血小板輸血と止血は、血液貯蔵血小板の機能を調査するために、血液再構成とマイクロ流体フローチャンバーを使用してモデル化されました。このデータは、血小板蓄積病変がin vitroで止血に及ぼす影響を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
>jove_content<輸血用に準備された血小板は、保存中に徐々に止血機能を失います。血小板機能は、さまざまな(間接的な)in vitro実験を使用して調査できますが、これらのどれもマイクロ流体フローチャンバーほど包括的ではありません。このプロトコルでは、血小板減少性新鮮血液を保存された血液銀行血小板で再構成して、血小板輸血をシミュレートするために使用されます。次に、再構成されたサンプルを、露出した内皮下マトリックスタンパク質の止血を模倣するマイクロ流体フローチャンバーで灌流します。献血、輸送、成分分離、保管、病原体の不活性化の影響は、ペアの実験デザインで測定できます。これにより、血液成分の調製におけるあらゆる操作が止血に与える影響を確実に比較することができます。私たちの結果は、温度サイクル、せん断速度、血小板濃度、および保存期間が血小板機能に与える影響を示しています。結論として、このプロトコルは血液銀行の血小板の機能を分析し、これは最終的に瀉血、輸送、成分調製、保管、輸血などの処理チェーンの最適化に役立ちます。
概要
止血は制限された時空間コンテキスト1で細胞、タンパク質、イオンと組織の組み合わせと調整活動が必要です。制御されていない活動は、血液凝固に関連する疾患のスペクトルに出血や血栓症および罹患率や死亡率につながる可能性があります。マイクロ流体フローチャンバー実験は、 インビトロで止血を模倣困難な技術です。このアプローチは、血小板のための先導的な役割で止血に参加するプロセスの複雑な相互作用の調査を可能にします。
血管損傷後、血小板は血液の損失を防止するために、露出した内皮下マトリックス（糖）タンパク質に付着します。接着に続いて、血小板が最終的にフィブリンおよび事務所の結果によって安定化された血小板のネットワークの形成につながるシグナル伝達を自動およびパラクリンに応答して活性化し、骨材、血栓2を封止巻か。他のほとんどの血小板機能検査、experiとは異なり、フローチャンバーを持つメントは、アカウントへの血流の物理的パラメータ、したがって、参加した細胞や生体分子3,4上のレオロジーの影響を取ります。
チャンバー実験フロー止血（サブ）に影響の重要なパラメータを変化させることによって、止血および血栓症の中で画期的な洞察を生成した接着剤マトリックス、レオロジー及び流れプロファイル、細胞組成、毒素または薬物、イオン強度および多くの存在を含む処理されます。過....
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プロトコル
このプロトコルは、ヒト試料の研究のための制度倫理指針に従っており、インフォームドコンセントは、関係する全てのドナーから得られました。ここに記載された実験の承認は、アントワープ大学病院の施設内倫理委員会から入手しました。
注：指定しない限り、温度表示は、常に室温です。
1.準備フローチャンバーのセットアップ
- レーン、チューブおよびピンの準備
- 渦激しくコラーゲン懸濁液および50μg/ mlの最終濃度になるように、プロバイダにより供給された等張グルコース溶液で1/20に希釈します。
注：私たちは、主にI型線維の構成された、ウマ腱コラーゲンを使用します。ウマコラーゲンI型はしばしば「HORM「コラーゲンと呼ばれ、歴史的なだけでなく、生物学的な理由の両方のためのアッセイ9のこのタイプの黄金の標準です。ヒトIII型コラーゲンを使用することもできるが、目eはあまりよくコートをフィブリルおよび血小板応答は、強力ではありません。他のコーティング表面は、例えばフォン・ヴィレブランド因子（VWF）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン-1、またはこれらの16の組み合わせのために、使用することができます。 - プロバイダーのコンテナから新しい使い捨てバイオチップを取ります。ここで使用されるバイオチップ....
