Marginating肺白血球の選択的ハーベスティング

サマリー

Marginating-pulmonary leukocytesは、他の白血球集団と比較して、独特の特徴と明確な免疫学的機能を示します。ここでは、ラットとマウスの肺の強制灌流による、この肺白血球の亜集団の選択的採取について説明します。辺縁性肺白血球は、血液媒介性疾患および肺関連疾患に対する感受性を決定する上で重要であるようです。

要約

辺縁肺(MP)白血球は、肺毛細血管の内側の内皮に付着する白血球です。MP白血球は、他の免疫区画の白血球と比較して、特異な組成および特性を示すことが示された。証拠は、ナチュラルキラー細胞のより高い細胞毒性、および循環免疫細胞または脾臓免疫細胞と比較して、MP白血球集団の明確な炎症誘発性および抗炎症性プロファイルを示唆しています。本明細書に提示する方法は、マウスまたはラットのいずれかにおける肺の強制灌流によるMP−白血球の選択的回収を可能にする。肺白血球を抽出するために使用される他の方法、例えば組織粉砕や生物学的分解とは対照的に、この方法は、実質細胞、間質細胞、および気管支肺胞細胞で汚染されていない肺毛細血管から白血球のみを生成します。さらに、灌流技術は、組織処理による生理学的反応を誘発することなく、MP白血球の完全性と生理学的環境をよりよく保存します。このユニークなMP白血球集団は、すべての循環悪性細胞と感染細胞が肺毛細血管を通過する間に保持され、内皮細胞や常在白血球と物理的に相互作用するため、異常な循環細胞を特定して反応するために戦略的に配置されています。したがって、MP白血球の選択的捕捉とさまざまな条件下での研究は、特に循環異常細胞と肺関連疾患の制御に関して、それらの生物学的および臨床的意義の理解を前進させる可能性があります。

概要

肺の毛細血管（ すなわち 、marginating肺（MP）白血球^）1は、他の免疫の区画（ 例えば 、循環、脾臓、骨髄）からの白血球に比べて明確な白血球の組成とユニークな活性を示すことが示された^、2-に付着した白血球^4。例えば、循環および脾臓NK細胞、並びに分化したメッセンジャーRNA（mRNA）レベルおよびプロおよび抗炎症性サイトカインの分泌増加と比較して、種々の腫瘍細胞に対するMP-白血球展示高いナチュラルキラー（NK）細胞の細胞毒性。 MP-白血球は循環白血球（50％対それぞれ、30％）と比較して、先天性/適応免疫の高い比を有するように、細胞の組成物はまた、循環白血球から区別されます。本明細書に提示された方法の目標は、この重要かつユニークな免疫コンパートメント（細胞集団）を研究するために、およびelucに、MP-白血球の選択的ハーベスティングを可能にすることですこれらの特定の細胞上の各種操作（ 例えば 、免疫活性化）の影響をIDATE。

このユニークな集団の意義を理解するために、免疫系の細胞性免疫（CMI）のインビボでの機能を介して腫瘍細胞、微小転移、および残留疾患、循環制御することができることに留意することが重要です。この能力は、原発腫瘍を制御するために、免疫系の先行障害が発生しても明らかであり、かつ癌患者および動物モデル⁵ in vivoでの証拠で十分でサポートされています。重要なことには、これらの知見は、多くの場合、インビトロと矛盾しており、ほとんどの自己腫瘍細胞（細胞傷害性アッセイによって測定される）は、ヒトおよび動物から血液試料中の白血球を循環させることにより細胞毒性に抵抗性であることを報告エクスビボ研究^6,7。この不一致は、前述のように異なる白血球集団のin vivoでの存在に起因し得ます前記MPの白血球集団、および活性化NK細胞³の特にその亜集団。実際に、循環および脾臓白血球に対して耐性であることが見出された同系腫瘍細胞（MADB106）は、MP-NK細胞^3,8によって溶解されることが示されました。したがって、fischer344（F344）ラットの肺に転移容疑「NK抵抗性」MADB106細胞ではなく、循環または一般アクセスの容易さを与えられた研究された脾臓NK細胞によってMP-NK細胞により制御されます。

精製された、アクティブMP-白血球は肺組織の研削または生物学的分解⁹に基づいており、肺からの白血球の標準的な収穫方法、を介してアクセスできません。我々のアプローチは、組織処理の手法と比較して、2つの主要な利点を有します。まず、灌流アプローチは、選択的に肺実質、間質、および気管支肺胞比較例に由来する他の細胞からそれらを分離、MP-白血球を収穫しますtments。第二に、潅流技術は、より良い研削および生物学的処理が損傷細胞は、その形態を変化させることをアプローチとは異なり、完全性およびMP-白血球の生理的環境を維持し、生産および免疫活性を調節し、特にNKを抑制する様々な因子の放出を誘発します細胞毒性^10。

