ここでは、Eに（P）ドメインを突出高品質のノロウイルスを発現し、精製するための方法を記載しますX線結晶学研究における使用のための大腸菌 。この方法は、他のカリシウイルスPドメイン、ならびに非構造タンパク質に適用することができる、すなわち 、ウイルスタンパク質ゲノム結合（のVPg）、プロテアーゼ、及びRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）。
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この記事について
サマリー
要約
ノロウイルスキャプシドは、単一の主要構造タンパク質で構成され、VP1と呼ばれます。 VP1は、シェル（S）ドメインと突起（P）ドメインに細分されます。 Sドメインは、PドメインのフォームSドメイン上のウイルスのスパイクのに対し、ウイルスRNAの周りに連続した足場を形成し、抗原性および宿主細胞の相互作用のための決定が含まれています。 Pドメインは、炭水化物構造、 すなわち特異的に結合する。ノロウイルス感染症のために重要であると考えられている、ヒスト血液型抗原、。このプロトコルでは、我々は、高収率で高品質のノロウイルスPドメインの製造方法を説明します。これらのタンパク質は、次いで抗原と宿主細胞の相互作用を研究するために、X線結晶構造解析およびELISAのために使用することができます。
Pドメインは、まず、発現ベクターにクローニングした後、細菌中で発現されます。タンパク質は、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを固定化することを含む3つのステップを使用して精製されます。に原理は、特急、クローン精製し、そしてこのプロトコル新興ノロウイルス株を分析するための迅速なシステムになり4週間未満、中のタンパク質を結晶化することが可能です。
概要
人間のノロウイルスは、急性胃腸炎、世界中の1の主な原因です。これらのウイルスはノロウイルス 、 サポウイルス 、Lagovirus、 ベシウイルス 、およびNebovirusを含む少なくとも5属が存在するうち、 カリシウイルス科ファミリーに属します。医療システムと広く分布に対するそれらの高い衝撃にもかかわらず、人間のノロウイルスの研究は、強固な細胞培養系の欠如によって妨げられています。現在までに、利用可能な認可されたワクチンまたは抗ウイルス戦略はありません。
ノロウイルスの主要キャプシドタンパク質、VP1と呼ばれるシェル（S）ドメインと突起（P）領域2に分割することができます。 Pドメインは、柔軟なヒンジ（H）領域によってSドメインに接続されています。 Pドメインは、ウイルスキャプシドの最も外側の部分を形成するのに対し、Sドメインは、ウイルスRNAの周りに足場を形成します。細菌で発現された場合、Pドメインは、生物学的に関連する二量体に組み立てます。 P DIMERは、糖鎖構造と相互作用し、唾液中の可溶性抗原として存在し、特定の宿主細胞3に見られるヒスト血液型抗原（HBGAs）と呼ばれます。 PドメインHBGA相互作用は、感染4のために重要であると考えられています。確かに、最近の報告で....
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プロトコル
1. Pドメインのクローニング
- ノロウイルス株の配列アラインメントによってPドメインコード領域を決定する（例えば、GII.10株、GenBankの：AF504671、PDB-ID：3ONU）6。また、Pドメイン（ 図2A）のC末端にフレキシブル領域を削除します。 E.のためのDNAを、コドン最適化大腸菌発現とサブクローンPドメインはpMalc2xについての発現ベクター6,7にコード領域への順序でのBamHI（N末端 ）およびNotI（C末端）制限部位を含みます。
注：Pドメインコード領域を最適化し、商業サービスによって合成されます。地域（挿入）をコードPドメインは、長さが約1キロバイトと標準トランスファーベクターで配信します。 - メーカーに37℃で1時間のために各1μLのBamHI（2万U / ml）およびNotIで（10,000 U / ml）を制限酵素でトランスファーベクター2μgのダイジェストは、バッファを供給する。
- 1％アガロースゲル上で消化し、インサートを分離135 Vで20分間、および市販のキットを用いてゲルからの挿入DNAを精製します。
- 各1μlのをBamHI（2万U / ml）で、このベクター2μgのを消化することによってpMalc2xについて発現ベクターを準備およびNotI（10,000 U /....
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結果
記述されたプロトコルの概略図を図1に示されている。プロトコルは、標的遺伝子のクローニング、発現、三段階精製、および結晶化を含む6つの主要な部分をカバーする。 図2は、発現構築物（EC）の設計を示 し、 pMalc2xについての発現ベクターの特性。 pMalc2xについてベクターの多重クローニング部位（MCS）の配列は、制限酵素およびプロテアーゼ切断部位を示す。 図3は、MBP-Hisを-Pドメイン融合タンパク質の代表的なSDS-PAGEの結果を示し、最初の二つの対応する回路図でPドメインを切断しました精製の手順を実行します。第三の精製工程は、図4に示され、精製スキーム、精製されたP領域の溶出クロマトグラムと集めた画分の代表的なSDS-PAGEの結果を伴います。最も純粋な画分をプールし、concentrat（SDS-PAGEによります）ED、およびX線結晶学に使用されます。
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ディスカッション
ここで、我々は高品質と量におけるノロウイルスPドメインの発現および精製のためのプロトコルについて説明します。ノロウイルスは十分に研究されておらず、構造データを連続的に必要とされています。我々の知る限りでは、他のプロトコル（ 例えば 、GSTタグ付きPドメイン）を使用して、Pドメインの生産はこれまでのところ、問題となっており、ノロウイルス-ホスト相互作用に関する十分な構造のデータが行方不明になっています。ここで説明する方法では、我々は最近、結合ノロウイルス炭水化物の分子的詳細の理解に大きく貢献しています。本プロトコルは、種々のタンパク質に適合させることができます。しかし、このプロトコルの実装を成功させるには、精製方法の各部分内のいくつかの要因に依存します。
発現構築物の設計は重要な最初のステップです。我々は、 大腸菌における発現収率を改善するために、Pドメインの発現構築物のコドン最適化を行いますcoliおよび削除RELEコード領域内に存在するvant制限部位。さらに、我々は、結晶化の間の発現およびタンパク質の梱包時にタンパク質.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究のための資金はCHS財団によって提供されました。私たちは、ハイデルベルク大学のエクセレンスクラスターであるCellNetworks内のタンパク質結晶化プラットフォームを、結晶スクリーニングのための欧州シンクロトロン放射線施設の提供を認めています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Pドメイン DNA | Life Technologies | GeneArt 遺伝子合成 | |
| pMalc2x ベクター | ご要望 | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI New | England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep スピン Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| エコノカラム クロマトグラフィーカラム | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 x 10 cm、他のサイズ |
| Ni-NTA アガロー | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | 様々な | 使用が可能10 kDa、30 kDa、50 kDaのカットオフは |
| サブクローニング効率DH5&alphaを使用。コンピテントセル | ライフサイエンステクノロジー | 18265-017 | |
| ワンショット BL21(DE3) ケミカルコンピテント 大腸菌 | ライフテクノロジー | ズ C6000-03 | |
| HRV 3C プロテアーゼ | メルクミリポア | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE ヘルスケア | 28-9893-34 | SEC カラム |
| JCSG コアスイート | キアゲン | 各種 | 4各96ウェルの |
| 炭水化物 | Dextra研究所、英国 | のさまざまな | 血液型製品 |
参考文献
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol....
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再版と許可