- 渦激しくコラーゲン懸濁液および50μg/ mlの最終濃度になるように、プロバイダにより供給された等張グルコース溶液で1/20に希釈します。
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結果
アッセイ内変動を示すために、3つの同一の再構成された全血試料を、コラーゲン被覆された表面（ 図1）を介して同時に灌流しました。これは、8.7％の変動係数をもたらしました。この統計は、関連するサンプル間の信頼性の比較を可能にする許容可能なアッセイ内およびintralaboratory変化を示唆しています。
ここで説明する商業フローチャンバの入口は、測定チャンバに垂直であり、これは、その時点での代わりに層流のわずかに乱流を引き起こすことができます。特に抗凝固療法なしの実験では、これがために血液と固定化されたアゴニストの間に増加した接触時間の目詰まりの原因となります。詰まっ入口は、チャンバー内の下流の読み出しを混乱することができます。したがって、セットアップの一部がフローチャンバー（ 図2）を残しをコーティングすることにより最適化されました血小板アゴニストを欠い入口は、それによって一次および.......
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ディスカッション
マイクロ流体フローチャンバー実験は、血液の流れに血小板機能を調査するための優れたツールであり、実験的な文脈を変化させるインビトロでの止血を評価するために使用されます。貧しい施設間の標準化9にもかかわらず、我々は我々の研究室内実験変動が許容可能であることを示しています。これは確実に与えられた研究の範囲内（ペアリング）のサンプルを比較することができます。これは、血液バンク条件11における血小板貯蔵の有害な結果である血小板保存病変、のよく文書化現象を利用して検証しました。さらに、我々は最近、血液14,15の再構成以下のマイクロ流体フローチャンバー内のPCの血小板機能上の3つの利用可能な病原体不活化技術の影響を発表しました。
生物物理学的および-化学パラメータが20変化させたとき、血小板は異なる応答します。したがって、せん断応力、細胞数および細胞composiン、温度、コーティング、抗凝固剤と、より多くの要因が研究課題に応じて、このプロトコル内で変更することができます。このプロトコルは.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者には謝辞がありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BDバキュテナーチューブ(EDTA付き) | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | ホルダー付き採血針 |
| ピペットチップ 100-1,000 | グライナーバイオワン | 740290 | |
| ピペットチップ 2-200 | グライナーバイオワン | 739280 | |
| ピペットチップ 1-10 | エッペンドルフ | A08928 | |
| チューブ 5 ml | スインポート | 11691380 | |
| コニカルチューブ 15 ml | グライナーバイオワン | 1888271 | |
| 円錐管 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml シリンジ | BD | 309604 | |
| 精密ワイプ | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Figure S1 A で 'Biochip'Vena8 |
| チューブ | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Figure S1 Bで「使い捨てチューブ」と名付け |
| Vena8ニードル | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Figure S1Bで「ピン」バイオ |
| チップのシングルインレットケーブル用コネクタ | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-血栓 | Figure S1 Bで「再利用可能なチューブ」と「スプリッター」と名付け |
| られた加湿ボックス | Cellix | HUMID-BOX | |
| ソフトウェア マイクロ流体ポンプ | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) コラーゲンを希釈するための等張性グルコース溶液を補充 |
| HEPES緩衝生理食塩水(HBS) | ハウス調製 | 10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝生理食塩水(0.9%(w / v)NaCl、pH 7.4) | |
| 調製中の | ブロッキング緩衝液 | ハウス調製中の | 1.0%(w / v)ウシ血清アルブミンおよび0.1%(w / v)グルコースHBS |
| カルセインAM | 分子プローブC1430 | ||
| 白剤10% | ハウス | ハウスプレパレーション | |
| 0.1 M NaOH | インハウスプレパレーション | プレパレーション | |
| 変性アルコール | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo ナノポンプ | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | マルチフロー8.Figure S1 Aで「ポンプ」と「マニホールド」 |
| と名付けられた顕微鏡 | colibri-LEDと高解像度CCDカメラ | Zeiss | Axio Observer Z1 |
| ソフトウェア顕微鏡 | ツァイス | N/A | ZEN 2012 |
| 血液分析装置 | シスメックス | N/A | |
| 卓上遠心分離機 | エッペンドルフ | 521-0095 | |
| 血小板インキュベーター | ヘル | マーPF-48i | |
| インキュベーションウォーターバス | GFL | 1013 | |
| ピペット | ブランド | A03429 | |
| チューブローラー | Ratek | BTR5-12V | |
| 滅菌ドッキング装置 | テルモ BCT | TSCD | |
| チューブ シーラー | テルモ BCT | AC-155 | |
| ボルテックス | VWR | 58816-121 |
参考文献
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling netwo....
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