肺は、癌転移のためにと、さまざまな感染症の主要な標的器官です。すべての循環悪性細胞と感染した細胞は、それらが変形し、毛細血管内皮細胞と常駐白血球と対話する必要が肺毛細血管を通過します。これらの条件下では、循環細胞は、容易に常駐MP-白血球によって標的化することができます。従って、この免疫コンパートメントに白血球を活性化しているように、生物学的に有利なようで、別の、生物学的実験、及び臨床現場では、このユニークなMP-人口を検討することが重要です。そのSYを注意する価値があります様々な生物学的応答調整剤によってstemic免疫活性化（ 例えば 、ポリイノシン-ポリシチジル酸（ポリI：C）またはC型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CPG-C ODNは））より白血球^3を循環^させるよりもMP-白血球を活性化することが示されています^{、 8,11。}

プロトコル

動物を対象とする手順は、テルアビブ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。

1.ラットプロトコル

1. 準備
   1. 2バタフライ21 G針を配置します。必要に応じて、針の鋭いエッジを提出することにより、2鈍いエッジの蝶21 G針を準備します。
   2. 重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブにより滅菌はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、止血鉗子、歯組織鉗子：手術器具を滅菌します。
   3. リン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）溶液1mlあたりヘパリン30単位を添加することにより、ヘパリン化PBS（30単位/ ml）を調製します。 RTで使用してください。 35ミリリットルは、動物ごとに必要な最小量です。
   4. 気泡を回避するために、蠕動ポンプラインバタフライ針にヘパリン化PBSを流します。
2. MP-白血球の肺およびコレクションの灌流
   1. 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。呼吸停止を監視することによって安楽死を確認してください。
   2. 呼吸が停止すると、すぐに滅菌はさみや歯組織鉗子を使用して、腹膜や胸の空洞を開きます。剣状突起に腹部に沿って正中腹部切開を行います。
   3. あらゆる臓器や大血管を穿刺することなく、慎重に両側の肋骨を切断、ピンセットを用いて胸骨を持ち上げます。胸骨上の止血剤をクランプし、吻側心肺複合体を露出させるために胸郭を折ります。
   4. 心臓の右心室に翼状針を挿入し、約分以内（〜250グラムの動物から6ミリリットル）をシリンジに血液の最大量を収集します。
   5. （ 説明を参照）は、肝臓の後方灌流を回避するために、止血剤と大静脈をクランプします。
   6. Pの流出管に血液を含む注射器を交換しながら、右心室の中に蝶の針を保持しますeristalticポンプ。
   7. 心室中隔の浸透を回避し、左心室に5ミリリットルの収穫シリンジに接続された第二の翼状針を挿入します。
   8. 約5ミリリットル/分の速度で蠕動ポンプの電源を入れ、ゆっくりとシリンジに血液で汚染された灌流液の最初のミリリットルを集めます。灌流液の色が淡赤色暗からなるまで続けます。 （血液汚染perfusteを捨てます）。
   9. 蠕動ポンプの停止することなく、速やかに20ミリリットル収穫シリンジで5ミリリットルの収穫シリンジを交換し、灌流の高速（最大7 ml /分）を用いた肺灌流液の20ミリリットルを集めます。真空形成を回避しながら継続的に、収集シリンジへの灌流液の流れを監視します。
   10. 蠕動ポンプの流れを止めます。
3. 白血球の抽出
   1. 400×gで10分間の灌流液を遠心。
   2. 流体を吸引します。
   3. 、10 mlのPBSまたは培地を追加し、10分間400×gで遠心分離し、液体を吸引除去します。二回、この手順を繰り返します。 PBSまたは培地の使用は、サンプルの結果としての用途に依存します。
   4. 10分間400×gで20ミリリットルPBSまたは培地、遠心分離機を追加し、流体を吸引。
   5. 使用例（FACS、PCR、 等 ）に基づいて、所望の濃度に細胞を再構成します。

