の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション PilGで Xylella fastidiosa

Xylellaのfastidiosaはブドウでピアース病を含む、経済的に重要な作物の多数の疾患を引き起こすグラム陰性非鞭 ​​毛、病原性細菌である（ ヴィティスヴィニフェラ ^{L.）1,2、3。}この細菌は導水木部に限定されています船。ブドウの感染は、水ストレスや栄養不足³における木部船と結果の閉塞を引き起こします。成功植民地化は、植物³の残りの部分に感染の初期のサイトから移動する細菌の能力に依存します。運動性をけいれんすると、鞭毛に依存しない細菌の延長を経て動き、添付ファイル、およびXに特徴付けられている極性IV型線毛⁴の後退の手段でありますfastidiosa ^5,6,7。

単収縮運動性は、レーザーピンセット及び原子間力顕微鏡^{（AFM）8,9,10}により観察されました。これらの技術を用いて、TN.のIV型線毛によって生成された魔術の運動能淋菌およびP.緑膿菌は、FL uorescentlyラベリング線毛と微視的にその動きを捕捉することによって特徴づけられました。両方の方法は、個々の細菌の接着力を詳述しているが、手順が複雑で時間^9,10を消費しています。微小流体チャンバは、長距離個 ​​々の細胞の遊走、ならびに細菌細胞^5,6の小さな凝集物を観察するために使用しました。これらのチャンバは、タイムラプス画像記録システム^11,12,13,14と統合プレートに微細加工・ナノチャンネルとして設計されました。マイクロuidic室デバイスが移動行動や細菌の細胞間相互作用を研究するためのいくつかの利点を提供FL：（ⅰ）それは、複数のチャネル機能を備えた統合プラットフォームを提供します。 （ⅱ）それは細菌のナノスケールの特徴における単一細胞の運動や集計を調べることができます。 （ⅲ）それが直接メートルを可能にしますicroscopic細菌細胞の画像記録とタイムラプス解析、（iv）は、それは微小環境中の細菌の個々のおよび/または集団の長期的、空間的および時間的な観測を提供します。 （V）チャネルにおける培地の流量を正確に制御することができ、（VI）培地の非常に少量（1 ml）を各実験について必要とされます。

最近では、微小流体流動システムは、様々な微小環境^14,15,16の下で細菌細胞の挙動を調査するために採用されています。接着性およびE.の表面付着大腸菌 ^15、X. fastidiosa ^16、およびアシドボラックスは、ガラス表面への^14の微小流体チャンバーを用いて評価したcitrulli。 アシドボラックスcitrulliのIV型線毛によって媒介凝集し、バイオフィルムの形成は^、14を分析しました。 A.のさらに、運動流Cの下で観察citrullionditionsは、IV型線毛は、Aの植民地化と普及に重要な役割を果たしていることを実証しました樹液流条件下での木部船でcitrulli。 緑膿菌およびXのけいれんの運動能fastidiosa細胞が正常に微細加工フローチャンバー^5,6,17内の流体流れに逆らって観察しました。 IV型線毛は、XのpilBとpilQ変異体を欠損しましたfastidiosaは深く微小流体デバイス^5,6,18における流動条件でけいれん運動の速度を変更することが見出されました。微小流体デバイスにおける細菌の接着および運動性について行った研究は、微小流体チャンバが、インビトロで線毛媒介細菌の単収縮運動性および遊走を分析するのに特に適していることが示されました。これらの結果は、内の細胞 - 細胞付着、凝集・定着を促進するけいれん媒介移行メカニズムを説明しますホストは、最終的には全身感染につながります。

XのPIL-のCHPオペロンfastidiosaは、エンコード信号の伝達が^20を経路pilG、線毛、pilJ、ピル、chpBとchpCが含まれています 。膜貫通化学受容体は、ペリプラズムドメイン内の化学的刺激を結合して、最終的には細菌のけいれんの運動性を制御するために、それらの細胞質部分のシグナル伝達カスケードを活性化します。 Xのピル-のCHPオペロン中fastidiosa、ホスホシャトルタンパク質PilGはチェイに相同体です。 E.でcoliおよびP.緑膿菌、崔はべん毛モータータンパク質^19、21と相互作用する走化性システムのレスポンスレギュレーターです。 Xの病原性に向けてピル-のCHPオペロンの貢献が、 fastidiosaは 、最近²⁰の環境シグナルへとX.の規制/モータIV型線毛に応答した走化性オペロン中pilGの役割を調べましたfastidiosaは、UNCでありますリア。 Xの攣縮運動の活動に走化性レギュレータpilGの洞察を解明するために、 fastidiosa、微小流体チャンバーはXのけいれんの運動性を評価するために使用されますfastidiosa。 X.のfastidiosaのpilGは、 欠失変異体 のXfΔpliG、補完的な歪みXfΔpliG-Cおよびin vitroでその野生型の表現型を比較することを特徴としています。結果は、Xのけいれん運動中pilGの役割を強調表示しますfastidiosa。

