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方法論記事

昆虫モデルにおける視細胞分光感度の決意から

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DOI:

10.3791/53829

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2016年2月26日

 ,  , 
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2School of Life Sciences, University of Sussex

この記事について

サマリー

細胞内記録の電気生理学的技術を実証し、バタフライの複眼における単一の光受容体細胞の分光感度を決定するために使用されます。

要約

細胞内記録は、単一の細胞が与えられた刺激に応答することができる方法を決定するために使用される強力な手法です。ビジョン研究では、細胞内記録は、歴史的に今日でも使用されている異なる光刺激に対する個々の光受容細胞の感度を研究するために使用される一般的な技術となっています。しかし、目に細胞内記録実験を複製することを望む研究者のための文献で詳細な方法論の不足が残っています。ここでは、より一般的には目の生理機能を調べるためのモデルとして昆虫を提示します。昆虫視細胞は、眼の表面付近に位置するので、簡単に行くことができている、とビジョンに関与する機構の多くは、動物門を越えて保存されています。私たちは、電子が少し前に経験を持つ研究者へのこの技術は、よりアクセスしやすくすることを目標に、蝶の眼における光受容体細胞のin vivoでの細胞内記録のための基本的な手順を説明しますlectrophysiology。我々は、単一の細胞内へのガラス微小電極、最後に記録手順自体を挿入する方法、記録のためのライブ蝶を準備する方法、必要な基本的な設備を導入します。我々はまた、個々の細胞型の分光感度を測定するための生のレスポンスデータの基本的な分析を説明します。我々のプロトコルは、分光感度を決定することに焦点を当てているが、他の刺激（ 例えば 、偏光）及び方法のバリエーションは、このセットアップに適用可能です。

概要

例えば、神経細胞などの細胞の電気的特性は、電圧又は電流の変化として、細胞膜を横切るイオンの流れを測定することによって観察されます。電気種々の技術は、細胞内の生体事象を測定するために開発されてきました。動物の眼で見られるニューロンはアクセス可能であり、その回路は、これらの細胞を電気生理学的研究のための良い候補を作り、多くの場合、脳内のよりも複雑ではありません。目の中の電気生理学の一般的なアプリケーションは、電図（ERG）1,2および微小電極の細胞内記録を含みます。 ERGは、動物の眼内または上に電極を配置し、光刺激を印加し、全ての周辺セル3-6の応答の和として電圧の変化を測定することを含みます。一つは、個々の光受容細胞の分光感度を特徴付けるにおいて特に興味がある場合、多くの場合、複数の細胞型は、同時に与えられた刺激とは異なる強度で応答します。したがって眼におけるスペクトル的に類似した光受容体細胞のいくつかの異なる種類がある場合は特にERGデータから特定の細胞型の感度を決定することは困難です。 1つの可能な解決法は、眼の過半数R1-6細胞で発現関心の感光体（オプシン）遺伝子を有するトランスジェニックショウジョウバエを作成し、ERGを7を実行することです。この方法の潜在的な欠点は、感光体タンパク質8、およびトランスジェニック動物の作製およびスクリーニングのための長い時間枠の低発現に何が含まれていません。スペクトル的に別個の光受容体の少ない種類の目のために、着色されたフィルタを使用して、目の適応は、それによって分光感度極大9の推定を可能にして、ERGにいくつかの細胞型の寄与を低下させることを支援することができます。

細胞内記録は、微細な電極は、セルをimpales別の技術であり、刺激が適用されます。電極レコードだけがINDIVidual細胞の応答の記録と、複数の個々の細胞を分析して、生理学的に異なる細胞型の特定の感度10-14を得ることができるようにします。我々のプロトコルは、分光感度の分析に焦点を当てているが、シャープな電極を有する細胞内記録の基本的な原理は、他​​のアプリケーションに修正可能です。例えば、試料の異なる調製物を用い、かつシャープな石英電極を用いて、1は、提起された課題に応じて、脳内の視神経葉や他の地域でより深いから記録することができます。例えば、個々の光受容体細胞15の応答時間は、視神経内の細胞活性は、19にも同様の技術を用いて記録することができ、または色刺激は、偏光20と置き換えることができる16（薄層、髄質またはlobula 17）、脳18または他の神経節のローブ-22または運動は23,24を刺激しました。

光情報伝達、光による処理エネルギーが吸収され、電気信号に変換され、ほぼすべての今日の動物門25に共通の古代の特色です。視細胞で見られ、視覚的な光伝達を開始する責任視覚色素はロドプシンです。すべての動物におけるロドプシンは、網膜または類似の分子26,27由来するオプシンタンパク質、7膜貫通Gタンパク質共役受容体ファミリーのメンバー、および関連する発色団で構成されています。オプシンのアミノ酸配列と発色団の構造は、光の異なる波長にロドプシンの吸光度に影響を与えます。光子は、発色団に吸収されるとロドプシンは、最終的には膜結合型イオンチャンネル28の開口部につながる細胞内のGタンパク質のカスケードを開始する、活性化。ほとんどのニューロンとは異なり、光受容体細胞を光刺激の変化に応答振幅の相対的な変化として測定することができる段階的な電位変化を受けます。一般的に与えられました感光体の種類が唯一のオプシン遺伝子を発現する（例外は8,10,29-31存在しますが）。洗練されたカラービジョンは、多くの脊椎動物と節足動物に見られる種類のもので、それぞれが1つまたは時折それ以上のロドプシン型を発現する光受容細胞の数百または数千の複雑な目で達成されます。視覚情報は、色や動きの完全な画像の認識結果として、眼と脳内の複雑な下流の神経シグナリングを介して感光体モザイクを超える応答を比較することによって捕捉されます。

