レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

サマリー

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。

要約

両方のローカルおよびグローバルなスケールでレトロウイルスの展示署名統合好み。ここでは、（2）各ウィルスのゲノムの位置をマッピングする、ライゲーション媒介PCR（LM-PCR）増幅および次世代シークエンシング（NGS）を使用して、レトロウイルス組込み部位の多様なライブラリーの（1）の生成のための詳細なプロトコルを提供しますBEDToolsを用いて接合をホストし、そして（3）統計的関連性のためにデータを分析します。感染細胞から抽出したゲノムDNAを制限酵素で、または超音波処理による消化によって断片化されます。適切なDNA末端修復した後、二本鎖リンカーは、DNAの末端にライゲーションされ、半ネステッドPCRは、ウイルスの長い末端反復（LTR）の端部と連結させたリンカーDNAの両方に相補的なプライマーを用いて行われます。 PCRプライマーは、別々のアダプターライゲーションのための要件を否定、NGS中にDNAのクラスタリングに必要な配列を運びます。品質管理（QC）は、DNA断片のサイズ分布を評価し、適応させるために行われますNGSの前にDNAの取り込みを小胞体。シーケンス出力ファイルは、LTR-含む読み込みのためにフィルタリングされ、及びLTRおよびリンカーを定義するシーケンスが離れてトリミングされます。トリミングされた宿主細胞の配列は、BLATを用いて基準ゲノムにマッピングされ、参照ゲノムにおけるユニークな点に最小限97％の同一性のためにフィルタリングされます。ユニークな組み込み部位は、様々なゲノム機能に隣接するヌクレオチド（nt）の配列および分布の相対のために精査されています。このプロトコルを使用して、高い複雑性の組込み部位のライブラリーは、三日中のゲノムDNAから構築することができます。組込み部位の解析に影響を受けやすい組織培養細胞の外因性のウイルス感染を包含する全体の手順は、従って、約1〜2週間で行うことができます。この技術の最近のアプリケーションでは、HIV感染患者からの組込み部位の長手方向の分析に関連しています。

概要

宿主細胞ゲノムへのウイルスDNA（vDNA）の統合は、レトロウイルスのライフサイクルに不可欠なステップです。統合を安定挿入プロウイルス¹の確立につながる二つの異なる触媒プロセスを実行するウイルス酵素インテグラーゼ（IN）、によって達成されます。サブユニットにある多量^2-4によって一緒に保持端vDNAと高次intasomeを形成し、逆転写により生成された線形vDNAの端部に係合します。切断する3'-処理として知られているプロセスにおける配列の3 '下流不変5'-CA-3からvDNAの'末端は、3 '陥凹残す各vDNA末端^5-8で反 ​​応性ヒドロキシル基で終わります。 intasomeは、その後、ホストの大規模アセンブリおよびプレインテグレーション複合体^{（PIC）9-11}として知られているウイルスタンパク質の一部として核にインポートされます。細胞標的DNA（TDNA）が遭遇した後、INは3'-ヒドロキシルグロvDNAを使用しています同時に千鳥状にTDNAトップとボトム鎖を切断するアップとは、鎖転移^12,13の過程を経てTDNA 5 'リン酸基にvDNAを結合します。

ローカルおよびグローバルなスケールでレトロウイルス展示組込み部位の好み。局所的には、コンセンサス組込み部位は、上流と下流のvDNA挿入部位^14,15から約5〜10塩基対から及ぶ弱く保存されたパリンドロームTDNAの配列からなります。世界的に、レトロウイルスは特定のクロマチンの注釈^16をターゲット^にしています。イプシロン、レンチ、およびspumaを通じてアルファ - 7つの異なるレトロウイルス属があります。ガンマレトロが優先的に、転写開始部位（のTSS）とアクティブエンハンサー領域^18-20に統合しながら、HIV-1を含むレンチウイルスは、積極的に転写される遺伝子¹⁷の本体内での統合を好みます。著しく対照的に、スプーマを強くheterochromに偏っていますこのような遺伝子に乏しいラミナ関連ドメイン²¹とATICの地域、。地元のTDNAの基本設定は、INとTDNA ^13,22,23間の核の連絡先の特定のネットワークによって決定される大部分があります。レンチウイルス及びガンマレトロのために、ゲノムのアノテーションへの統合の相対は、INと同族の細胞因子^24-27間の相互作用によって支配大部分です。因子の相互作用^{25-27,29-32は、}それぞれ、ローカルおよびグローバルレベルでの統合を再ターゲットするための戦略を証明しているIN-ホストIN-TDNAの相互作用ネットワーク^13,22,23,28の仕様を変更し、破壊し、またはリエンジニアリング。

