロトコルを拡張したもので、NCを完全に色素沈着したメラノサイトにさらに分化させるものです。メラノサイト前駆体は、デュアルSMAD阻害条件下でWNT、BMP、およびEDN3シグナル伝達の活性化因子に時限的に曝露することにより、Neural Crestプロトコルから濃縮することができます。得られたメラノサイト前駆体は、次いで精製され、選択培地での培養により完全に色素沈着したメラノサイトに成熟されます。得られたメラノサイトは完全に色素沈着し、成熟メラノサイトに特徴的なタンパク質に対して適切に染色されます。
概要
ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、疾患モデル、薬物スクリーニング、および細胞置換療法1-6のためのスケーラブルな方法で正常な分化を模倣するためのプラットフォームを提供します。特に興味深いのは、hPSCsは、患者のサンプルが不足している単離することが困難またはまれ/一過性の細胞型を研究するための道を開きます。また、人工多能性幹細胞（性IPSC）のユニークなメカニズム1,2,7-11を解明するために、患者特異的に開発し、疾患モデルを研究する研究者を有効にします。 hPSCsからメラノサイトの分化のための以前に公開されたプロトコルは、分化の6週間まで必要とし、L-のWnt3a細胞12からの馴化培地で細胞を培養することを含みます。 1プロトコル第1雲母らによって提示。、ここでは説明は3週間で色素沈着細胞を生成し、馴化培地に関連した曖昧さや矛盾を削除します。
メラノサイトのareは神経堤、脊椎動物に特有の細胞の遊走集団から派生します。神経堤は、原腸陥入時に定義され、神経および非神経外胚葉の間で国境を接する、神経板のエッジで細胞の集団を表しています。神経胚形成の間に、神経組織が 神経管13,14の結果背側正中線に収束神経ひだを形成するために、神経板から進化します。
神経堤細胞は脊索の向かい、神経管の屋根板か....
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プロトコル
注：ここで説明メラノサイトプロトコルが最初雲母らによって実証されました。
1.培養培地の調製、コーティングされた料理とhPSCsのメンテナンス
- ミディアム準備
注：最大2週間、暗所で4℃ですべてのメディアを保管してください。殺菌のためのすべてのメディアをフィルタリングします。- DMEM / 10％FBSを準備します。 885 mlのDMEM、100mlのFBS 10mlのペニシリン/ストレプトマイシン、5mlのL-グルタミンを混合します。殺菌のためのフィルタ。
- hESCの培地を準備します。 800 mlのDMEM / F12を200ml KSR、5mLのL-グルタミン10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液、βメルカプトエタノールに、1ml、5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを混ぜます。 10ng / mLのFGF-2を追加し濾過した後。
- KSR-分化培地を準備します820ミリリットルノックアウトDMEM、150ミリリットルKSR、10ミリリットルのL-グルタミン、10ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシン、10ミリリットルMEM最小必須アミノ酸溶液およびβメルカプトエタノール1ミリリットルを混ぜます。殺菌のためのフィルタ。
- N2-分化培地を準備します。 12グラムDMEM / F12粉末Iを溶解しnは980ミリリットルのdH 2 O 1.5....
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結果
このプロトコルは、インビトロ無フィーダー、コスト効率の良い、そして再現可能な方法でhPSCsから完全に着色され、成熟したメラノサイトを導出するための方法を提供します。 HPSC由来のメラノサイトのために以前に確立された牙らプロトコルとは対照的に、概説したプロトコルは、馴化培地を必要とし、時間の要件を減少しません。牙らのプロトコルは、WNT3A産生マウス細胞株からの馴化培地を利用し、色素沈着6,12を視覚化するために6週間までかかりました。バイアスメラノサイト運命に向かって神経堤幹細胞（melanoblasts）のために、我々は（CHIR）初期のパルスの後にBMPおよびTGFβ阻害剤（それぞれLDNとSB）を除去し、その後、Wntシグナルの活性化を維持しながら、一日6時シグナリング外因性のBMP4とEDN3を紹介します6。その結果melanoblastsはKITとMITFの発現、ならびにSOX10 exprのメンテナンスを特徴とすることができますession 6。
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ディスカッション
hPSCsからメラノサイトの成功の分化のために以下の提案を考慮に入れなければなりません。何よりもまず、常に無菌培養条件下で動作することが不可欠です。さらに、多能性、完全未分化hPSCsで開始することが重要です。出発集団は、分化した細胞が含まれている場合、収率は常に汚染物質がメラノサイトに向けることができず、さらに適切に分化する細胞を破壊し得るよう低下します。
細胞が多能性幹細胞の維持のためのよく確立されたルールに従うことに注意してくださいまま確保すること。フィード通路定期的に継代する前に分化した細胞を除去するために、文化をグルーミング。分化のためのゼラチン状のタンパク質上に継代するとき、料理が正常に分化中に持ち上げから細胞を防止するために被覆されていることが重要です。
メラノブラストが異なりますentiationは、80％の細胞密度の周囲に開始すべきです。低すぎる密度が負の分化に影響を与えますしながら、高すぎる密度が増加し、細胞死につながります。継代すると、細胞をプレーティングする前に、任意の細胞剥離液を除去するために二回洗.......
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開示事項
著者らは、開示することは何の利害を持っていません。
謝辞
この作品は、ジョアンナM.ニコライ財団からのメラノーマ研究者のためのフェローシップによってルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞F31下の国立衛生研究所によってサポートされていました。この作品は、さらにNYSTEMからの助成金やトライ機関幹細胞イニシアチブ（スター基金）を通じてサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| アスコルビン酸 (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| &β;-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&Dシステム | 314bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| コレラ毒素 | Σ | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Σ | D0627 | 100 mM |
| デキサメタゾン | Σ | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - ダルベッコの改変イーグル ミディアム | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - ダルベッコの改変イーグル ミディアム: 栄養混合物 F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 粉末 | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (エンドセリン-3, ヒト) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| フィブロネクチン | BD バイオサイエンス | 356008 | 200 μg/ml |
| ゼラチン(Mg/Caを含まないPBS) | PBS | ||
| グルコース | Sigma | G7021 | |
| インスリン | Sigma | I2643 | |
| ITS+ユニバーサルカルチャーサプリメントプレミックス | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| マトリゲル基底膜 | BD Biosciences | 354234 | DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM 最小必須アミノ酸溶液 | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| マウス胚性線維芽細胞 (700 万細胞/バイアル) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| マウスラミニン-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin Hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| プロゲステロン | Σ | P8783 | 100% エタノール |
| Putrescine dihydrochloride | Σ | P5780 | |
| FGF2 (組換えヒト FGF 基本) | R&Dシステム | 233-FB-001MG / CF | 10 mg / ml |
| SB431542 | トクリス-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| セレナイト | Σ | S5261 | |
| 重炭酸ナトリウム | Σ | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | ペプロテック株式会社 | 300-07 | 50 Μg/ml |
| TYRP1 (G-17) 抗体 | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 抗体 | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 二塩酸塩 | Tocris-R&Dシステム | ズ1254 | 10 mM |
参考文献
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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再版と許可
