印刷された糖鎖マイクロアレイ戦略を使用して、従来の96ウェルプレートアッセイを小型化し、インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンの結合性とシアル酸含有受容体の特異性を分析しました。
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この記事について
サマリー
要約
機能的な受容体は、細胞への侵入を獲得するようにインフルエンザAウイルス（IAV）赤血球凝集素は、細胞表面上のシアル酸を認識する。野生の水鳥はIAVのための自然宿主であるが、IAVは、家禽、豚、馬やヒトへの種の壁を越えることができます。鳥ウイルスは、ヒトウイルスが優先α2-6結合（人間型受容体）とシアル酸を認識するのに対し、α2-3結合（鳥型受容体）によって最後から二番目のガラクトースに取り付けられたシアル酸を認識する。鳥類ウイルスはヒト型受容体に適合しているかどうかを監視するために、いくつかの方法を用いることができます。合成シアロシドの多様なライブラリーを有するグリカンマイクロアレイはますます受容体特異性を評価するために使用されます。しかし、この技術は、結合活性を測定するために使用されません。結合活性の測定は、典型的には、従来のポリプロピレンの96ウェルプレートに吸着されたグリカンの連続希釈ヘマグルチニンまたはウイルスの結合を評価することによって達成されます。 αとこのアッセイでは、グリカン2-3またはα2-6シアル酸は、ビオチンに結合し、ストレプトアビジンプレートに吸着させ、または直接プラスチックに吸着したポリアクリルアミド（PAA）に結合されています。我々は、有意に直接PAA結合シアロシドマイクロウェルガラススライド上での非PAA結合相手を印刷することによって、このアッセイを小型化しています。このセットアップは、単一のスライド上の48アレイと、二つの非シアル化されたコントロールを含む6種類のグリカンを、尋問、8希釈で6糖鎖結合タンパク質の同時アッセイを可能にします。これは、従来のプレートアッセイで18倍、96ウェルプレートに相当します。グリカンアレイ形式は、化合物および生物学的製剤の消費を減少し、大幅効率が向上します。
概要
ワイルド水鳥IAVのための自然宿主であるが、IAVは、ヒトを含む、家禽および哺乳動物に種関門を通過することができます。ヒトウイルスがα2-6結合したシアル酸（ヒト型受容体）に結合するのに対し、鳥IAVsは、α2-3結合したシアル酸（鳥型受容体）を認識します。効率的に複製および鳥類IAVは、ヒト型受容体1に結合する必要がある人間との間で送信できるようにするには。
IAVsは、その赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）エンベロープ糖タンパク質の抗原性を特徴付ける血清学に基づいて分割されます。 NAはウイルスのライフサイクルと切断するシアル酸2の他端の受容体破壊酵素であるのに対し、HAは、シアル酸に結合します。 H1N1、H2N2およびH3N2を含むすべての人間の感染ウイルスは、鳥類の起源3を持っています。人間のクロスオーバーには、いくつかの鳥十年の最後の2にわたりH5N1、H7N7、およびH7N9で、発生しているが最もよく知られています。ハウ版は、他のサブタイプはより散発的に人間に感染した（H6N1、H7N1、H7N2、H9N2、H10N7、H10N8）4。幸いなことに、これらのウイルスのいずれも完全ヒト型α2-6結合シアル酸受容体5-8に適応できていなかったようです。ヒト宿主内で複製および伝送に対応するために、鳥や他の人獣共通感染ウイルスの適応は、人間....
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プロトコル
注：特に指定のない限り、すべての工程は室温で実施されます。
1.アレイの構築
- グリカン調製とプレートのセットアップ
- 印刷バッファの株式を準備します。まず、第二リン酸ナトリウムの150mMのストック溶液の500ミリリットルを作ります。また、リン酸二水素ナトリウム溶液150 mMストック溶液50mlを加えます。 8.5のpHに到達するまでフラスコに、磁気攪拌棒及びpHメーターを使用して、ゆっくりと一塩基性溶液と第二リン酸ナトリウム溶液を滴定します。 0.005％へのTween-20を追加します。
- グリカンのサンプルを準備します。希薄PAA共役グリカン、（diLacNAc（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA）、3SLNLN（Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA）と6SLNLN（Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA（ 図1A ））step1.1.1から印刷バッファには100μg/ mlに希釈される。一価グリカンdiLacNAc（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-（CH 2）3 NH 2、3SLNLN（Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - （CH ....