レトロウイルスの組み込み部位をカタログするために使用するDNA配列決定手順のパワーは、過去数十年にわたって非常に増加しています。組込み部位は、研究^33,34ごとにユニークなサイトのほんの一握りを得るために面倒な精製および手動クローニング技術を用いて、先駆的な仕事に回収しました。外因性の組織培養細胞の感染から回収サイトの数が数千¹⁷に数百に増加して、フィールドを形質転換したヒトおよびマウスのドラフトゲノムに個々の組込み部位をマッピングする機能を持つLTR-宿主DNA接合のLM-PCR増幅の組み合わせ^、18。 NGSの方法論とLM-PCRのより最近の組み合わせは、ライブラリの深さ急騰を送信しました。 DNAのクラスタリングを使用することにより、配列決定ライブラリがユニークな配列^19-21,39数百万を得ることができるしながら具体的には、パイロシーケンシングは、ユニークな組込み部位^30,35-38数万のオーダーで得られました。ここでは、DNAのクラスタリングNGSを使用して、レトロウイルス組込み部位を増幅し、配列決定するための最適化されたLM-PCRプロトコルを記述します。この方法は、それによってsequenする前に、追加のアダプターライゲーション工程の必要性を排除し、直接増幅されたDNA分子に、したがって、PCRプライマーに必要なアダプター配列を組み込み、^40を cing。 LTR-宿主DNA接合の生配列決定データの解析からのゲノムの機能を適切にする固有の組み込み部位のマッピングのバイオインフォマティクス解析パイプラインは、また、一般的に記載されています。この分野^36,38,41-43における従来の方法論のプロトコルから確立された優先順位に応じて、カスタムスクリプトは、バイオインフォマティクスパイプライン内の特定のステップの完了を支援するために開発することができます。プロトコルの有用性および感度は、増幅することにより、代表的なデータで示さシーケンシング、および1.0の感染のおおよその多重度（MOI）、並びに、このDNAの滴定シリーズで感染組織培養細胞からのHIV-1組込み部位をマッピングしています6.4×10 ^-5のおおよそ同等のMOIを得15625：1の最大希釈の5倍ステップで非感染細胞DNAを介して希釈しました。

プロトコル

1.ウイルスストックを生成します

注意：このプロトコルのウェットベンチ態様のフローチャートを図1に示されたウイルスストックの産生および組織培養細胞のその後の感染の詳細は、一般的にレトロウイルスの異なるタイプに適用されます。いくつかの実験のために、標的細胞は、内因性ウイルス受容体（複数可）を発現しないことがあり、そのような場合、異種ウイルスエンベロープ糖タンパク質を保有する偽型レトロウイルス粒子の構造は、 例えば、水疱性口内炎ウイルス（VSV-G）からのG糖タンパク質、あろう感染^44,45のために必要。

注：HIV-1で作業するときの注意事項が取られるべきです。具体的なガイドラインは、機関から機関に異なりますが、すべてのウイルスベースの作業は（典型的には、組織培養フードと呼ばれる）専用の、オペレータ制限生物学的安全キャビネット内で行われるべきです。適切な個人用保護具それは顔の保護、靴カバー、二重の手袋層、およびフルボディカバーオールスーツを常に着用するが含まれています。ウイルス関連の実験から得られたすべての廃液は漂白剤（10％最終濃度）で不活性化されるべきであり、固形物を含む全ての廃棄物は、廃棄前にオートクレーブ処理する必要があります。

1. トランスフェクションの1日前に、10％（v / v）のウシ胎児血清および1％を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10ml中のプレート3.3×10 ⁶ HEK293T細胞（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシン（10,000 U / mlストック）5 100mm皿の各インチ
   注：補完機能-DMEMを上この点からDMEM-FPSと呼ばれています。
2. その後の日には、市販のトランスフェクション試薬またはリン酸カルシウムを使用して、VSV-G発現構築物を1μgとエンベロープ削除シングルラウンドベクトルの10の完全長のレトロウイルス分子クローンを有するプラスミドμgのまたは9μgので細胞をトランスフェクトします。
   1. Cをインキュベート5％CO ₂の加湿細胞培養インキュベーター中で37℃でells（この状態以降は「組織培養インキュベーター」と呼びます）。後約48時間、メスピペットを用いて、ウイルス含有細胞培地を収穫し、重力流によって0.45μmのフィルターを通してそれを渡します。
   2. 4℃で1時間、200,000×gで超遠心によりウイルスを濃縮します。 20 UのDNaseを含む500μlのDMEM-FPSにおけるウイルスペレットを再懸濁し、37℃で1時間インキュベートします。
      注：DNアーゼステップは、トランスフェクション手順から解決したプラスミドDNAの矛先を排除することによって、望ましくないプラスミド配列の回収を低減するのに役立ちます。
3. 製造元の指示に従って、HIV-1 p24抗原捕獲キットを使用してのp24濃度^46を決定^します 。
   注：ウイルス濃度は、逆転写酵素活性アッセイ^47,48によって決定することができます。また、機能性ウイルスのレベルができますMOIを測定することによって決定されます。これは、最も容易にそのような高感度緑色蛍光タンパク質などの蛍光レポーター遺伝子を発現するウイルスを蛍光活性化セルソーティングを使用して行われます。最適化された細胞株として感染の同じレベルをサポートしていない可能性が初代細胞での作業時MOIの決意は、特に有用であり得ます。

