子供からプライマリ鼻上皮細胞を培養し、人工多能性幹細胞に再プログラム

サマリー

この出版物は、子供からの鼻上皮粘膜のサンプリングと培養を成功させ、これらの細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングする方法を示しています。

要約

鼻上皮細胞(NECs)は、大気汚染物質に反応する気道の一部であり、呼吸器系ウイルスに感染した最初の細胞です。また、自然免疫応答や免疫間質細胞や気道間質細胞との相互作用を通じて、多くの気道疾患に関与しています。NECは、臨床訪問時にアクセスしやすいため、小児の研究に特に関心が集まっています。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、複数の細胞タイプから作製されており、ヒトの発生や疾患をモデル化するだけでなく、再生医療への応用も期待できる強力なツールです。これは、研究目的で小児参加者に由来するNECからiPS細胞を成功裏に作製する方法を示した最初のプロトコルです。この本では、小児から鼻上皮細胞を採取する方法、これらのサンプルから初代NEC培養物を作製する方法、および初代NECを十分に特性評価されたiPS細胞に再プログラムする方法について説明しています。鼻粘膜サンプルは、子供の大気汚染の影響に関連する疫学研究に役立ち、気道疾患を研究するための重要なツールを提供します。初代鼻細胞とそれらに由来するiPS細胞は、喘息やCOPD研究など、気道上皮生物学のさまざまな領域における患者特異的な研究に無限の材料を提供するためのツールとなります。

概要

ヒトサンプル（hiPSCs）から誘導された多能性幹細胞は、幹細胞研究の急速な発展技術です。彼らは、胚性幹細胞（hESCの）はるかに少ない倫理的、道徳的な欠点^1,2との研究に代わるものを提供しています。彼らはヒトES細胞^3-5のエピジェネティックに同一ではないですが、hiPSCsは、開発および疾患の表現型をモデル化するためのユニークな方法を提供し、彼らは、疾患状態^5-8に関連する組織に由来することができます。生成hiPSCsの新しい方法は、常に移植に適したGMP品質のiPS細胞を作製する方法として、で開始し、また、再プログラミングプロセス^6,9-11の適時性と効率性を高めるために最適な細胞型を同定するために探索されています。

気道上皮細胞は、アレルギー性炎症¹²の開発において重要である、と上皮はIMMUNとの相互作用を介してアレルギー反応と気道リモデリングの主要なドライバですeとの間質細胞。気道上皮は、喘息などの肺疾患の起源および持続性において重要な役割を果たしています。しかし、下気道上皮細胞は、特に健康な対照患者や子どもたちから、臨床の場で得ることは困難です。いくつかの研究からのデータは、大気汚染物質やアレルゲンに対する応答を研究する場合は特に、鼻粘膜から上皮細胞が下気道上皮細胞のための有効かつ実用的なプロキシであることを前提^13-20をサポートしています。鼻粘膜は、90％以上の繊毛気道上皮細胞で構成され、それが他の細胞/組織サンプリング技術よりも低侵襲性であるとされ、これらの鼻上皮細胞（NECS）をサンプリングすることは容易に、年齢4または5のように幼い子供にして行うことができますこのような感染^20-23のような有害事象のリスクが最小限に関連付けられています。それは、長い間、不必要な、そしてしばしば痛みを伴う気管支鏡。手順なしで健康と病気の両方の子をサンプリングするために迅速かつ簡単な方法を提供しています鎮静を必要と解像度。以前の研究は、喘息の重症度に関連する疾患のサブタイプは鼻粘膜、ならびに喘息の子供から採取した気管支細胞試料の両方で識別することができることを見出しており、2つの組織タイプ間の遺伝子発現は、非ユビキタス遺伝子²²の約​​90％で類似していました^、24。 iPS細胞の供給源としては、NECSは、他の頻繁に利用される細胞型に比べて利点を提供します。線維芽細胞は、多くの場合、IPSCを生成するために使用されているが、これらの細胞は容易に皮膚生検から培養することができるが、このプロセスは、典型的には、局所麻酔、切開、および縫合糸を必要とし、感染症のいくつかのリスクと関連しています。したがって、生検のこのタイプの患者からインフォームドコンセントを得ることが²⁵困難な場合があります。線維芽細胞の一つの代替は、末梢血単核細胞（PBMC）です。しかし、小児患者からIPSCを生成するために十分な血液を得ることが困難となります。また、下流APの制限があります線維芽細胞および血液細胞由来のiPS細胞、特定の細胞タイプ^5,26、特にそれらの分化能のために襞。したがって、相対的なアクセシビリティとその収集以下の副作用のリスクが低い与えられ、NECSは、小児集団からのIPSCを生成するための理想的な細胞源を表します。

