乳癌におけるエストロゲン受容体シグナル伝達によって代謝制御のシステムバイオロジー

サマリー

ゲノムワイドシーケンシング実験とメタボロミクス実験からのデータの統合は課題です。 この論文では、エストラジオールで治療された乳がん細胞からのトランスクリプトーム、シストローム、メタボロームのデータの生成、分析、および統合を初めて報告します。

要約

-omicsの出現により、がんやメタボリックシンドロームなどの慢性疾患の我々の理解が向上した近づきます。しかし、遺伝子発現マイクロアレイから得られる大規模なデータセット、深いシーケンシング実験または代謝プロファイリングにおける情報の効果的な採掘が明らかにした後、効果的に病気の細胞の表現型の重要な調節因子を標的とすることが不可欠です。エストロゲン受容体α（ERα）​​は、エストロゲン応答性乳癌のために重要である遺伝子プログラムを制御するマスター転写因子の一つです。乳がん代謝におけるERαシグナル伝達の役割を理解するために、我々はトランスクリプトーム、エストラジオールで処理されたMCF-7細胞からcistromicとメタボロームデータを利用しました。この報告では、RNAのSeq、ChIPの-のSeqとメタボロミクス実験と得られたデータの統合的なコンピュータ分析のためのサンプルの生成を説明しました。このアプローチは、新規モルの輪郭を描くのに有用ですcularメカニズムおよび正常または疾患細胞の影響代謝特定の転写因子によって調節されている遺伝子調節回路。

概要

エストロゲンは生殖組織、代謝組織、脳や骨^1を含む。女性と男性の両方における多くの生理学的プロセスの重要な調節因子です。これらの組織において有益な効果に加えて、エストロゲンはまた、乳房および生殖組織から生じる癌を駆動します。エストロゲンは主に細胞型特異的な効果を誘導することのERを介して動作します。 ChIP-のSeqを用いてRNA-のSeqとゲノムワイドERαDNA結合部位の解析を使用してERαによって調節転写産物のディープシーケンシングは、ERαがそれらから生じる異なる組織および癌においてどのように動作するかを理解するのに有用であることが判明しました。我々と他の人は、異なる受容体（ERβ対^{ERα）2,3、}異なるリガンド^3-5と異なるコレギュレーター^2,4,6,7に関連した遺伝子発現プロファイルを公開しています。

RNA-のSeqは、マイクロアレイBAと比較して、より高い精度と効率を提供し、トランスクリプトームを検討するための主要な方法であり、sedの遺伝子発現解析^8。細胞株^2-4,7、組織または腫瘍試料から得られたRNAは、利用可能なゲノムアセンブリにマッピングされ、配列決定され、示差的に調節する遺伝子が同定されます。クロマチン免疫沈降（チップ）は、公知の調節結合部位に結合する転写因子および補調節因子、クロマチンを分析するために使用されます。....

プロトコル

RNA-のSeqサンプルの調製

1. 細胞培養および治療
   1. 改良MEM（IMEM）+ 10％熱不活性FBS、加湿5％CO ₂雰囲気中で37℃で1％のペニシリン/ストレプトマイシンを有するフェノールレッド培地で培養MCF7細胞。
      注：同じ細胞株および細胞培養条件は、試験全体を通して使用されます。
   2. 6ウェルプレートにウェル100,000 MCF7細胞を播種。各治療のための三連を持っています。 3日目に、培地を除去し、または各ウェルに10 ^-8 M E2ずに2ミリリットルに新鮮な培地を追加します。加湿5％CO ₂雰囲気中、37℃で24時間プレートをインキュベート。
   3. 細胞を収穫各ウェルに1mLのRNA単離試薬（酸グアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム）を添加し、室温（RT）で5分間インキュベートします。その後、1.5ミリリットルチューブにピペッティングし、預金による細胞ライセート試薬を集めます
2. RNAの単離
   1. 200μlのchlorofoを追加10秒間、1ミリリットルの細胞ライセート試薬（1.1.3）と渦へのrm。 5分間、室温でインキュベートします。 4℃で15分間、16,000×gで遠心分離サンプル。遠心分離後、他の相を乱すことなく、新しいチューブに水相（上部）を転送。
   2. 転送-水相と新しいチューブに50....