ウイルス2.感染細胞

1. プレート3.0×10 2.5ミリリットルDMEM-FPSで6ウェルプレート中のウェルあたり⁵ HEK293T細胞および組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。
   注意：このプロトコルで回収固有の組み込み部位の数は、細胞および感染症に使用される活性ウイルスの量の数に正比例します。
2. 組織培養インキュベーター中で2時間、500μlの新鮮なDMEM-FPSの最終容量で500 ng / mlでの最終的なウイルスのp24濃度の細胞に感染し、2 mlのDMEM-FPSは、ウェル当たり37℃に予熱追加インキュベーションを継続します。
3. に感染後48時間で、培地を除去し、2mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。 0.5ミリリットルトリプシン-EDTA 37℃に予熱したを追加し、数秒後に視覚的に細胞脱落のための井戸を検査します。
4. 2ミリリットルを予め温めておいたDMEM-FPSを追加し、〜メスピペットでアップ/ダウン穏やかなピペッティングにより10回の細胞を再懸濁します。 DMEM-FPS予め温めた18 mlを含む75cm ²の組織培養フラスコに溶液を移し、組織培養インキュベーター中で細胞をインキュベートします。
5. 感染の開始から最低限5日後、5 mlのPBSで洗浄し、培地を除去することによって細胞を採取2ミリリットル予め温めておいたトリプシン-EDTAを追加し、ピペッティングにより5ミリリットル予め温めておいたDMEM-FPSで再懸濁します。 2500×gで室温で5分間この溶液を遠心分離し、上清を捨てます。
   注：約48時間の感染後^49,50でこれらの条件のプラトーの下で統合は、文化の追加の3日間はsufficientlするために必要とされているが、yは、細胞ベースのDNAの組換えまたはウイルス媒介autointegrationから生じる統合されていないDNA分子の濃度を希釈します。
6. 市販のキット（ 例えば ^、51を参照）を用いて細胞ペレットからゲノムDNAを抽出します。 10 mMトリス - 塩酸、pH8.5の200μlで供給されたイオン交換カラムからDNAを溶出します。
   注：細胞のアリコートを前NGSへの適切なウイルス感染を確実にする感染性アッセイのために48時間の感染後（ステップ2.3）に配分されるべきです。

3.断片ゲノムDNAを超音波処理によって、または制限酵素消化により

注：超音波処理は、事実上の配列に依存しない方法でゲノムDNAを断片化し、（比較的低いMOIで開始例えば 、感染した患者の細胞または感染症）、低期待される回収率を有する試料の配列を決定する際にこのように断片化の好ましい態様です。さらに、超音波処理は1つがパルティのPCR重複を区別することができます感染患者におけるプロウイルス含有細胞のクローン増殖を区別することが重要です同じ部位でユニークな統合からcular統合部位配列（以下のステップ11を参照^{）39,52-54。}
注：DNAは、LM-PCRの間に内部のウイルス配列の増幅を減少させるために、上流LTRからすぐ下流の切断されるべきです。上流U5配列から43塩基対下流に位置しており、それはのMseIで生成されたDNAと、その後の連結のための互換性がありません制限酵素BglIIでは、多くのHIV-1株（ 図1B）とよく作品を終了します。超音波処理によりDNAを調製する場合、内部の切断制限酵素は、（ - Eとステップ以下4.3 図1Cを参照）リンカーライゲーションの後に適用されるべきです。

1. 超音波処理のために、120μlの最終体積にヌクレアーゼフリー水でゲノムDNAの10μgのを混ぜます。 （500塩基対の平均破断サイズのパラメータを使用して、以下のパラの2ラウンドを超音波処理メートル：デューティ・サイクル：5％;強度：3。バーストあたりのサイクル：200;時間：80秒）。
2. PCR精製キットを用いて、超音波処理したDNAを精製します。 DNAは、DNA末端修復キットを使用して末端修復し、PCR精製キットを用いてDNAを精製します。テールクレノウエキソを用いてDNA ^-酵素及びPCR精製キットを用いて、A尾DNAを精製します。キットの使用方法の詳細については^51,52を参照してください。
3. 制限エンドヌクレアーゼ消化のために、と同様に、製造業者および5'-TAオーバーハングを生成する（各100 U）の酵素カクテルにより供給される緩衝液を用いて100μlの容量で、37℃で一晩ゲノムDNAの10μgのをカットなどのBglIIなど、互換性のない酵素上流ウイルスLTRの下流に切断します。 PCR精製キットを使用して、翌日DNAを精製します。
   注：制限酵素のいずれも端末内LM-PCRプロトコルで増幅されたウイルスDNAの末端の約30塩基対を切断するべきではありません。このプロトコルは、具体的にはU5を増幅しますHIV-1 DNAの末端。