性IPSCは、新規疾患モデルを生成し、人間開発を研究するためのプラットフォームとして、最近多くの注目を受け、パーソナライズされた治療用細胞の潜在的な供給源としています。この技術の全潜在能力を実現することができる前に、リプログラミング過程の分子基盤を解明する必要がありますが、今の内に概説され、このプロトコルおよび手順は、気道曝露に焦点​​を当てた調査研究を解明し、同様のためのプラットフォームを提供しますiPS細胞が関与する個別化医療の効果を研究します。

いくつかの研究室の共同作業はGENERATIOにつながっています鼻粘膜を採取するだけでなく、NECSを培養し、iPS細胞²³に、これらの細胞を再プログラミングするだけでなく、ために成功した技術のn個。この記事では、最適なサンプリング、培養、および再プログラミング条件のためのプロトコルの概要を提供します。

プロトコル

以下のプロトコルは、金融機関、人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。

1.鼻粘膜をサンプリング

注：呼吸器ウイルス感染の兆候がない被験者からのサンプルを入手します。

1. 参加者の訪問の前に、15ミリリットルの円錐形の新鮮なを準備し、2ミリリットルBEGM（気管支上皮細胞増殖培地）を加えた20μlの滅菌ペン/連鎖球菌/ファンギゾン（P / S / F）（0.01％）を追加します。
2. オープン細胞診だけで試料を採取する前に、ブラシ、および滅菌ブラシを保つようにしてくださいと鼻の表面以外の任意の表面に触れないでください。
3. じっと座っていると天井に向かって頭を傾けるために参加者を確認して下さい。小さい以上の落ち着きのない子供たちは手の上および/または離れてブラシを叩き避けるために横たわって座っています。
4. （小さなブラックホールのように見える）の通路が狭く鼻の奥にブラシを目指します。ダウンブラシをスライドさせ、ブラシがnostriから除去される手首をねじりますリットル。
5. 円錐形にブラシを配置し、BEGMに水没。余分なブラシをカットし、チューブのキャップを交換してください。 VORTEXしないでください。
   注：参加者が喜んであれば、同じようにが、第2の鼻孔に第2のブラシを得ます。両方の鼻孔のブラッシングを得ることは、サンプリングが成功する可能性が高くになります。同じ鼻孔をサンプリングする出血になることがあり、おそらくサンプルを改善されません。
6. 暖かい水を入れたビーカーを使用して輸送中、可能な限り37°Cに近いサンプルを保管してください。

2.セル数とサイトスピン

1. ゆっくりBEGMにブラシを攪拌し、血球計を用いて、細胞数のために10μlのサンプルを取ります。生/死染色の10μlを添加して、顕微鏡下でのみ生きた細胞を数えます。
2. 50μlのサンプルを取り、1×PBSで200μlに希釈します。 2分間300rpmでスライドガラスとスピンに取り付けられたサイトスピン漏斗に追加します。 followinドライO / Nと染色スライドをスライドさせてみましょうグラムの製造元の指示。好ましくは暗闇の中で、O / Nを乾燥することができます。
3. ヘマ3ステインで染色スライド
   1. 染色皿に（とヘマ3溶液II、深い青色;私はピンク、ヘマ3ソリューションヘマ固定液、ライトブルー）の各溶液を移します。使用しないときに覆われて保管してください。スライド染色ボートにスライドを挿入
   2. ディップスライドは連続して30秒間固定液で、次いで過剰を排出することができます。ディップは、私が30秒間、次いで過剰を排出することを可能にするソリューションで連続的にスライドします。ディップは、30秒間溶液IIで連続的にスライドし、次いで過剰を排出することを可能にします
   3. 水が透明に実行されるまで脱イオン水ですすいでください。暗闇の中で好ましくは、O / Nを乾燥することができます
4. 顕微鏡下でスライドを見て、細胞をカウントし、上皮細胞の割合を決定します。サンプリングが良好であれば90％以上でなければなりません。