細胞内記録を介して異なる波長の光を光受容細胞の生の応答を測定した後、その分光感度を算出することができます。この計算は、光受容体細胞の応答は、それが32を吸収した光子の特定の特性にそれが吸収する光子の数に依存するが、ではないことを述べてUnivarianceの原理に基づいています。 absoである任意の光子応答の同じ種類を誘導するロドプシンによってrbed。実際には、これは、細胞の生の応答振幅が原因（より多くの光子が吸収する）、 またはそのピーク感度（その波長を吸収するロドプシンの確率が高い）に向けて波長のシフトに光強度の増加のいずれかに増加することを意味します。我々は、既知の強度と異なる波長での応答に同じ波長と同じ強度が、未知の相対感度で細胞応答を関連で、この原理を利用しています。細胞型は、しばしば波長におけるそれらの感度ピークによって識別されます。

ここでは、より広い研究コミュニティには、この方法は、よりアクセスしやすくに焦点を当てて、細胞内記録と蝶の眼における光受容体の分光感度の分析のための1つの方法を示します。細胞内記録は、特に昆虫における色覚に関して、文献に共通のままであるが、我々はthaのを発見しました材料および方法のトンの記述は、通常、技術の再生を可能にするにはあまりにも短いです。私たちは、その簡単に複製を可能にする目的で、ビデオ形式で、この方法を提示します。我々はまた、容易に入手可能で手頃な価格の機器を用いた手法について説明します。私たちは、新しい、複雑な技術を最適化する際、研究を遅く頻繁に報告されていない一般的な注意事項に取り組みます。

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プロトコル

全ての動物は、可能な限り人道的に扱われました。昆虫は、コスタリカ昆虫サプライ、コスタリカから蛹として出荷されました。

1. Heliconius蛹ケア

  1. ハングは、すべての蛹は虫ピンを使用して、加湿チャンバー内で2〜3センチメートル離間しました。
  2. 羽化後、翼は加湿チャンバー中に少なくとも1日の生きている蝶を維持し、記録する前に、毎日希蜜液を供給後、乾燥させます。
    1. 体積で約20％の蜂蜜溶液に水と蜂蜜を希釈し、浅いペトリ皿に注ぎます。
    2. ペトリ皿、1つずつ個別の蝶を持参してください。そのフロントtarsusの複数形で溶液に触れる際に、蝶が自動的にペトリ皿から自分proboscidesや飲み物を拡張します。その口吻が自動的に延長しない場合、アウト口先を引き、蜂蜜溶液にそれを導入するために鉗子を使用しています。