4.アニールリンカーオリゴヌクレオチドおよび断片化ゲノムDNAに連結

注：上記のDNA断片（このプロトコルで利用されるオリゴヌクレオチドの配列については表1を参照）と互換性のあるオーバーハングを含む非対称のリンカーを準備します。 MseI消化DNAのためのリンカーが互換性の5'-TAオーバーハング（ 図1）が含まれている必要がありながら、超音波処理DNAで使用されるリンカーは、互換性のT-3 'オーバーハングを含んでいなければなりません。短いリンカー鎖は、さらに、目的のDNAに向けて、その後の増幅反応を制約するために、このような3'-アミンとして、非伸長化学修飾を含んでいなければなりません。
注：同じ塩基配列決定ランで並列および/または多重化のユニークなサンプル中の複数の異なる組み込み部位のライブラリーを調製する場合、サンプルのクロスcontaminの可能性を制限するために、各サンプルのためのユニークなリンカーを使用することをお勧めしますPCR中エーショ​​ン。これはさらに、半ネステッドPCR（後述）の際に、各サンプルのためのユニークなリンカープライマーの使用を意味します。ユニークなリンカー鎖とリンカープライマーは、同様の全体の％のGC含量および適用突出位置を維持しながら、表1に列挙されたリンカーオリゴヌクレオチド配列をスクランブルすることによって設計することができます。

1. 90℃に加熱することにより10mMトリス - 塩酸、pHが8.0から0.1 mMのEDTA（各オリゴヌクレオチドの10μMの最終濃度）35μlの中で短いと長いリンカー鎖をアニーリングし、ゆっくりと1度のステップで室温まで冷却しました毎分C。
2. 50μlのリンカー、1μgの断片化DNA、及び800 UのT4 DNAリガーゼを連結した1.5​​μMが含まれているゲノムDNA試料当たり少なくとも4つの並列連結反応を、準備します。 12℃で一晩ライゲーション。 PCR精製キットで翌日精製します。
3. 超音波処理によって調製された試料については、restricの100 Uを有する精製ライゲーション反応をダイジェスト化酵素一晩メーカー推奨の条件の下で、上流LTR（HIV-1のための例えば 、のBglII）から下流に切断すること。 PCR精製キットを用いてDNAを精製します。

半ネステッドPCR 5.アンプリファイウイルスLTR-ホストゲノムDNAジャンクショ​​ン

注：回収されたライゲーション反応のDNA濃度に応じて、最適なライブラリーの多様性のために少なくとも4-8並列のPCRを確保するためには、両方のPCRラウンドのために、各サンプルのために準備されるべきです。 DNA鋳型濃度は、分光光度法により定量化されるべきです。このプロトコルでPCRの第一および第二ラウンドは、ネストされたLTRに特異的なプライマーを使用する、同じリンカー特異的プライマーは、両方のラウンド（ 表1）のために使用されます。第二ラウンドLTR特異的プライマーとDNAのクラスタリングのためのリンカー特異的プライマーエンコードアダプター配列ならびに配列決定プライマー結合部位。ネストされたLTR特異的プライマーはまた、WH、6塩基インデックス配列をコードしますICHは同じシークエンスラン内の多重化ライブラリの異なるプライマーの間で変化させることができます。

1. 表2に示すようにチューブあたりの成分を含有する第一ラウンドのPCRを準備します。
   注：リンカー特異的プライマーは、リンカーの末端3 'から15~16塩基対上流に位置する端部」53°C、45％のGC含量、およびその3の溶融温度に相補性の22塩基を保有異なるリンカー長いストランド（ 表1）。最初のラウンドの27塩基LTRプライマーは、59°C、48％のGC含量の融解温度を有し、その3 '末端は、HIV-1 U5末端から34塩基対上流に位置します。 HIV-1 LTRに相補的な第二ラウンドの26塩基LTRプライマーの領域は、60°C、50％のGC含量、およびその3 '末端の融解温度を有するウイルスU5から18塩基対上流に位置します末端。ユーザーがあれば、オリゴヌクレオチドの融解温度及びGC-コンテンツは、これらのパラメータを模倣することをお勧めします（他のレトロウイルスで使用するために含む）改変された配列を有する設計PCRプライマー^21。
2. 以下のサーモサイクラーパラメータの下で最初のPCRラウンドを実行します。1サイクル：2分間94°C; 30サイクル：15秒94℃、30秒、45秒、68℃55℃。 1サイクル：10分間68℃。
3. 反応をプールし、PCR精製キットを用いて精製します。 。 表3に従って、チューブあたりの成分を含有する第二ラウンドのPCRを準備するステップ5.2で説明したサーモサイクラーパラメータを用いたPCRの第二ラウンドを実行します。反応をプールし、製造者の指示に従って商業PCR精製キットを用いてDNAを精製します。
   注：DNAクラスタリングNGSと互換性のある推奨インデックスの種々の配列が⁷¹用意されています。