3.播種細胞

注：適切と認定された組織培養内のすべての細胞培養手順を実行しフードは、無菌技術を使用して。

1. ウシ真皮コラーゲン（BDC）でコーティングプレートは、タイプ1は49.5ミリリットル1×PBSで希釈した3 mg / mlとBDCの0.5ミリリットルを追加します。ほんの数プレートを使用する場合は以下を準備します。コー​​ト2ミリリットルBDCとT25フラスコ、必要に応じて、2時間、無菌フードのO / Nまたは37℃でインキュベートします。
2. インキュベーション後、残りの液体を吸引します。無菌フードで30分間UV光にフラスコを公開します。ストア4℃で最大1ヶ月間のフラスコが、細胞を播種する前に、RTまたは37℃にそれらをもたらします。
3. シード準備ができるまで、37℃でBEGMにブラシと細胞を保管してください。静かにスウィッシュ円錐形の内部にブラシが、渦ありません。
   1. プレートT25フラスコ中の7×10 ⁵個^の細胞。以下である場合、例えば、6ウェルプレートの1ウェルとして小さな容器を使用します。このサイズのプレートは、約3×10 ⁵個^の細胞を必要とします。
      注：この多くの細胞が存在していない場合は、継続することはお勧めできません。
4. 無菌フードの下では、チューブの外にブラシを取るとGEntlyコーティングに傷を付けないように注意して、コーティングされたフラスコの表面にブラシを回転させます。適切なバイオハザード容器にブラシを破棄します。
5. ゆっくりと円錐の外とT25フラスコにBEGMで残りの細胞をピペット。顕微鏡下で細胞を観察します。浮遊細胞の数が観察され、この段階（ 図3A）で許容される鼻からのいくつかの破片があってもよいです。

4.細胞培養

1. 細胞を播種した後、それらを中断せずに48時間（ 図3）のために解決しましょう。 48時間後、ゆっくりと優しく暖かいBEGM 2ミリリットルを追加し、20μlの滅菌ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾン（P / S / F）。
   注：メディアの元の2ミリリットルを吸引しないでください。
2. 播種後4 ^日目に、慎重にすべての液体を吸引し、新鮮な4ミリリットルと交換し、BEGMプラス1×ペニシリン/ストレプトマイシンが（ファンギゾンはもはや必要ではない）温めました。 2日毎に培地を変更し、添付のための細胞を評価しますメント、成長、および合流。細胞は〜80％コンフルエンスに達した場合、通常2-3週間で、彼らは継代する準備ができています。
3. One T25フラスコ3 T25フラスコまたは1 T75フラスコに継代することができる（コンフルエントは、約2.5×10 ⁶細胞）。最初の継代後、細胞を3日ごとに約コンフルエンスに達し、堅牢かつ健康でなければなりません。

5.継代細胞

1. 静かにプレートから培地を吸引除去します。約4分のためのインキュベーターでプレートと場所にT25フラスコあたり1ミリリットル0.05％トリプシン溶液を追加し、または細胞がプレートから剥がれるまで。セルごとに2分の剥離のレベルをチェックし、より長い10分にトリプシンを放置しないでください。
2. 酵素を中和するために5ミリリットルのトリプシン中和溶液（TNS）、または血清含有培地を追加します。 15ミリリットルコニカルチューブにフラスコと場所からすべての液体とセルを削除します。
3. 5分間200×gで（加速0減速0）における遠心分離、細胞ペレットを得ました。吸引しsuperna新しいフラスコに必要な量でS BEGMで+ P /タント再懸濁細胞（T75フラスコ用T25フラスコのための4ミリリットル、10ミリリットル）
4. （2.1）上記のように生/死染色で細胞数を実行します。コー​​トフラスコにBEGM、細胞の適切な量を追加し、インキュベーターに戻します。上記に詳述したように維持するか、または1mlあたり0.5〜2×10 ⁶細胞の濃度で（70％BEGM、20％FBSおよび10％DMSO）凍結培地中で凍結保存。

