原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

サマリー

リボソームの構造は広範囲に特徴付けられていますが、ポリソームの組織化はまだ十分に研究されていません。この知識不足を克服するために、ここでは、空気中および液体中の原子間力顕微鏡(AFM)による哺乳類のポリソームの正確なイメージングのための詳細な準備プロトコルを示します。

要約

翻訳機構は、 すなわち、ポリソームまたはポリリボソームは、細胞内で最大かつ最も複雑な細胞質機械の一つです。リボソーム、mRNAを、いくつかのタンパク質非コードRNAによって形成されたポリソームは、翻訳制御が行われるプラットフォームを統合表します。リボソームは、広く研究されているがしかし、ポリソームの組織はまだ包括的に理解を欠いています。このように多くの努力がポリソーム組織と埋め込まれていてもよい翻訳制御のいずれかの新たなメカニズムを解明するために必要とされます。原子間力顕微鏡（AFM）は、ナノスケールの解像度で3D画像の取得を可能にする走査型プローブ顕微鏡の一種です。電子顕微鏡（EM）の技術に比べて、AFMの主な利点の一つは、それが染色およびプロ固定を必要とせずに近くの生理学的条件下で維持されるべきサンプルを可能に空気中で、溶液中に両方の画像の数千を取得することができるということですcedures。ここでは、マウス脳及びマイカ基板上での堆積からポリソームの正確な精製のための詳細なプロトコールが記載されています。このプロトコルは、AFMと3次元物体としての復興と空気や液体中でポリソームイメージングを可能にします。低温電子顕微鏡（クライオEM）に相補的な、提案された方法は、好都合に系統的ポリソームを分析し、それらの組織を研究するために使用することができます。

概要

タンパク質の合成は、細胞^1,2の中で最もエネルギーを消費するプロセスです。したがって、タンパク質の存在量は、主に翻訳なく転写レベル^3,4,5で制御されることではない驚くべきことです。ポリソームは、機能的なタンパク質性の読み出しへのmRNAの情報を変換する基本的な高分子成分です。ポリソームは、これまでいくつかの翻訳のコントロールが^6-13を収束高分子複合体として認識されています。リボソーム構造^14〜16に関する研究の数百にもかかわらず、翻訳のダイナミクスへの詳細な分子洞察やポリソームのトポロジーは、限られた関心が発生しました。その結果、ネイティブポリソームリボ核タンパク質複合体の組織や翻訳に対する潜在的な効果はまだとても曖昧な問題です。ポリソームは、潜在的にどのようなヌクレオソームとエピジェネティック制御をミラーリング、まだ不明注文し、機能的な組織を非表示にすることができますlsコマンドは、転写フィールドに表されています。実際、この魅力的な仮説の調査は、さらなる研究と新しい技術的なアプローチが必要です。この行では、構造的な技術や原子間力顕微鏡は、実り同様にヌクレオソーム^17,18のために達成されたものに、遺伝子発現を制御するための新しいメカニズムを解明するために協力することができます。

リボソーム^14-16の発見以来、その構造は、広範囲のタンパク質合成のベースにメカニズムの分子の説明を提供する、原核生物^19,20、より最近のヒト²²における酵母²¹とで特徴付けられています。ポリソームは、最初は、一般的な2D幾何学的な組織^14を形成^し 、小胞体の膜に認められました。前に述べたように、ポリソームアセンブリは、リボソーム構造などの一定の関心の対象ではなかったです。過去には、ポリソームはTRによって、本質的に研究されてきましたansmission EMベースの技術。ごく最近になって、クライオEM技術は、人間の細胞溶解物²⁷またはセル²⁸で^、23-26 インビトロ翻訳系から精製されたポリソームの3D再構成を可能にしました。これらの技術はポリソーム^23、26-28と小麦胚芽ポリソーム²⁴内の隣接するリボソームの接触面の予備的分子の説明ではリボソームリボソーム組織に関するより多くの洗練された情報を提供しました。したがって、クライオEM断層撮影法は、分子の詳細とリボソームリボソーム相互作用の開示を可能にするが、それはデータ処理のために重い計算リソースを必要とする大規模なポスト処理及び再構成の分析によって負担されます。また、リボソームリボソーム相互作用の分子の詳細を得るために、リボソームの高解像度のマップが必要とされ、基準リボソームのこの種のは、ほんの数種のために利用可能です。重要なことは、低温電子顕微鏡断層撮影法では、無料RNAを検出することができません。 Theref鉱石は、新しい技術が完全に翻訳機構の組織を理解する必要があります。