6.実行QC及びNGS（典型的には、シーケンシング機能によって完成）

1. （QCアッセイ＃1）フルオロを使用して、手順5.3ライブラリーのDNA濃度を確認しますメートル^55。簡単に言えば、200μlのヌクレアーゼフリー水の最終容量で規格と実験サンプルを準備します。 2-3秒間ボルテックスチューブは、2分間室温でインキュベートし、その後、蛍光光度計でサンプルをお読みください。
   注：サンプルは、15μlの最小容量の2 nMのライブラリーDNAの最小濃度を含むべきです。
2. （QCアッセイ＃2）は、テープベースのアッセイ^56を使用して^、DNA断片サイズ分布を確認します。
   注：理想的な分布は、長さが500塩基対を中心に比較的広いDNAのピークです。材料のかなりの量が1 KBよりも大きい場合、クラスタリング中ブリッジ増幅を妨げるであろう、より長いDNA種を除去するためにサイズ選択手順を組み込むことが推奨されます。重要なピークが100〜200 bpの周りには明らかである場合にはこれとは対照的に、プライマーダイマーは、PCRの間に形成された可能性があります。この場合、手順は、プライマーダイマーの形成を最小限にするために最適化されるべきです。
3. （QC検定＃3）共同定量PCR ⁵⁷によってDNAライブラリーへのアダプターの適切な組み込みをnfirm。
4. メーカーのアプリケーションの文学以下のNGSを実行します。 10％のスパイクでの活用（w / w）のシークエンスランにバランスのとれたベース組成物を提供することにより、リアルタイムの品質指標を最適化するΦX174DNA、。
   注：統合サイトシークエンシング実験は、通常、シングルエンドの150bp（SE150）またはペアエンドの150bp（PE150）配列決定に供されています。 PE150は、各DNA分子（ 例えば 、宿主細胞クローン増殖の証拠のための組み込み部位を精査するとき）に、リンカーの結合点をキャプチャするために特に有用です。

7. LTR-含む配列、作物離れLTRとリンカー配列についての配列決定データを解析するためにカスタマイズされたのPythonやPerlスクリプトを使用し、BLATでリファレンスゲノムにマップ

1. LTR含有配列のスキャンFASTAファイルが離れホストゲノムDNA配列から、作物のLTRおよびリンカー配列を読み取り、新しいFASTAファイルにこれらの配列をエクスポートします。マップは、出力統合サイトは、以下の設定を使用して、個別の.txtファイルにエクスポート座標との両方の参照ゲノム（ 例えば 、ヒトゲノムのバージョンhg19またはGRCh38）に読み込んで、BLAT ^58を使用して、ウイルスゲノムクロップ：
   ステップ幅= 6、minIdentity = 97、およびmaxIntron = 0
2. autointegrationsを削除.txtファイル、BLAT出力（LTR端はウイルスDNAゲノムの内部領域に統合したこと、すなわち証拠）を解析し、他の配列マッピングHIV-1ゲノムに、そしてここで別の出力.txtファイルを作成しますすべての重複組み込み部位は、単一の、ユニークな座標ヒットに凝縮されています。

8. FASTAファイルにこれらを変換し、統合をめぐる15-NTの間隔を含む.bedファイルを作成し、ベースの環境が統合サイトを取り巻く表示するシーケンスのロゴを作成

1. 拠点の間隔をリスト.bedファイルを作成します。各組込み部位。少なくとも15塩基（5上流と下流の10）は、配列ロゴの生成のために提案されています。 BEDTools ⁵⁹からfastaFromBed機能し、このコマンドを使用して、これらの.bedファイルからFASTAファイルを生成します。
   fastaFromBed -fi /ディレクトリ/に/参照/ゲノム/ -name -s - ベッド15_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
   注：不変ウイルス5'-CA-3 'ジヌクレオチドは、統合時にDNAをホストするために入社し、細胞DNAへのLTR末端の接合性を検証することは善意の統合部位を同定するための重要な初期フィルタです。我々はさらに、実験結果を検証するために、このホストDNA配列集団からシーケンスのロゴをコンパイルします。レトロウイルスは、それらの組込み部位^14,15の周囲^のシグニチャベースのプリファレンスを表示するように、シーケンスのロゴは、マッピングされたゲノムのサイトは、このような非相同DNAなどの他の組換え機構と比較して、IN-媒介統合によって生じたことを検証するのに役立ちます最後は^60,61を接合^します 。
2. 使用WebLogo 3は（http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi）FASTAファイルからシーケンスのロゴを作成します。 FASTAファイルをアップロードするには「ファイルを選択」し、次の設定を使用]をクリックします：出力形式、PDF（ベクトル）。ロゴのサイズ、大;最初の位置番号、-5;ロゴ範囲、-5〜5。 Y軸スケール、0.1、Y軸の目盛間隔、0.5、配色、古典（NA）。