2.オプティカルトラック、キャリブレーション、およびMeasur試作光条件のement

  1. ハウジングとユニバーサル電源、明るい白色光を提供するために、少なくとも1メートル長いテーブルの一端に取り付けられた集光レンズアセンブリと150 Wキセノンアークランプを配置します。
    注意：キセノンランプは、強い紫外線強度で非常に明るい光を生成します。保護メガネを常に着用すると、製造業者の指示に従ってランプが大気中の酸素とUV光との相互作用によって引き起こされるオゾンの蓄積を防止するために使用されるべきです。
  2. （ 図1）を通過するようにハウジングアセンブリを出る光のための長さは光学トラック1メートルを設定します。
    1. 離れておおよその距離を有する光学トラック上の次の順序での場所：1）40センチメートルコンデンサーアセンブリから凸シリカまたは石英レンズ、2）さらに沿った光路で現在フィルタなし）22センチメートルと中性フィルターホイール（ 14センチメートルNDフィルタからの駆動ユニットとトラック、3）シャッター秒、さらにトラックの遠端に沿って4）凹面シリカ又は石英レンズすぐ隣のシャッター以下、及び5）コリメートビームプローブ6 cmです。
    2. コリメートビームプローブに600μmの直径の光ファイバケーブルを貼り付けます。
      注：光の強度に応じて5〜10 mmの直径の光ファイバケーブルは、他のプレップに十分な光を提供するために必要とされてもよく、この置換されていてもよいです。
    3. アセンブリを出る光ビームは、可能な限り最高の強度であるように、各光学素子の距離、高さと角度を調整します。
    4. 光学トラック要素は、異なるアプリケーションと多少異なる場合がありますように、すべての要素がUVAと可視範囲（315から700ナノメートル）の光を透過することを確認してください。
  3. 光学トラックが組み立てられると、分光計を使用してセットアップを通過する光を測定します。既知のスペクトルとメーカーのソフトウェアを使用してキャリブレーションランプを使用して第1の分光器のキャリブレーションを行います。
    注意：私たちは、次は、明確にするためにオーシャンオプティクス製品を使用して設定するが、他のメーカー（ 例えば 、Avantes）が同等の製品を販売して説明します。
    1. 測定を行う前にタングステンキャリブレーションランプ少なくとも45分をオンにします。
    2. キャリブレーションを行うには、関連するソフトウェアがインストールされているコンピュータにUSB経由で分光器を取り付けます。その後、紫外可視透過コサインコレクタを介してタングステン校正ランプに分光器を接続してください。
    3. 「ファイル」タブから「新絶対放射照度測定」を選択し、として分光器を選択し、「ソース」。
    4. 新しいキャリブレーション「CAL」ファイルを作成するために、画面の指示に従ってください。プロンプトが表示されたら、自動的に分光器の出力から補正スペクトルを計算するソフトウェア、に可視光領域（300〜800 nm）のタングステン校正ランプの既知のスペクトルのため提供されたデータファイルをロードします。
    5. キャリブレーションファイルを保存します。時のinitiこのファイルをロードします分光計を用いて光スペクトルのすべての将来の測定のためのソフトウェアをalizing。
  4. 分光計を校正したら、実験からの光のスペクトルを記録するために、これを使用しています。ソフトウェアを開いたとき以後、「新絶対放射照度測定」を選択し、以前に保存したキャリブレーションファイルをロードします。次分光計にすべての光を遮断することにより、ダークスペクトルを取ります。
    1. 分光計は、現在の所望の実験の光条件を測定することで、積分時間（4秒）を調整し、平均化するためのスキャン（5）、及びボックスカー幅（5）ので、スペクトルが正しくスケーリングされ、平滑化されます。異なる測定からの光強度を比較することができるように、すべてのスペクトル測定のために同じ設定をしてください。
  5. すべての中性密度フィルタを実験の間に使用されるために、減衰白色光についてのスペクトルを測定し、各バンドパス干渉フィルタのため（ 図2）。
    1. M分光計にステップ2.2.2から光ファイバケーブルの自由端を固定することにより、光路内の任意のフィルタなしで、白色光スペクトルをeasure。ステップ2.3からロードされたキャリブレーションファイルを使用して、テキストフ​​ァイルとして分光器のソフトウェアを使用して白色光スペクトルを保存します。
      注：スペクトルは保存されたテキストフ​​ァイルは、波長をリストとして（X座標）の列と第2列の光の強度（y座標）は、データがステップ2.6スプレッドシートにロードすることができるようにします。
    2. ステップ2.5.1と同じ設定を使用して、光学トラックに中性濃度（ND）フィルタホイールを回転させることによって、実験中に使用されるそれぞれの光学密度（OD）（0〜3.5 OD）からのスペクトルを記録し、テキストフ​​ァイルを保存します各OD。
    3. ステップ2.5.1と同じ設定を使用して、10nmの半値幅の干渉フィルタを光路内に1つずつ配置し、各フィルタについて観察されたスペクトルを記録します。 41異なる干渉フィルタワットごとに、この手順を繰り返しi番目のピーク透過率は、300〜700nmの10nmごとに離間しました。さらに離れ（20 nm）の間隔をあけフィルタはほとんどの用途に許容される（スペクトルについて、 図2を参照）。
  6. 干渉フィルタは、光路に配置されたときに、光の強度の違いを補正します。各干渉フィルタは、光子の異なる総数が通過することを可能にし、いくつかのフィルタの低透過率は、すべてのフィルタは、光子の同数を許可するように、それは難しい、さらに強度を減衰させることができます。
    1. 各10 nmの帯域幅の干渉フィルタのための相対強度（I）を計算するために、Tは（2.5.3から）各10 nmの干渉フィルタのスペクトル曲線下の面積で表現、私は= T /秒、中に私のために解決、およびsは、各フィルタのピーク波長における白色光の最大絶対放射照度（2.5.1から保存したテキストファイルのy値）（520 nmでの例については、 図2を参照）です。
    2. すべての計算されたintensitを分割一つに正規化し、各波長での生の感度に適用される補正係数として使用するための相対的な正規化された値の逆数を取る2.6.1で算出した最大強度値によってIES（ステップ6.4参照）。
  7. 一度だけの実験のセットの前に、手順2.6を介して2.1を実行します。実験の過程で定期的に光刺激の強度が変化しないことを確認するため、明るい光とNDフィルターの下のキセノンアークランプの絶対放射照度を記録。
  8. 干渉フィルタを透過した光を任意の細胞応答は最大応答振幅に近づくと、実験の過程で、信号を減衰させるためにNDフィルターを使用しています。 NDフィルタは、実験中に使用される場合、分光感度の計算中強度の対応する減少を占めます。
  9. 光学トラックを設定し、キャリブレーション、および実験を開始する前に数日または数週間をフィルタリングします。フィルタをキープ埃の蓄積を防ぐために覆われました。