性IPSC 6.リプログラミング

注：iPS細胞を生成する前に、人間性IPSCの生成と使用を管理するすべての機関の規制の遵守を確保します。培養培地は、日常的な抗生物質が含まれていないとして、滅菌技術は、IPSC培養のために特に重要です。 NECSは健康に見えるとロバスト成功した再プログラミングのために増殖していることが重要です。

1. プレート6ウェル組織培養プレートのウェル当たり5×10 ⁵ NECS。 24時間後、ポリブレンを追加BEGMへのメディアへのOct4、Sox2の、Klf4の、のc-mycを発現するレンチウイルス粒子を添加することにより、8 / mlのと伝達NECSの最終濃度まで。 〜5 ²⁷の感染多重度（MOI）を達成することを目指しています。
   1. MOIを決定するために、集中レンチウイルスストックの連続希釈液を準備し、これらの希釈液でHT1080細胞を形質導入。 HT1080細胞におけるdTomato式の明確に最初の検出後、dTomato陽性細胞/各希釈における細胞の小塊の数を採点することによって「形質導入単位/ ml」の数を計算します。
      注：一般的に、高すぎる希釈（すべてがdTomato正）と低すぎる（noneまたは陽性細胞の夫婦のみ）があります。
   2. 細胞の離散陽性細胞/小塊が識別された希釈液からスコアリングを行います。適切な希釈率で単位/ mlの形質導入の数を補正することにより力価を決定します。 MOIは、その後数の割合でありますウイルス粒子²⁷の数に形質導入した細胞の。
      注：各dTomato陽性細胞/小塊は、単一のウイルス粒子から発生すると想定されます。
2. 約3時間形質導入後、メディアを取り出し、新鮮なBEGMと交換します。制度-承認された手順を使用して、レンチウイルス含有培地を捨てます。 3日間インキュベーターに形質導入​​さNECSを返します。
3. 3日目に、新鮮なBEGMでメディアを交換してから、別の3日間インキュベートします。吸引除去は、メディアが、1×PBSで細胞を洗浄し、ウェルに1ミリリットル0.05％トリプシン溶液を添加過ごしました。上に書いたようにトリプシンで継代細胞（セクション5）。慎重に4ミリリットルBEGM + P / Sで上清と再懸濁細胞を吸引します。準備ができた場合細胞は、（次の手順を参照）、BDCでコーティングした6ウェルプレートの新しいウェルに継代し、またはMEF培養物に添加することができます。
4. MEFコーティングしたプレートを準備します。 4日目に、6ウェルの2ウェルに0.1％ゼラチン溶液を（1ミリリットル/ウェル）（実行するには+/- Thiazovivin（SPT）は、ステップ6.6を参照）を追加します。次の上当日は、不活性化されたMEF ²⁸のバイアルを解凍します。
5. MEF培地（DMEM + 1×NEAA + 10％のDFC）の10ミリリットルにしたMEFを置きます。ペレットに5分間200×gでスピン。 MEF培地で再懸濁。 6ウェルプレートから吸引したゼラチン及びゼラチンでコーティングした6ウェルプレートのウェル当たり1.87×10 ⁵のMEFを追加します。 O / N、37℃で、または24時間の最小インキュベート。
6. BEGMが以前にコーティングした6ウェルプレートの2ウェルにウェル当たり形質導入した細胞を含有し、O / Nインキュベートの譲渡2ミリリットル。翌日、4 ngの/ mlの塩基性線維芽細胞成長因子を含む標準hESC媒体のウェル当たり2.5ミリリットルでBEGMを交換してください。 10日間毎日新鮮なhESC媒体+/- SPTで細胞をフィード
   注：それはNECS ²³再プ ​​ログラミングの効率と速度を向上させるために、小分子（SB431542、PD0325901、およびThiazovivin（SPT）のカクテル）のカクテルを追加することが可能です。
7. 10日後、SPTなしのhESCのメディアを使用して、毎日餌を続けます。ヒトES細胞様コロニーまで毎日文化をフィード表示される（ 図5A、P0コロニー）。細胞質比および顕著な核小体：その高い核によって推定されるiPS細胞を保有するコロニーを特定します。
8. ヒトES細胞様の形態を使用して手動で物品税と移転コロニーは、フィーダーフリーシステムで別々のラインとしての文化や拡張のために井戸を分離します。切除されたコロニーは、これらの条件に迅速に適応する必要があります。
   1. 切除されたコロニーをメッキした後、これらの離散推定されるIPSCラインは現在、継代1（P1）と考えられています。 mTeSR1で毎日文化を養います。パッセージとは、標準的な手順を用いてIPSCラインを展開します。 p1のコロニーは、彼らが継代されるべきサイズに到達することは、週に数日かかる場合があります。