1.細菌コロニーの周辺フリンジ

1. Xを育てます28℃でfastidiosa（ のXf）テメキュラ野生型^22、pilG欠失変異体のXfΔpliG（前述削除戦略^23を使用）、およびその相補XfΔpliG-C（以前染色体ベースの遺伝的相補戦略^24を用いて説明した）PD2培地寒天プレート上で²⁵ 5-7日のために、C。
2. 15分間121°C（249°F）で水にオートクレーブセロファン（1×1cm ²の）。 、セロハンの1枚をピックアップ空のペトリ皿にセロハンの一角に触れて水を抜く、慎重に寒天表面と空気乾燥の15％の上にセロハンを築きます。
3. 個々のXを拾いますfastidiosaコロニー滅菌丸い楊枝で寒天プレートに寒天表面の15％に重ねセロハンの滅菌シート上に無菌的に細胞を発見。プレートをインキュベート2〜3日間28℃でS。
4. 2X対物レンズと10倍の接眼レンズを解剖顕微鏡を用いて、コロニーのエッジ形態を調べます。コロニーの周辺のフリンジを撮影。

2.顕微鏡やマイクロ流体フローチャンバー

1. 以前^5,18に記載したものと同様のフォトリソグラフィ手順を使用したマイクロ流体デバイスを製造します。標準的なリソグラフィ方法^26を使用して、マスターのシリコンウェハ上のコンピュータ支援設計ソフトウェアを持つ4つの並列チャネルを設計します。
2. ポリジメチルシロキサン（PDMS）でシリコンウェハマスターからマイクロ流体チャンバを作成します。シリコンウエハーマスター上に未重合PDMSを注いで、1時間60℃でそれを硬化させます。ウェハマスターからPDMSのレプリカをはがし、ガラスカバースリップの同じサイズとして22ミリメートルX 40ミリメートルにブレードとPDMSレプリカをトリミングします。
3. PDMSのレプリカ、ガラスカバースリップ（22×40 mm ^2）とし、microscを公開2分²⁷用30 Wで空気プラズマにOPEスライド（51のx 76ミリメートル^2）。サンドイッチガラスカバースリップと微小流体室を構築するためのガラス顕微鏡の間にPDMS本体。
4. パターン化チャネルの各端部にPDMS貫通孔​​（5.5ミリメートル直径）ドリル。長い12〜20センチメートルにシリコーンゴムチューブをカットします。 PDMSレプリカのチャネルの各開口端​​部に、シリコーンゴム管（外径5.1ミリメートル、内径2.1 mmのを0.8mmの壁）の一端を挿入し、1時間60℃で重合していないPDMSとそれを密封します。
5. プラスチック製のルアーコネクタのとげの終わりにチューブの他端を接続します。アルミホイルで組み立てられたマイクロ流体チャンバをラップし、20分のためにそれらをオートクレーブ。
6. Xの細菌細胞を収集fastidiosa野生型、変異型のXfΔpliG、および相補XfΔpliG-C PD2培地プレートから使い捨て接種ループを使用して、掻き介して。細胞密度を調整しますPD2ブロス中の600nmで0.05の光学密度を、以前²³記載されているように。 1ミリリットルガスタイトシリンジに細菌の細胞溶液を収集します。
7. 倒立顕微鏡のステージ上にマイクロ流体デバイスをマウントします。 PD2ブロスを含む5ミリリットルガスタイトシリンジに導入管を接続します。シリンジポンプで5ミリリットルガスタイトシリンジを取り付けます。
8. 廃棄物容器に排出管を接続します。 0.2μL分の媒体流量を維持^-1で30分間、システムを安定化します。
9. 細菌細胞溶液を含む1ミリリットルガスタイトシリンジに側入口管を接続します。チャネルに到達するまで、ゴム管を介して細菌の細胞溶液を洗い流します。チャンバーからの事前の画像キャプチャに結合していない細胞をフラッシュするために0.2μlの分の媒体流量^-1別の30分間の維持。
10. 光を制御するために、顕微鏡の視野-調整部分の下顕微鏡シャッターをマウントします。シャッター共同にシャッターを接続しますntrolシステムやコンピュータにシャッター制御システムを接続します。
11. 顕微鏡のビデオポートにデジタルカメラをマウントし、それをコンピュータに接続します。タイムラプス撮影のソフトウェアを実行して、メニューから「シャッター」機能を選択して、ソフトウェアとシャッターへの接続を確立するためのソフトウェアでデフォルトとして自動的にインストールシャッターを認識しています。
12. 自動的にソフトウェアのデフォルトのキャプチャデバイスとしてデジタルカメラを認識し、ソフトウェアとデジタルカメラとの通信を確立するためにタイムラプスレコーディングソフトウェアのメニューから「デジタルカメラ」機能を選択します。
13. 20X位相差光学系を用いて、チャネルのいずれかで細菌細胞を見つけ、その後、画像キャプチャの前に40X対物レンズに切り替えます。
14. 顕微鏡から画像を取得するには、メニューからデフォルトパラメータを使用して、「画像取得」機能を​​選択し、タイムラプス録画ソフトウェアを実行します。次に、「タイムラプスを取得」機能を開き、6-24時間は、Xのけいれん運動性を観察するために必要な実験に応じての持続時間30秒^5,18,28に時間間隔を設定fastidiosa ^5,18,28。タイムラプス撮影を開始するために「OK」をクリックします。メニューから「スタック機能」をクリックして、録音を終えた後、コンピュータ上の保存先フォルダ内の画像をスタックに「名前を付けて保存」を選択します。
15. 複数のチャネルについては、6時間、最初のチャンネルから30秒ごとにタイムラプス画像をキャプチャします。標的細胞を見つけるために次のチャネルに顕微鏡の対物レンズを移動します。実験は4つのチャネルを利用するように設定されている場合は、4つのチャネルを順次それぞれの画像をキャプチャするために上記のようにタイムラプス機能を繰り返します。限り3として日間連続タイムラプス画像キャプチャを続けます。全ての実験は、室温（23±2℃）で行いました。
16. タイムラプス画像をコンパイルしますタイムラプス撮影イメージングソフトウェアを使用して、ビデオファイル。タイムラプス撮影のソフトウェアを実行して、メニューから「スタック機能」をクリックして、コンピュータから積み重ねられたファイルを開くには、「オープンスタック機能」を選択します。
17. すべての画像を選択し、「AVI」出力フォーマットを選択し、スタックモジュールから「映画を作る」機能を起動します。コンピュータ上の保存先フォルダ内のビデオファイルを保存するために「名前を付けて保存」をクリックします。
18. コンピュータ上の保存先のフォルダからコンパイルされたムービーを選択し、それらを再生。そして、生成されたビデオファイルの中の細菌細胞の単収縮運動の活動の結果の可視化を通じて単一細胞の運動性を観察します。