3.録音機器のセットアップ

  1. このようなカルダン腕周囲長（図については、 図3を参照）のようなファラデーケージを介してキャリブレーションに使用したのと同じ光ファイバケーブルをフィードし、ゴニオメトリックデバイスにマウントします。ケーブルは約10cm離れた標本の目からになります。
  2. 電極ホルダーに振動分離されたテーブルの上に金属ステージを配置し、マイクロマニピュレーター（ 図4）の制御下に直接ステージ上に取り付けられました。検体の頭部が腕の回転運動によって作成された球の中心にくるようにカルダンアームを配置します。
  3. （ファラデーケージ外）増幅器を含む細胞内のプリアンプ・システムを使用して、プリアンプ（ファラデーケージの中にある予備校の近くにヘッドステージは、）試料が配置される金属ステージ上にヘッドステージをマウントします。
    1. ヘッドステージに同軸ケーブルを接続経由BNC接続。同軸ケーブルのもう一方の端に開いた先端のみを分割して、インナーワイヤからのケーブルの外側金属シースを分離します。
    2. もう一方の端のワニ口クリップ付き絶縁銅線の一端に（グランド電位に保持）外部シースを半田付けします。このワニ口クリップは、試料プラットフォーム（ステップ5.1.4）上の金属参照電極に付着します。
    3. 記録電極として機能するように、細い銀線に同軸ケーブルのインナーワイヤをハンダ付けします。このワイヤは、ステップ5.2.3で解決策を充填したガラス電極に供給するのに十分に薄くなければなりません。
  4. 目の中に電極を下げることで振られ、電極が目にしたら出て再び戻って揺動させることができるように、ファラデーケージの外に木製のベンチにスイングアームとベースに取り付け実体顕微鏡を配置します。
  5. ファラデーケージの内側に必ずすべての金属を作ることが適切に接地されています。
  6. ファラデーケージの外で、preamplifを添付50〜60 Hzのノイズリデューサ（オプション）の入力に小胞体、およびBNC T-アダプタを使用して、オシロスコープの1​​チャンネルに出力を接続します。
  7. T-アダプタのもう一方の端を使用して、ハードウェアの1チャネルにオシロスコープを通過する信号を接続します。プリアンプで記録された応答は、コンピュータ上のソフトウェアで読み取ることを可能にするUSB​​ケーブルでコンピュータにこのハードウェアを取り付けます。
  8. 別のT-アダプタを使用して、オシロスコープの2番目のチャネルを光学トラックからシャッタードライバを添付し、目（ステップ5.5）に供給される光点滅の頻度および持続時間を制御するパルス発生器にこれを接続します。
    注意：リグ自体のセットアップは一度だけ実行する必要がある必要があります。録音を開始する準備ができるまで、ここで休憩。

レコーディングの日に4準備

  1. 実験前キセノンランプ、少なくとも45分の電源をオンにし、PUL前のガラス微小電極プラー少なくとも30分をオン玲ガラス電極。
  2. 全ての記録機器（シャッター、アンプ、ノイズ除去、パルス発生器、オシロスコープ、およびデータ集録ハードウェア）をオンにして、光が光ファイバケーブルを通過しないので、シャッターはデフォルトで閉じられていることを確認してください。
  3. 細かいホウケイ酸（またはアルミノシリケート）、ガラス微小電極プラーを用いてガラス微小電極を（100から250MΩの抵抗が理想的である）プル。引っ張られるのほんの数時間以内にガラス電極を使用してください。
  4. 3 M塩化カリウム（塩化カリウム）で電極を埋め戻し。注入染料、例えば 、この溶液は、研究者のニーズに応じて変更されてもよいことに留意されたいです。