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結果
印刷、スキャン＆データ分析します
適切な印刷を確保するためには、スライド上の各アレイの輪郭を描くテフロンマスク内の斑点グリッドの正確なアライメントを持っていることが重要です。テフロンコーティングの性質に、印刷中に、スポットがMPXスライド上の肉眼で見ることができません。注目は、ポリ-L-リジンコートしたスライド上のプレスポットの出現にその後支払われます。直接印刷した後、各スライドが原因スポットで乾燥させ、バッファーの塩に表示され、各スポッティング化合物の存在を目で確認する必要があります。アレイは、テフロン国境やスポッティング機能の正しい数内のスポットの正確な位置合わせのために検査されます。
スライドは、光退色を避けるために、より高いスキャン電源に下の反復プロセスでスキャンされ、HIGの比較を可能にしています彼女の結合活性は、それぞれ、.......
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ディスカッション
IAV受容体の特異性を評価することは、鳥ウイルスのパンデミックの可能性を分析する上で重要なステップです。ウイルスによるシアル酸の認識は、そのような細胞からへの結合および放出などのいくつかの生物学的性質に連結されています。鳥ウイルスが結合α2-6達成し、種の壁は、パンデミック対策を可能に交差するの知識は、アミノ酸の変異が必要です。いくつかのアッセイは、受容体特異性を決定するために使用されます。しかし、すべてが唯一の特異性とその逆の結合活性を測定していないなど、自分の欠点を有しています。
ここでは、より複雑なグリカンのPAA-リンクされている端末の断片を使用して広く使用され、受け入れられたELISA、に基づく新規な小型化されたツールについて説明します。 4明確に定義されたレクチン、植物の2及びインフルエンザの2ウイルスの起源を使用して、我々は特異性と相対的な結合活性を維持することを示しています。
我々は、化学物質の削減とBIOLOGの量を計算するとグリカンアレイチップ上にELISAを小型化することにより、使用の.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません
謝辞
この作品は、スクリップスマイクロアレイ基盤施設、及び疾病対策センター（JCP）からの契約によって部分的にサポートされていました。 RPdVは、科学研究費オランダ機構（NWO）からルビコンとVENI助成金の受取人です。 NIGMS助成金GM62116（JCP）によって資金を供給機能グライコミクスのためのコンソーシアム（http://www.functionalglycomics.org/）は、この研究で使用されるいくつかのグリカンを提供します。これは、スクリップス研究所から出版29113です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ネクステリオン®スライドH MPX-48 | Schott | 1091525 Microwell スライド | |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | 、共焦点マイクロアレイ | |
| スキャナーInnoscan 1100ALスキャナー/ Mapixソフトウェア | Innopsys | - | 共焦点マイクロアレイ |
| スキャナーMicroGridII を廃止しました。 | Digilab-microaray | プリンター | |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | 植物レクチン |
| ECA | ベクターラボ | B-1145 | 植物レクチン |
| 抗連鎖球菌 | IBA | 2-1509-001 | HA結合用アニトボディ |
| アンチマウス Alexa-647 | Life | A-21235 | HAバインディング用アニトボディ |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | 洗剤 |
| 二塩基性リン酸ナトリウム | シグマ | 255793 | 印刷緩衝液成分 |
| 一塩基性リン酸ナトリウム | シグマ | 229903 | 印刷バッファコンポーネント |
| ポリ-l-リジン溶液 | Sigma | P8920 | スライドコンポーネントを事前に検出 |
| 水酸化ナトリウム | シグマ | 221465 | プリスポッティングスライド成分 |
| エタノール | シグマ | 493546 | プレスポッティングスライド成分 |
| リン酸塩緩衝生理食塩水 | コーニング | 46-013-CM | インキュベーション/洗浄バッファー |
| SMP4B ピン | Telechem | SMP4B | 印刷ピン |
| 圧縮窒素 (グレード5) | Praxair | UN1066 | 一般 ダスティング・乾燥具 |
| ホウ酸 | シグマ | B6768-500G | スライドブロッキング試薬 |
| エタノールアミン | Σ E9508-500ML | スライドブロッキング試薬 | |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | グリッドマーカー オンアレイ |
| PAA-LNLN | 機能的グライコミクスコンソーシアム | PA368 | スポッテッドグリカン |
| PAA-3SLNLN | コンソーシアム機能的糖鎖 | PA362 | 斑点糖鎖 |
| PAA-6SLNLN | 機能的糖鎖コンソー | PA343 | 斑点糖鎖 |
| LNLN | 機能的糖鎖コンソーシアム | Te98 | 斑点糖鎖 |
| 3SLNLN | 機能的糖鎖コンソー | Te175 | 斑点糖鎖 |
| 6SLNLN | 機能的糖鎖 | Te176 | スポッテッドグリカン |
| 384ウェルマイクロタイタープレート | マトリックス TechCorp | 4361 | 印刷プレート |
| VWR ラボマーカー | VWR | 52877-150 | スライド番号 |
| ウィートン スライド染色皿 | シグマ | Z103969-1EA | ブロッキングと乾燥 |
参考文献
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional ba....
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再版と許可
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