IV型線毛によって媒介される単収縮運動を示す周辺コロニー縞の存在は、Xのコロニーが観察されましたfastidiosa野生型および相補性のXfΔpliG-C株（ 図1）。ミュータントXfΔpliGは 、しかし、コロニーの周囲（ 図1）の周りにフリンジを示しませんでした。ナノマイクロ流体フローチャンバー内の細菌細胞のタイムラプスイメージングは、けいれん運動性は、両方の野生型X.で観察されたことを明らかにしましたfastidiosa相補XfΔpliG-C（補足V1、V3）、XfΔpilG変異細胞は、実験（補足V2）を通して運動性をけいれん示さなかったのに対し。変異XfΔpilGの細胞は、PD2ブロス（補足V2）に比較的小さな緩い凝集体を形成しました。 Xのとは対照的に、細胞fastidiosa野生型および相補XfΔpilG-C D PD2ブロス中のevelopedより大きな凝集体（ 図2、（補足V1、V3）。

図1：細菌コロニーの周辺フリンジ Xのコロニーマージン特性。野生型、変異型のXfΔpilG、およびセロハンの滅菌シートで覆われたPD2寒天上で増殖させ、相補XfΔpilG-Cからfastidiosa。変異XfΔpilGを除いて、全てのコロニーは、IV型線毛媒介けいれん運動性を示す、周辺フリンジを示しました。写真は培養培地上での増殖の5日後に採取しました。倍率バー、0.5ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図2：Xのけいれん運動 ナノマイクロ流体フローチャンバー内 fastidiosa 細胞 。全ての試験された株細胞の単収縮運動は観察の6日間記録しました。評価は、3つの独立したビデオ・セグメントから行われました。倍率バーは20μm。
注意：Xのけいれん運動性をfastidiosa細胞を単一細胞拡張を介してガラス表面を横切る移動、結合、極性IV型線毛の退縮によって特徴付けられます。単一セルが微細加工フローチャンバー内の流体流れに逆らって優先的に移行が観察された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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補足図1：4チャンネルマイクロ流体フローチャンバー 。各端の中でメディアおよびメディアアウトコネクタを持つ各チャネル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

補足ムービー1：運動性をけいれん。 （右クリックしてダウンロード）。野生型X.のfastidiosaのけいれんをマイクロ流体フローチャンバーに。

補足ムービー2：減損トゥイッチングラムの運動性。 （右クリックしてダウンロード）。Xfの変異体の運動性を。 XfΔpilGはamicrofluidicフローチャンバー内で観察しました。

補足ムービー3：復元けいれん運動。 （右クリックしてダウンロード）。 Xfの補完的な株の運動性をけいれん。 XfΔpilG-Cは、マイクロ流体フローチャンバーで観察しました。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。