結果

トランスクリプトミクス
E2処理によって示差的に発現する遺伝子を分析するために、我々は、RNAのSeq実験を行うことにしました。 mRNAレベルについての情報を提供することに加えて、RNA-、配列番号データは、非コードRNA（長い非コードRNA、マイクロRNA）、および選択的スプライシング事象の変化を監視するために使用することができます。我々の研究の範囲は、代謝調節のために重要な遺伝子をコードするタンパク質を同定することであるので、我々は、非コードRNAまたは代替的に転写された遺伝子の分析に関する情報を提供していませんでした。しかし、RNA-のSeqは、差動遺伝子発現イベントの情報を取得する優れた方法です。

高品質読み取り得るためには、高純度のRNAを得ることが重要です。 RNAを単離した後、我々は、RNAクリーンアップキットを用いてRNAを精製しました。残念ながら、RNAの約50％が、このプロセスの間に失われ、RNAの出発量は、cに入れな.......

ディスカッション

本稿では、生成およびE2で処理されたMCF-7細胞からのRNA-のSeq、ChIPの-のSeqとメタボロミクスデータの統合的な分析を説明しました。私たちは、生物学的に関連の発見を生み出す最も効率的な方法でユーザーフレンドリーなソフト用品を利用するために戦略的なプロトコルのセットを開発しました。我々の知る限り、我々は、3つの異なる分析から-omicsデータを統合し、ERα直接乳癌細胞において調節新しい代謝経路を同定するための最初の研究です。

トランスクリプトミクス
成功したトランスクリプトーム解析のための高品質のRNAで開始することが重要です。グッドプラクティスは、-80℃で保存し、使用中の氷上で維持し、多くの場合、手袋を変え、RNaseフリーベンチの作成など、RNA分解の可能性を排除します。 -20ºCで一晩のインキュベーションの添加は、RNA回収を向上させます。繰り返し凍結融解のRNAを回避するために、1は、下流procedurのためのRNAを割り当てることができます単離および精製の際にエス。シークエンシングエラーの存在を、サンプルからのcDNAを用いて定量RT-PCR.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリグリセリドミックス	Sigma	17810-1AMP-S
オレイン酸	Sigma	O1257-10MG	オレイン酸水溶性粉末
トリゾール試薬	ライフテクノロジーズ	15596-026
Dynabeads Protein A	Life テクノロジー	10006D
Dynabeads Protein G	Lifeテクノロジー	10007D
QIAquick PCR精製キット	QIAGEN	28106	インプットサンプルのDNA単離
ZYMO ChIP-DNA単離キット	ザイモリサーチ	D5205	ChIP DNAクリーン&濃縮器
Quant-iTªピコグリーン¨dsDNAアッセイキット	Invitrogen	P7589	DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set	QIAGEN	79254	RNA purification
DEPC 処理水	LIFE TECH	462224	Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator	フィッシャーサイエンティフィック	FB120110	1/8プローブ付き
フィッシャーサイエンティフィックサウンドエンクロージャ	フィッシャーサイエンティフィック	FB-432-A	消音用
エッペンドルフチューブ5.0ml	エッペンドルフ	0030 119.401	200本(100個入り2袋)
ランダムプライマーミックス	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV 逆転写酵素	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	ROCHE	4673484001
Agarose	Fisher	BP160100	1.5%アガロースゲル
Qubit RNA HS Assay Kit	Life テクノロジー	Q32852	RNA定量(100アッセイ)
ホルムアルデヒド	Sigma	F8775
プロテアーゼ阻害剤錠剤	ロシュ	4693116001	各錠剤は、10 ml の溶解バッファー
PhosSTOP ホスファターゼ阻害剤カクテル錠	ロシュ	4906845001	10 mL の溶解バッファー
Qubit Assay Kits		Q32850	For 100 assays
自動セルカウンター	ORFLO	MXZ000
tube Rotator	VWR	10136-084
ビクター X5 マルチプル プレート リーダー	PerkinElmer	2030-0050
微量遠心分離機 5417R	エッペンドルフ	22621807
磁気スタンド	Diagenode	B04000001
高速リアルタイムPCRシステム	応用科学

ー Life テクノロジーには、各錠剤で十分です4351405