5.試料準備と録音の手順

  1. 試験片を準備
    1. ヘッドは不動とチューブの一端から突出しているので、ホットワックスで小さなプラスチックチューブ内の個々の蝶を貼り付けます。吻、アンテナ、および翼（ 図5）を押しWAX。
    2. トンを押しながら彼は、ワックスの乾燥片と腹部と腹部の後ろにチューブ内のウェットティッシュを置くことによって加湿チューブを保持します。試料が完全に不動であることを確認します。
    3. 磁気ベースに取り付けられたボールソケットジョイントを持つ小さなプラットフォームにワックスの小片を使用してチューブをマウントします。
    4. 解剖顕微鏡下では、参照電極として使用されるように口器を介してヘッドに0.125ミリメートル径の銀線を挿入します。実験の前に、恒久的にプラットフォームは記録のためにステージ上に配置されると、ステップ3.3.2で銅線がそれの上にクリップできるような方法で、プラットフォームにワイヤーを固定します。
    5. 参照電極は、適切な位置になると、それは迅速に溶融した後、ワイヤの周りにワックスを冷却して所定の位置に保持することができます。
    6. ブレードホルダーで破壊可能な炭素鋼かみそりの刃、刃のグリップ部を使用し、角膜を切断するために使用する小片を断ちます。
    7. 〜（10 ommatidiを小さな穴をカット左の角膜における直径）カミソリの刃を使用し、乾燥を防ぐために、ワセリンで穴を塞ぎます。
  2. 角膜が切断されると、眼の中の体液を迅速に硬化するため、可能な限り迅速に眼の中に記録電極を挿入し、それが不可能に電極を挿入することを可能にします。可能な場合は、記録が行われるリグに解剖を行います。
    注：これは光学系をデフォーカスされますようワセリンは、目の残りの部分に塗布するべきではありません。
    1. ない既にステージ上場合は、記録リグでステージ上に搭載された試料とプラットフォームを配置します。ワニ口クリップを使用して試料のプラットフォーム上の基準電極へステップ3.3.2からヘッドステージアース線を接続します。
      注：動物を照明する赤フィルタを使用可能な場合。
    2. 眼の中に記録電極を下げながら、簡単にステレオスコープの下で試料を点灯するグースネック添付ファイル付きの光源を使用してください。
    3. にガラス微小電極の後ろにKCl溶液にステップ3.3.3からヘッドステージに接続された銀線をSERT。電極ホルダーのガラス電極をマウントします。
    4. 微小電極は、以前に角膜上記ミリメートルについて、角膜にカット穴の上に直接あるので、電極ホルダを調整します。オシロスコープ上の潜在的に大きな変化（MV）で示されるように回路が完成するまで、マイクロマニピュレーターを用いて、眼の中に微小電極を下げます。
  3. いったん目に、ファラデーケージ外にステレオスコープをスイングし、標本を照明する光源をオフにします。目は暗順応になるので、部屋が暗い保たれるべきです。
  4. アンプから1 nAの電流を印加し、電圧の変化に注目することによって、電極の抵抗を確認してください。抵抗は、一般的に100から250MΩ間の範囲であるべきです。高い抵抗があるelectrの閉塞の指標や電極の曲げ、および低抵抗で頌歌破損。
  5. シャッターが0.5秒ごとに50ミリ秒の持続時間を有する光のフラッシュを可能に開くように、パルス発生器を活性化し、そしてそれは実験期間中点滅継続することができます。
    1. それは最大50ミリ秒の持続時間の点滅を可能にするように、パルス発生器を調整します。点滅間のこの期間および0.5秒のポーズは、実験中に可能な限り暗順応に近いように試料を保持します。五十ミリ秒は長いフラッシュ期間として応答で同じ振幅を誘発する最も短いフラッシュ期間の近隣にあります。
    2. 実験（ステップ5.16）の始めと終わりの両方におけるRe-措置応答。約20分間の実験の過程で、これらのフラッシュの設定は、時間をかけて応答を低下させることはありません。別のプレップは、これらのフラッシュ設定の調整が必要になる場合があります。
  6. 光ファイバケーブルは、目に向けられるようにカルダンアームの位置を調整します。
  7. 各光フラッシュと電圧変化のためのオシロスコープを確認してください。電圧の負の変化は、電極がまだセルに入っていないことを意味します。
  8. それは最大電圧応答が存在する時に目には角度で配置されるまで、試料の周りカルダンアームを移動します。
  9. 軽く電極ホルダのベースをタップするか、プリアンプにバズの機能を使用しながら、両方の方向に電極の非常に小さな縦の動きを引き起こし、前後にマイクロマニピュレーターを回します。脱分極光応答はオシロスコープ（ 図6）に表示されるまで微調整を行うことを続行します。
  10. 光のフラッシュが最大の脱分極信号を生成する入射角を見つけるために、再度カルダンアームを調整します。マイクロマニピュレータとの微調整を行い、電極を安定的に細胞を記録し、それが全体の実験のために細胞内にとどまることされていることを確認し、必要に応じてアンプのバズの機能を使用する（ステップ5.11を参照してください）​​。
  11. セットアップが安定したら、RECOを開始rding。 （：対雑音比1信号少なくとも10）安定した記録が無い静止電位の変化、低バックグラウンドノイズ、および一貫して大規模な脱分極応答に少しを持っている必要があります。
    1. コンピュータにソフトウェアを実行し、4つのチャネルでポップアップウィンドウを開きます」新しい実験を、 "開始。
    2. 500 mVのにソフトウェアのウィンドウの右上に電圧スケールを調整します。信号をオシロスコープを介してデータ集録ハードウェアに供給されている場合は、2番目のチャネルは、ファンクション・ジェネレータによって生成された方形波を記録しつつ、第1のチャネルは、シャッターが開いているときに示す、リアルタイムで電極から記録された応答を表示します。 。他の2つのチャネルは不要です。
    3. 録音を開始し、ソフトウェアは実験期間中に実行できるようにするには右下の隅で「スタート」をクリックしてください。応答が明確になるように、軸X（時間）とy（電圧）のズームを調整します。
  12. まず、白色光で、3.5 OD（約5〜10秒）で、NDフィルタホイールと10個々の応答まで録音。
  13. 次のレコード0.0 ODまでのすべての組み合わせで3.3 ODでの回答の数が同じ場合、3.1、3.0、2.5、2.3、2.1、など。 NDフィルタシリーズにこれらの応答振幅は漂白が発生した場合は、第6節で応答ログ強度曲線を提供し、実験の過程で明るい刺激の少ないフラッシュを使用します。
  14. 干渉フィルターを使用して、全ての波長に対する細胞の応答を記録します。
    1. 第1のピーク波長を見つけます。光路（0.0 OD）でのNDフィルターなしで、光路にUV透過フィルタを配置し、簡単に応答振幅を観察します。ピーク応答がされる場所のいくつかのアイデアを与える必要があり、青色透過フィルタ、緑色透過フィルタ、赤色透過フィルタ、と繰り返します。
    2. にピーク感度の一般的な領域を見つけるために、約350、450、550で650 nmでのフィルタを使用ステップ5.14.1。すべての波長が次のステップに記録されますので、正確な波長は、この初期探索段階では重要ではありません。推定値は、ピーク感度の存在、またはそれらは以前に記録されている場合は、すぐにピーク応答を識別することが知られている波長を使用しています。
    3. ピーク応答またはそれに近いが識別されると、10の応答（約5秒）のために、この波長での記録。
    4. ピーク応答の波長で記録した後、他の干渉フィルタを持つレコード、10 nmのステップで300〜700ナノメートルから。ピークからスタートし、ピーク応答が520nmである場合、この波長まず、その後、510 nmで記録応答は、530に続いて、例えば （1により光路1からのフィルタを交換することにより、両方の短いと長い波長に向かってステップアウトナノメートル、500ナノメートル、540ナノメートル、490ナノメートル、550ナノメートルなど無応答には存在しなくなるまで）。
    5. フィルタごとに最大10の応答（5秒ずつ）を可能にします。干渉フィルターを交換する時、細胞はRESPを可能にします二のピーク応答は、時間の経過とともに劣化されているかどうかを監視するために有用である光路、内の任意のフィルタなしの白色光の1-2点滅します。応答の数を減らすか、漂白が発生した場合にODを増加させます。
  15. 任意の干渉フィルタの下の応答が0 ODにおける白色光の下での最大応答に近すぎる場合には、NDフィルターで減衰させます。干渉フィルタと、この実験で用いた光ファイバケーブルのサイズが大きく、光の強度を減衰させるので、NDフィルタは、典型的には必要とされません。
  16. 記録は、以前の応答振幅を確認するためのpseudoreplicateとして機能し、応答が時間の経過とともに劣化していない確実にするのに役立つピーク応答、周囲に安定し、再記録波長残っている場合。一旦全ての波長は応答がステップ5.12のように、NDシリーズの下で、再記録に記録されています。
  17. 記録が完了し、クリックしたら、ソフトウェアの「停止」、および分析のために記録を保存します。
  18. 実験後、凍結、または迅速に頭を切断し、胸部を粉砕し、その後数分間冷却することにより個人を犠牲に。
  19. すべての機器をシャットダウンします。分析を行う前に、必要に応じて、ここで休憩。