9.サンプルのクロスコンタミネーションをチェックし、中央塩基対は、ファイルの.bed作成し、関連のあるゲノム機能への相対的なユニークな統合サイトの分布地図

1. レトロウイルスの統合はTDNAストランド全体に千鳥状に発生するので、ゲノム機能へのゲノム分布の相対的な正確なマッピングのための標的部位の重複の中央塩基対を反映するために、組み込み部位の正確な座標を調整します。
   1. したがって、HIV-1のようなウイルスを複製する5 bpのために、私からのオフセット中央塩基対と.bedファイルを作成しますプラス鎖に統合マッピングのための下流の2塩基、およびマイナス鎖に統合マッピングのための上流の2つの塩基によってntegrationサイト​​。
2. 中央の塩基対は、2つの異なるサンプルのためと、このコマンドを次でファイルを.bed交差するBEDTools機能を交差使用して、別のライブラリ間で共通の組込み部位の数を計算し、サンプルのクロスコンタミネーションを確認するには：
   bedtools交差-a central_basepair_1.bed -b central_basepair_2.bed -f 1.00 -r -s> overlap1v2.txt
3. 次のコマンドを使用して、2つのライブラリーの間で一般的な部位の正確な数を定量化するために、出力overlap1v2.txtファイル内の行数を数えます：
   トイレ-l overlap1v2.txt
4. UCSCゲノムアノテーションデータベースからの組込み部位のマッピングに使用された参照ゲノムのバージョンのためのRefSeqの注釈.bedファイル（ 例えば http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/daをダウンロード^{tabase）62。}
   1. RefSeqは、このコマンドの次のファイルを.bedとサンプル用に生成された中央の塩基対.bedファイルを交差するようにBEDTools機能を交差使用してのRefSeq遺伝子内に入る組込み部位の数を計算します。
      bedtools交差-a central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38.bed -u> RefSeq_sample1.bed
5. 次のコマンドを使用してのRefSeq遺伝子に落下サイトの正確な数を定量化するために、出力RefSeq_sample1.bedファイル内の行数を数えます：
   トイレ-l RefSeq_sample1.bed
6. 繰り返し間隔.bedファイルが提供されている関心のある他の注釈に9.3とマッピング組込み部位のための9.4を繰り返します。ステップ9.4の指示に従ってUCSCゲノムアノテーションデータベースからの関心の参照ゲノムの最新のCpGアイランドアノテーション.bedファイルをダウンロードします。
   1. 特定のディ内に入る組込み部位の数を計算しますBEDTools 窓関数を使用して、このコマンドに従って、CpGアイランドのスタンス（この例で説明されている5キロバイトウィンドウです）：
      bedtoolsウィンドウ-w 2500 central_basepair_1.bed -b CpG_hg38.bed -u> CpG_sample1.bed
7. 次のコマンドを使用して、上流または下流のCpGアイランドの2.5キロバイトの範囲内にあるサイトの正確な数を定量化するために、出力CpG_sample1.bedファイル内の行数を数えます：
   トイレ-l CpG_sample1.bed
8. 繰り返しは、マッピング組み込み部位近くのTSS 9.6と9.7を繰り返します。ゲノムは、二つ以上の遺伝子にマッピング座標RefSeq.bedファイルの別のバージョンを生成し、その位置に存在する唯一の単一の遺伝子を反映するために調整されています。これは、組み込み部位の周囲の遺伝子密度の過大評価を防ぐことができます。 BEDTools 窓関数を使用して、このコマンドに従って、各組込み部位の周囲の1 Mbの領域に遺伝子密度を計算します。
   bedtoolsウィンドウ-w 500000 central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38_NonRedundant.bed -u> GeneDensity_sample1.bed
9. このコマンドに従うことによって、データセット内のすべての統合のための平均遺伝子密度を計算します。
   awkの（合計+ = $ 7）END（プリント "平均="、和/ NR）」GeneDensity_sample1.bed

10.統計的にRに両側フィッシャーの正確確率検定と両側ウィルコクソン順位和検定を使用したサンプルのうち、統合サイト分布を比較

RefSeq遺伝子内またはCpGアイランドまたはのTSSのウィンドウ内に組み込み部位の割合を比較するための使用フィッシャーの正確確率検定を、しかし、組込み部位の周囲の遺伝子密度に分布を比較するためのWilcoxonの順位和検定を使用します。注意して​​ください。 Rプログラムはhttp://www.r-project.org/で入手可能です。
フィッシャーの正確確率検定、両側検定：