7.文化でiPS細胞を維持

1. フィードと毎日文化を評価します。手動で消費税の領域は滅菌ガラスピペットまたはマイクロピペットチップでこすることによって明白な分化を示します。毎日のピッキング後にメディアを変更します。
2. approxima後の継代細胞tely 4日毎：優しく吸引メディアは、6ウェルプレート（半分送り量）のウェルあたり1ミリリットル暖かいディスパーゼ（1mg / ml）を追加し、その後、約4分間37℃でインキュベートします。コロニーの縁は、コロニーの周りに白い輪郭のように見えている、持ち上げるために開始されます。静かにディスパーゼを吸引し、温めたDMEM / F12で3回洗います。
3. 2ミリリットルmTeSR1を追加し、プレートからコロニーを持ち上げるために、セルリフターを使用します。コロニーが小さいクラスタに分割されるまで、細胞を穏やかに粉砕するために5ミリリットルの血清学的ピペットまたはP1000マイクロピペットを使用してください。
   1. 生存とその後の増殖が次善であるように、非常に小さなクラスターまたは単一細胞を産生することは避けてください。コロニーを再メッキすると、1：4〜1：6分割が最適なコロニー密度を維持します。静かにプレートからコロニーとメディアを削除し、新しい、マトリゲル被覆ウェルに追加します。

結果

鼻前庭と呼ばれる鼻の最初の部分は、軟骨²⁹で囲まれた領域です。ブラシは鼻弁（口のinternum、または鼻孔の奥に見える「ブラックホール」）を超えて、鼻のこの領域を超えてスムーズに行く必要があり、サンプルは下鼻 ​​甲介（ 図1）から得られます。鼻甲介は、それらのサンプリングのための理想的な場所作り、鼻²⁹の表面積を増加させる骨構造です。領域も密接に下気道のライニングに似ており、環境曝露に対する免疫応答にもアクティブである血管新生し粘膜組織によって裏打ちされています。

正しい組織をサンプリングする再プログラムされた細胞が上皮細胞であることが保証されます。これは、初期細胞数及びサイトスピンによってだけでなく、培養中の細胞を観察することによって評価することができます。ザサイトスピンは、一度乾燥させ、スピンダウンし、そして染色された、サンプルの構成を示しています。ほとんどのサンプル...

ディスカッション

鼻上皮細胞（NECS）気道疾患を研究するためのアクセス可能なプラットフォームであり、NEC-iPS細胞は、疾患の発症、治療および治療^{​​1,31,32を}探索するエキサイティングな道を提供しています。 NECSは簡単にストレスの多いまたは潜在的に有害な手順^6,23なく得ることができます。我々の経験では、このプロトコルで説明したように鼻粘膜のサンプリングは、子供のための採血よりも知覚ストレスの少ない、より良いように思われます。したがって、この方法は、特に小児患者集団において有用と気道疾患の研究に関連し得ます。 NECSの他の利点は、それらが培養されているならば、上皮細胞は、培地および培養条件にするために選択され、均質になることです。これは、血液細胞のような複雑な組織を使用するよりも有利であり、それは容易にトランスクリプトームおよびエピジェネティックなアプローチを使用して、IPSCラインの結果として生じるで細胞起源の影響を評価することができます。