6.分光感度解析

  1. ソフトウェアは、生の応答を記録するために使用して、ND系列に、各干渉フィルタの各フィルタ10の個々の応答の平均応答振幅を計算します。
  2. ステップ5.12から5.13（ 図7）に記録されたNDフィルタシリーズからの応答ログ強度（VlogI）関数を作成します。 X軸上の強度（OD）の対数単位をプロットすることによってこれを行い、そしてy軸上の各々の強度に応じ。
    1. 異なる波長でセルの分光感度を導出するために、一般的にステップ6.2からのデータへの那珂ラシュトン式に合わせて、異なる波長のトンの実験的に得られたスペクトル応答を関連付けるために、この方程式を使用O相対光子は一定の波長（この場合には、白色光）の下で、その応答を誘発するのに必要。
      注：那珂ラシュトン式は、V / V maxの =私は、n /（I N + K n）で、私は刺激強度であり、Vは応答振幅で、V maxは最大応答振幅であり、Kは刺激であります半V maxに与え強度、nは指数関数の傾きです。種々の方法がVlogI曲線フィッティングソフトウェアを含むデータ、またはコードベースの統計パッケージにこの式をフィットするために使用することができます。
    2. 簡単な計算やスプレッドシートプログラムを使用して、那珂ラシュトン方程式を適合させるために、それぞれの刺激強度のためVlogI応答データを変換：ログ[（V 最大 / V） - 1]。そして、最高のフィットの直線の方程式を得るために変換されたデータに線形回帰を行います。
      注：V maxは 、任意の測定された応答よりも大きくなければなりません。この一貫性を保つために、この方法は、1％のGREとしてV maxを推定します最高測定された応答よりもATER。
    3. 回帰直線の式から、（K）はy切片/ N =負の勾配をとることにより指数（n）を推定し、ログインします。
  3. V MAX、N、およびKのためのパラメータ（V）として与えられた波長で測定されたスペクトル応答を接続し、解くことにより、各波長でのセルのスペクトル応答を誘発するために必要な光子の相対数を決定し、推定された後I.用
  4. 各波長で（ステップ2.4​​.3）から各干渉フィルタのための補正係数により、ステップ6.3から算出刺激強度（I）を乗算します。
  5. 彼らは比較することができるので、感度を得るために、すべての強度がVログ-Iカーブに関連していなければなりません。 V 最大またはKを1/2に各波長の強度を関連付けることにより、これを行い、ステップ6.2.3で算出しました。
    1. K.から各補正された波長強度（ステップ6.4）を引きます
    2. 次に、各波長の強度のために、「これを追加（-1）によってKのK "値からの距離、および乗算します。
    3. 次の各波長に直列に最も低いデータ点の絶対値を加算することにより、正のすべてのデータポイントをもたらします。
  6. ステップ6.5.1からすべて新しく計算された強度の逆数をとることによって、各波長での感度を探します。感度スペクトルが0と1の間に収まるようにデータを変換します。
  7. 同じタイプの平均の2つ以上のセルからの標準誤差バーまたは95％信頼区間（ 図8）で、最終的な応答プロットを記録しました。

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結果

録画設定の多くの要素については、書面による説明は十分な詳細情報を提供していません。 図1は、完全な記録のセットアップに含まれるコンポーネントの概略図です。 図2において、スペクトルは補正係数が必要とされる理由の感覚、何この補正を計算するために必要とさを与えるために、白色光、各干渉フィルタのためにプロットされている。 図3は、写真を示し、カルダンアームの図は、これらのために使用されます実験。 図4は、記録ステージとマイクロマニピュレーターを示す合成画像である。 図5は、実験のために蝶の製造におけるいくつかのステップを示しています。

記録が開始されると、光のフラッシュに応答して、電圧の負の変化は、電極は、 図6aのように、細胞の外にあることを意味します。応答の強さは、電極の距離によって異なります視細胞、および光フラッシュの入射角度に傾...