2.マウスプロトコル

1. 準備
   1. 2バタフライ25 G針を配置します。必要に応じて、針の鋭いエッジを提出することにより、2鈍いエッジの蝶25 Gの針を準備します。
   2. 重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブにより滅菌はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、止血鉗子、歯組織鉗子：手術器具を滅菌します。
   3. 1×PBS溶液1ml当たりヘパリンの30ユニットを追加することにより、ヘパリン化PBS（30単位/ ml）を準備します。 RTで使用してください。 25ミリリットルは、動物ごとに必要な最小量です。
   4. STRE気泡を回避するために、蠕動ポンプラインバタフライ針にPBSをヘパリン化しています。
2. MP-白血球の肺およびコレクションの灌流
   1. 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。呼吸停止を監視することによって安楽死を確認してください。
   2. 呼吸が停止すると、すぐに滅菌はさみや歯組織鉗子を使用して、腹膜や胸の空洞を開きます。剣状突起に腹部に沿って正中腹部切開を行います。
   3. あらゆる臓器や大血管を穿刺することなく、慎重に両側の肋骨を切断、ピンセットを用いて胸骨を持ち上げます。胸骨上の止血剤をクランプし、吻側心肺複合体を露出させるために胸郭を折ります。
   4. （説明を参照）は、肝臓の後方灌流を回避するために、止血剤と大静脈をクランプします。
   5. 右ヴェンに蠕動ポンプの流出管に接続された翼状針を挿入心のtricle、および心臓の左心室、心室中隔のavoidingpenetrationに2ミリリットルの収穫シリンジに接続された第二の翼状針。
   6. 約2ミリリットル/分の速度にポンプの電源をオンにし、灌流液は淡赤色暗からなるまで（血液汚染perfusteを捨てる）収穫シリンジに血液で汚染された灌流液の最初のミリリットルを集めます。
   7. 蠕動ポンプの停止することなく、速やかに10ミリリットル収穫シリンジを用いて2ミリリットルの収穫シリンジを交換し、灌流の高速（最大4 ml /分）を用いた肺灌流の10ミリリットルを集めます。真空形成を回避しながら継続的に、収集シリンジへの灌流液の流れを監視します。
   8. 蠕動ポンプの流れを止めます。
3. 白血球の抽出
   1. 400×gで10分間の灌流液を遠心。
   2. 流体を吸引します。
   3. 400で10 mlのPBSまたは培地、遠心分離機を追加10分間XG、および流体を吸引。この手順を3回繰り返します。 PBSまたは培地の使用は、サンプルの結果としての用途に依存します。
   4. 、10 mlのPBSまたは培地を追加し、10分間400×gで遠心分離し、液体を吸引除去します。
   5. 使用例（FACS、PCR、 等 ）に基づいて、所望の濃度に細胞を再構成します。

結果

MP-コンパートメント展示循環白血球に比べて異なる白血球サブセット組成物。フローサイトメトリー分析を用いて、白血球の亜集団が同定され、両方の循環及びMP白血球の組成を特徴付けるために定量化しました。顆粒球およびリンパ球は、前方および側方散乱体に基づいて同定しました。リンパ内、NKRP-1 ^明るい細胞は、NK細胞、単球のようなT細胞のようなCD3 ^{+、RM1 +、}及びCD4 ⁺ / CD8 ⁺ / CD25として同定された⁺ T細胞亜集団の同定のために使用しました。顆粒球、単球、およびNK細胞を含む先天性免疫は、血液循環（P <0.05）27.9％（0.66±％）と比較して、MP-白血球集団の52％（±1.52％）を構成します。逆に、CD4 ^{+、CD4 +} CD8 ⁺ T細胞、および調節（CD4 ⁺ CD25 ^+）を含むT細胞亜...

ディスカッション

本明細書に提示された方法は、MP-白血球のユニー​​クな人口の選択的ハーベスティングと勉強を可能にします。循環または脾臓の白血球に比べて、MP集団は、白血球の亜集団の別個の組成物は、より高い活性化レベル、種々のサイトカインのより高い放出、ならびにプロおよび抗炎症性サイトカイン^2,3の高いmRNAレベルによって特徴づけられます。具体的には、MP-NK細胞は、様々な標的細胞^3,4-に対して循環NK細胞よりも細胞傷害性であり、及びインターフェロンγのより高いレベルで発現することが示されています。全体として、我々の結果は、MP-NKの白血球が血液媒介転移および肺転移を制御する上でより大きな生物学的意義を意味するものであり、したがって、NK細胞を循環し、より高い細胞毒性を有することを示唆しています。したがって、脾臓または循環白血球が金本位制や免疫学的状態を反映するためのデフォルトの人口、およびヒトでの研究と考えるべきではないというコムmonlyは慎重に解釈されるべきである循環白血球のみに依存しています。また、様々な疾患は、特に肺を与えるように、免疫がこの器官内に研究されるべきであり、実際に私たちの灌流ア...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
オートクルード蠕動ポンプ
バタフライニードル	OMG		26G
バタフライニードル	OMG		21G*3/4インチ
シリンジ	Pic 溶液		1 ml
シリンジ	Pic 溶液		2.5 ml
シリンジ	Pic 溶液		5 ml
シリンジ	ピック溶液		10ml
シリンジ	ピック溶液		25ml
鈍い刃の鉗子
さみ
止血
組織鉗子
ヘパリン ナトリウム ブタ粘膜 (保存剤フリー)	シグマ・アルドリッチ

は