1. ステップ9.4および9.7の指示に従って計算された数字を使用して、CR観察出現このコマンドに従うことによってサイトを残りの対（注釈内や注釈を囲むウィンドウ内の統合）のRの各比較のために行列をeate：
   （annotation_of_interest < - マトリックス（C（SampleA＃で、SampleA＃が残り、SampleB＃は残りSampleB＃で）、nrow = 2、dimnames =リスト（ハ（ 'センター'、 '剰余'）、C（ 'SampleA」、 「SampleB '））））
2. 次のコマンドを使用して、フィッシャーの正確検定、両側検定による比較のためのP値を計算します。
   fisher.test（annotation_of_interest、代替= 'two.sided'）$のp.value
   ウィルコクソンの順位和検定、両側検定：
3. 各列は一番上のセルにサンプル名が含まれているタブ区切りの.txtファイルを作成し、（ステップ9.9で生成された.bedファイルから取得）、そのライブラリ内のすべての組み込み部位のための遺伝子密度の値によって以下に続きます。次のコマンドを使用してRにこのタブ区切りの.txtファイルをインポートし、ナ正しいファイルディレクトリにvigating：
   FILENAME < - as.data.frame（read.delim（file.choose（）、ヘッダ= T、check.names = FALSE、= TRUE、9月= 'トン'）を記入）
4. 次のコマンドを使用して、両側ウィルコクソンの順位和検定による比較のためのP値を計算します。
   wilcox.test（FILENAME $ペアリングSampleA、FILENAME $ SampleB、代替= 'two.sided'、= F、正確な= T）$のp.value
   注：P値は、プログラムによって返されるゼロた後、Rのみで特定の（非常に低い）限界まで計算することができます。 RでP = 0をもたらす大規模異なるサンプルについては、2.2×10 ^-308 <としてP値を推定します。

11.統合されたウイルスDNAを含む細胞のクローン増殖の証拠のために生のシーケンシングデータを調べ

注：小さな電位が参照ゲノムの正確な同じNTつ以上の統合の必要性が存在します。あるいは、単一でtegrationイベントが原因で、ライブラリ調製中および/またはDNA調製に先立って、細胞複製によるPCRの使用に配列決定データで重複存在になることがあります。 HIV感染患者からのゲノムDNAの最近の分析は、同一の組み込み部位^52-54を含むDNA配列内に（のみPCRの前に発生する可能性がある）のユニークな超音波処理せん断ポイント/リンカの接続点を識別することによって、これらの可能性を区別しています。クローン増殖、細胞内に宿されたプロウイルスは、ウイルス潜伏リザーバに寄与し、ひいてはそれがヒト患者における組み込み部位を研究する際の膨張のレベルを特徴づけるために特に重要であるかどうかの議論は現在あり。

1. ステップ8.1に記載された手順と同様に、この場合には、拡張する拠点の間隔をリスト.bedファイルを生成し、25ヌクレオチド下流それぞれのユニークな組込み部位から（上流の塩基が、ここで不要です）。の手順に従って、（これらの.bedファイルからFASTAファイルを生成BEDToolsからfastaFromBed機能を使用して、このコマンドを次のようバイステップ8.1）：
   fastaFromBed -fi /ディレクトリ/に/参照/ゲノム/ -name -s - ベッド25_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
   注：検索各の特異性を改善するために、分析クローン拡大のために、各組込み部位からヌクレオチド下流少なくとも25を抽出することをお勧めします。
2. 好ましくは、カスタマイズされたスクリプトを使用して、それぞれのユニークな組込み部位の下流に25ヌクレオチドに完全一致を含むすべての文字列の生のシーケンスデータFASTAファイルを検索し、新しいファイルにこれらの配列を堆積させます。生の文字列からLTRおよびリンカー配列をトリム。 PEのシーケンスをマージすると、LTRおよびリンカー配列をトリミング、逆相補に読み込み、文字列はntの重複少なくとも20を共有している場合、次にそのREAD1ペアにREAD2文字列を割り当てる変換して読み込みます。
3. 各組込み部位のブロックのリンカアタッチメントポイントをスキャンします。クローン増殖＆ "として各積分の分類＃34;リンカーの付着点である場合≥3離れ沸点。
   注：シーケンスを読み取りマージせずにクローン増殖分析のためのプロトコルは^、52に記載されています。
   注：超音波処理することにより、正確に同じ位置でのゲノムの断片化は、クローン増殖の程度の過小評価につながり、結果として得られる実験的なバイアスを修正するための方法は^、63,64に記載されています。

結果

表4に、代表的な実験の結果は、感染細胞の培養物からの組込み部位を回収するためのNGSの感度を例証します。非感染細胞DNAが直列平均して各セル一積分^40を含有する感染からのゲノムDNAを希釈するために利用されました。 15,625：希釈は1の最大希釈の5のステップで調製しました。滴定シリーズのゲノムDNAは、その後、超音波処理によって断片化または制限で消化することにより、LM-PCRに続いてのMseIおよびBglIIを、エンドヌクレアーゼました。固有の組み込み部位の数、ならびに選択されたゲノム注釈の近位にマッピングするサイトの数は、上記のプロトコルに従って計算しました。データ分析は、理論的には唯一の15625には、感染した細胞から調製したライブラリーから回収されたユニークな組込み部位の数十（ニートゲノムDNAから回収量の1〜2％）を明らかにしました。

統合サイトのデータセットを分析するとき、マッチしたランダム制御またはMRCと呼ばれるランダムなゲノム部位の一致したセットにデータを比較することが重要です。代表的...