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ディスカッション

細胞内記録が原因関与する多くの技術的な手順に習得するのが困難な技術であることができます。成功した実験のために、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。まず、実験が行われた正常振動絶縁テーブルを有することが重要です。多くの研究者が完全に優れた振動絶縁を与え、ベースから卓上を分離する空気テーブルを使用します。私たちのセットアップは、マイクロマニピュレーター/電極ホルダ/試料ステージ装置を置かれる、上部のサンドボックスと厚い大理石のテーブルが含まれます。これは、社内のガスまたは圧縮空気へのアクセスが制限である場合は特に、空気テーブルに効果的な、より手頃な価格の代替手段です。追加の振動吸収対策は、このような受動的なエアサスペンション、またはテーブル脚（ 例えば 、開かれたテニスボール、自転車のチューブ、厚いゲルパッド）にクッション性元素の添加としてもよいです。また、実験は内側にあることが不可欠です正しく接地されたすべてとファラデーケージ。ファラデーケージは、ケージ内で作業するときは削除され、記録時に容易に交換することができます前面に金属メッシュスクリーンを持っている必要があります。周囲の電気的ノイズ（主AC電源から、特に5...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

私たちは励ましのために、私たちに機器を貸し出すためのカルダン腕周囲長、キンバリージャミソン、マシューマクヘンリー、およびラジュMetherateを製造するための後半ルディリンブルフに感謝し、Almutケルバーと健太郎有川。この作品は、ADBに国立科学財団（NSF）大学院研究KJMへのフェローシップとNSF助成金IOS-1257627によってサポートされていました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
蝶の蛹利用可能ないくつかの地元の種は、出荷のためにUSDAの許可が必要です。カロライナバイオサプライは、追加の許可を必要とせずに米国内で注文することができるいくつかの昆虫種を持っています
大きなプラスチックシリンダー加湿されたままの任意のチャンバーは動作します
昆虫ピン、サイズ2BioQuip1208B2
100%デザートメスキートハニートレーダージョーズ任意の蜂蜜やスクロース溶液はキ
セノンアークランプオリエルで動作しますインスツルメンツ66003オリエルはニューポート・コーポレーションの
ユニバーサル電源オリエル・インスツルメンツ68805オリエルはニューポート・コーポレーション
のオプティカル・トラックオリエル・インスツルメンツ11190オリエルはニューポート・コーポレーション
レイルキャリアの一部になりました (2x)オリエル・インスツルメンツ11641オリエルはニューポート・コーポレーション
の一部になりましたレイルキャリア、小型(4x)Oriel Instruments11647Orielは、Newport Corporation
Thread Adaptor、8-32オスから1/4-20オス、10個入りパックNewport CorporationTA-8Q20-10
Optical Mounting Post、1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in.Diameter Posts, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Fixed lens mount, 50.8 mmNewport CorporationLH-2
Fixed lens mount, 25.4 mmNewport CorporationLH-1
Condenser lens assemblyNewport Corporation60006
Convex silica lens, 50.8 mmNewport CorporationSPX055
6ポジションフィルターホイール、x2ニューポートコーポレーションFW1X6
フィルターホイールマウントハブニューポートコーポレーションFWM
凹型シリカレンズ、25.4 mmニューポートコーポレーションSPC034
メーターホルダーニューポートコーポレーション77612
メーティングビームプローブニューポートコーポレーション77644
フェルールコンバータ、SMA終端から11 mm標準フェルールNewport Corporation77670このアダプタにより、光ファイバをコリメータホルダーに適合させることができます 
600 μm径UV-visファイバーオブティックケーブルOriel Instruments78367Oriel は現在
ドライブユニットUniblitz100-2B
UV溶融シリカメタリックNDフィルター、0.1 ODポートFRQ-ND01
UVフューズドシリカメタリックNDフィルター、0.3 ODニューポートFRQ-ND03
UVフューズドシリカメタリックNDフィルター、0.5 ODを備えたシャッターの一部ですニューポートFRQ-ND05
UV溶融シリカメタリックNDフィルター、1.0 ODニューポートFRQ-ND10
UV溶融シリカメタリックNDフィルター、2.0 ODポートFRQ-ND30
UV溶融シリカメタリックNDフィルター、3.0ODニューポートFRQ-ND50
LS-1-CalランプオーシャンオプティクスLS-1-Cal
分光計オーシャンオプUSB-2000
SpectraSuiteソフトウェアOcean Optics
干渉バンドパスフィルタ、300 nm エドモンド・オプティクス67749
干渉バンドパスフィルター、310 nm エドモンド・オプティクス67752