いつ鼻粘膜のサンプリングは、主に上皮細胞が取得されるように、顕微鏡（ 図2）

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mlの円錐	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-49D	プロトコルステップ1.1。
BEGM	ロンザ	CC-3170	プロトコルステップ1.1。
ペン/連鎖球菌/殺菌剤	ライフテクノロジー	ズ15240-062	プロトコルステップ1.1。
ペン/連鎖球菌生命	技術	15140-122	プロトコルステップ4.a。
cytosoft細胞診ブラシ	フィッシャーサイエンティフィック	22-263-357	プロトコルステップ1.2。
トリパンブルー	フィッシャーサイエンティフィック	MT-25-900-CI	プロトコルステップ2.1。
血球計算盤	フィッシャーサイエンティフィック	02-671-54	プロトコルステップ2.1。
PBS	フィッシャーサイエンティフィック	BP2438-4	プロトコルステップ2.2。
細胞学ファンネルクリップ	フィッシャーサイエンティフィック	10-357	プロトコルステップ2.2。
cytospin漏斗	フィッシャーサイエンティフィック	23-640-320	プロトコルステップ2.2。
Cytospin 4	ッシャーサイエンティフィック	A78300003	プロトコールステップ2.2。
空白のスライド	フィッシャーサイエンティフィック	S95933	プロトコルステップ2.2。
hema 3の汚れのキット	フィッシャー科学	22-122-911	のプロトコルのステップ2.2。
ウシ皮膚Colagen、タイプ1	Life Technologies	A1064401	プロトコルステップ3.2。
T25フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-45	プロトコルステップ3.3。
トリプシン	ロンザ	CC-5012	プロトコルステップ5.2。
トリプシン中和液	ロンザ	CC-5002	プロトコルステップ5.2。
ウシ胎児血清(FBS)、65°Cで加熱滅菌。C 30 分間	Sigma-Aldrich	F2442	プロトコル ステップ 5.5.
ジメチルスルホキシドHybri-Max™、滅菌ろ過、BioReagent、ハイブリドーマに適しています、≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650	プロトコルステップ5.5。
ポリシストニックレンチウイルス*	例ミリポア	SCR511	プロトコルステップ6.4.  リプログラミングベクトルの商用ソースがリストされています。Voelkel et al(PMID:20385817)によって報告された4-in-1プラスミドを日常的に使用して、VSV-G偽型ポリシストロン型リプログラミングレンチウイルスを社内で生成しています。このプラスミドは、
polybrene	サンタクルス	バイオテクノロジーsc-134220	プロトコルステップ6.4。
照射済みCF1 MEFs	GlobalStem	GSC-6301G	プロトコルステップ6.4。
hESCメディア		ステップ6.11	に含まれるレシピを参照してください
SB431542	Stemgent	04-0010	プロトコルステップ 6.11.
PD0325901	Stemgent	04-0006	プロトコルステップ 6.11.
チアゾビビン	Stemgent	04-0017	プロトコルステップ 6.11.
hESC認定のマトリゲル	BDバイオサイエンス354277		プロトコールステップ6.13。
コーニングプレート、6ウェル	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-1B	プロトコルステップ6.13。
mTeSR1	StemCell	5850	プロトコル ステップ 6.13.
250 ml使い捨てフィルターフラスコ(0.22 µm)	フィッシャーSCGP-U02-RE
	StemCell	7923	プロトコル ステップ 7.3.
DMEM/F12	Life Technologies	11320-033	プロトコル ステップ 7.3.
セルリフター	フィッシャーサイエンティフィック	08-100-240	プロトコルステップ 7.4.
hESC培地**			プロトコルステップ6.11. 成分を混合し、次いでフィルター滅菌する必要があります。メディアは4°に保つことができます。Cは最大2週間。媒体を温めるときは、37°Cで放置しないでください。C 15分より長い
DMEM-F12 50/50 培地	Invitrogen	11330-032	最終濃度
KO 補充血清 (KO-SR)	Invitrogen	10828-028	0.2
200 mM L-グルタミン	Invitrogen	25030-081	1 mM
55 mM ß-メルカプトエタノール	Invitrogen	21985-023	0.1 mM
100x 非必須アミノ酸	Invitrogen	11140-050	1x
2 µg/ml 塩基性線維芽細胞増殖因子 (b-FGF)	Invitrogen	13256-029	4 ng/ml

形フィ プロトコル。