ディスカッション

ゲノムの分布パターンのマ​​ッピングを介して、最初のウイルス感染の段階からのレトロウイルス組込み部位の分析のためのプロトコルは、記載されています。このプロトコルは、任意のレトロウイルスと任意の感染可能細胞型にも適用可能です。さらに、アッセイパイプラインは、6.4×10 ^-5のMOIで開始感染のそれにゲノムDNAと同等の連続希釈液からのユニークな組込み部位の十分な数を回復する可能性のある、非常に敏感です。細胞の小部分のみが組み込まれたプロウイルスを保有します低ウイルス量を含有することができる感染患者からのサンプルに適用すると、この感度は、プロトコルは特に有用となります。この分野^36,38,41-43における従来の方法論の論文と一致して、このプロトコルのバイオインフォマティクス部における複数のステップは、配列データの大きなファイルを処理するためにカスタマイズされたスクリプトの開発から利益を得るであろう。 BLAT ⁵⁸ミリアンペアですがこのプロトコルで説明するユーティリティをpping、ユーザーが適切な代替であるとボウタイ^{67（http://bowtie-bio.s...}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	Gibco	11965-084	標準的な細胞培養培地、HEK293T細胞と互換性
ウシ胎児血清	Thermo Scientific	SH 30088.03	最適なウイルス産生のためには、異なるロットの血清を事前にスクリーニングする必要があるかもしれません
ペニシリン/ストレプトマイシン	コーニング	30-002-Cl	DMEM
リン酸緩衝生理食塩水	Mediatech	21-040-CV	細胞の洗浄に使用
トリプシンEDTA	コーニング	25-053-CI	組織培養プレートから付着細胞を剥離するために使用
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	DNA トランスフェクション試薬
0.45 & マイクロ;m フィルター	Thermo Scientific	09-740-35B	ウイルス粒子含有細胞培養培地のろ過に使用
Turbo DNase	Ambion	AM2239	ウイルスストックからのキャリーオーバープラスミドDNAの分解に使用
HIV-1 p24 抗原捕捉アッセイ	ABL Inc.	5447	ウイルス産生の収量を定量化するために使用されます
DNeasy Blood &ティッシュキット	Qiagen	69506	細胞からゲノムDNAを精製するために使用される
Sonicator	Covaris	S2	このモデルのソニケーターでは、デューティサイクルの2ラウンド、5%、強度、3、バーストあたりのサイクル数、200、時間、80秒
ヌクレアーゼフリー水	GeneMate	G-3250-125	市販の水は、サンプルのクロスコンタミネーションの可能性を減らすために推奨
QIAQuick PCR 精製キット	Qiagen	28106	ライブラリ建設中にDNAを精製するために使用される
End-It DNAエンドリペアキット	エピセンター	ER81050	超音波処理されたDNAサンプルのDNA末端を修復するために使用されます
Klenowフラグメント(3'-5'エキソ–)	ニューイングランドバイオラボ(NEB)	M0212S	dATPからAテール修復DNAフラグメントdATPに使用
	Thermo Scientific	R0141	デオキシアデノシン三リン酸
MseI	NEB	R0525L	ゲノムDNA切断のための制限エンドヌクレアーゼ
BglII	NEB	R0144L	上流のHIV-1 U5配列T4 DNAリガーゼの増幅を抑制するための制限エンドヌクレアーゼ
	NEB	M0202L/6218	適合DNA末端の共有結合用酵素
DNAオリゴヌクレオチド	統合DNAテクノロジー	カスタム	にオリゴの精製を行っていただきます。HPLC精製はDNAに十分です<30ヌクレオチド;PAGEは、より長いDNAを精製します
アドバンテージ 2 ポリメラーゼミックス	Clontech	639202	)用DNAポリメラーゼを含む市販のミックス
	Thermo Scientific	R0181	氷上の4つの化学物質を滅菌水で希釈し、各dNTP
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	DNA濃度
の測定用分光光度計Qubit Fluorimeter	Life Technologies	Qubit® 3.0	統合部位ライブラリのDNA濃度を確認するための蛍光光度計
2200 TapeStation System	Agilent	G2964AA	統合部位ライブラリのDNAサイズ分布を確認するためのテープベースのアッセイ
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	NGSに使用