干渉バンドパスフィルター、320 nm エドモンド・オプティクス67754
干渉バンドパスフィルター、330 nm エドモンド・オプティクス67756
干渉バンドパスフィルター、340 nm エドモンド・オプティクス65614
干渉バンドパスフィルター、350 nm エドモンド・オプティクス67757
干渉バンドパスフィルター、360 nm エドモンド・オプティクス67760
干渉バンドパスフィルター、370 nm エドモンド・オプティクス67761
干渉バンドパスフィルター、380 nm エドモンド・オプティクス67762
干渉バンドパスフィルター、390 nm エドモンド・オプティクス67763
干渉バンドパスフィルター、400 nm エドモンド・オプティクス65732
干渉バンドパスフィルター、410 nm エドモンド・オプティクス65619
干渉バンドパスフィルター、420 nm エドモンド・オプティクス65621
干渉バンドパスフィルター、430 nm エドモンド・オプティクス65622
干渉バンドパスフィルター、440 nm エドモンド・オプティクス67764
干渉バンドパスフィルター、450 nm エドモンド・オプティクス65625
干渉バンドパスフィルター、460 nm エドモンド・オプティクス67765
干渉バンドパスフィルター、470 nm エドモンド・オプティクス65629
干渉バンドパスフィルター、480 nm エドモンド・オプティクス65630
干渉バンドパスフィルター、492 nm エドモンド・オプティクス65633
干渉バンドパスフィルター、500 nm エドモンド・オプティクス65634
干渉バンドパスフィルター、510 nm エドモンド・オプティクス65637
干渉バンドパスフィルター、520 nm エドモンド・オプティクス65639
干渉バンドパスフィルター、532 nm エドモンド・オプティクス65640
干渉バンドパスフィルター、540 nm エドモンド・オプティクス65642
干渉バンドパスフィルター、550 nm エドモンド・オプティクス65644
干渉バンドパスフィルター、560 nm エドモンド・オプティクス67766
干渉バンドパスフィルター、570 nm エドモンド・オプティクス67767
干渉バンドパスフィルター、580 nm エドモンド・オプティクス65646
干渉バンドパスフィルター、589 nm エドモンド・オプティクス65647
干渉バンドパスフィルター、600 nm エドモンド・オプティクス65648
干渉バンドパスフィルター、610 nm エドモンド・オプティクス65649
干渉バンドパスフィルター、620 nm エドモンド・オプティクス65650
干渉バンドパスフィルター、632 nm エドモンド・オプティクス65651
干渉バンドパスフィルター、640 nm エドモンド・オプティクス65653
干渉バンドパスフィルター、650 nm エドモンド・オプティクス65655
干渉バンドパスフィルター、660 nm エドモンド・オプティクス67769
干渉バンドパスフィルター、671 nm エドモンド・オプティクス65657
干渉バンドパスフィルター、680 nm エドモンド・オプティクス67770
干渉バンドパスフィルター、690 nm エドモンド・オプティクス65659
干渉バンドパスフィルター、700 nm エドモンド・オプティクス67771
ファラデーケージ接地可能で実験的なセットアップに適した金属構造であれば、どんな構造でも機能します。
実体顕微鏡、6倍、12倍、25倍、50倍倍 倍ワイルド・ヘールブルッグワイルドM5任意の実体顕微鏡は、
スイングアームと重いベースを備えた顕微鏡スタンドマクベイン・インスツルメンツアーム付きの任意の重いベースは
、カルダンアームカスタムビルド、Figure 4
Fiber-lite高強度イルミネーターを参照してください Dolan-JennerMI-150照明試料用
ファイバーライトグースネックライトガイドDolan-JennerEEG 2823どんなグースネックライトガイドでも
大理石のテーブル
隆起した木製のテーブル穴は、砂場が下の大理石のテーブルに載るように、このテーブルを通して切られるべきです
砂カスタムメイド、砂
の入った任意の箱マニピュレーターカール・ツァイス - イエナ
電極ホルダー
試料ステージ
用ワニ口クリップワイヤー
絶縁銅線
銀線、直径0.125mmワールド精密機器AGW0510
BNCケーブル
ヘッドステージ付きプリアンプDagan CorporationIX2-700
Humbug ノイズリデューサーQuest ScientificHumbug
オシロスコープ、30 MHz、2 CH、デュアルトレース、Altトリガー、プローブなしEZ Digitalos-5030
BNC T-adapter
Powerlab ハードウェア 2/20ADI instrumentsML820
LabchartソフトウェアADI機器Chart 5
10 MHz パルス発生器BK Precision4030
ガラスピペットプーラーSutter InstrumentsP-87
フィラメント付きホウ珪酸ガラスキャピラリーWorld Precision Instruments1B120F-4
塩化カリウム、3 M
スロット付きプラスチックチューブ
低融点ワックス
はんだごてウェラー
ボールとソケットの磁気ベース付きハマの写真とビデオ
ダブルエッジ炭素鋼、壊れやすいカミソリの刃電子顕微鏡科学72004
ワセリン
マイクロソフトエクセルマイクロソフト
の一部になりました の一部になりました のコリコリ、ニューニューティクス率 を行います を行います で満たされた木箱 接地プラットフォーム、

参考文献

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