クライオEMのほかに、AFMはまた、下等真核生物^29-33と人間²⁷にポリソームの直接画像化のための有用なツールとして採用されています。 EMと比較すると、AFMには、サンプルの固定または標識化を必要としません。また、測定は、近くの生理学的条件下で、はっきりとリボソームと裸のRNA鎖²⁷の両方を特定するユニークな可能性を用いて行うことができます。単一ポリソームのイメージングは​​、広範かつ重いポスト処理及び再構成に比べて少し後処理の労力でナノ分解能で数千ものイメージを取得し、比較的迅速に行うことができるクライオEM顕微鏡で必要とされる分析。その結果、AFMデータハンドリング及び分析は、高価なワークステーションと高い演算能力を必要としません。このように、この技術は、ポリソームの形状に関する情報を収集し、形態学的特性（例えば高さ、長さと幅）、リボソーム密度、自由なRNAの存在とクライオEMよりも高いスループットでポリソーム²⁷あたりのリボソームの数。このように、AFMはポリソーム^27を描写するためにEM技術に強力かつ補完的なアプローチを示します。

ここでは、AFMが画像に適用し、マウス脳ポリソームを分析されたデータの分析に精製からの完全なパイプラインを提示します。提案されたプロトコルは、精製の問題にとAFMイメージングのために使用されているマイカ基板上のポリソームの正確な堆積に焦点を当てています。簡単にAFMコミュニティで使用される一般的なソフトウェアを用いて行うことができる従来の粒子の分析に加えて、RiboPick呼ばImageJの³⁴プラグインは、ポリソーム^27、35当たりのリボソームの数をカウントするために提示されています。

プロトコル

マウス組織を得るために使用される慣行は、トレント大学（イタリア）の動物の保護（OPBA）、プロトコルがないためにボディによって承認されました。 art.31政令に従って、04から2015まで、ありません。 2014分の26。全てのマウスを統合生物学センター（CIBIO）、トレント大学、イタリアのモデル生物の施設で維持しました。

注意：サンプルの任意のRNA分解を避けるためのRNaseの混入を最小限にするためにDEPC処理水を使用してすべてのバッファを準備します。

脳全体からポリソームの調製

1. 脳組織収集（15分）
   1. 5分³⁶ CO ₂窒息と野生型マウス株C57BL / 6を安楽死させます。慎重に、頭蓋骨³⁶から脳を解剖1.5mlチューブに組織を配置し、直ちに液体窒素中に入れてください。使用するまで-80℃で保管してください。
2. 溶解液の調製（30分）
   1. 使用した全脳組織を粉砕液体窒素下で乳鉢と乳棒。
   2. 冷たいマイクロ遠心チューブに約25mgの粉末を移し、すぐにすぐに上下にピペッティング25回溶解バッファー（ 表1参照）の0.8ミリリットルを追加し、細胞を崩壊させる（粉砕組織の融解を避けるため）。
   3. 細胞破片をペレット化し、4℃で1分間、12,000×gでチューブを遠心。
   4. 新しいマイクロチューブに上清を移し、15分間氷上でチューブを保持します。
   5. 核とミトコンドリアをペレット化し、4℃で5分間、12,000×gでチューブを遠心。
   6. 新しいマイクロチューブに上清を移します。
   7. 6ヶ月の最大のために-80℃で上清を保存したり、すぐにそれを使用しています。
3. スクロース勾配調製し、遠心分離（2時間30分）
   1. RNaseフリー水（ジエチル処理水（DEPC-水）または商業）ANと広範囲に洗浄超遠心管D 3％H ₂ O ₂ / DEPC H ₂ O溶液。
   2. 氷の上にチューブを入れて、（スクロース溶液については表1を参照）を各チューブの底の冷たい50％ショ糖溶液の5.5ミリリットルを追加します。慎重にチューブが完全に満たされるまで、鋭い相間を維持するために、中間相に近い滞在し、ドロップすることにより、15％ショ糖溶液のドロップを追加します。チューブが完全に満たされると、気泡の形成を回避するために、ゴム栓で閉じます。
   3. 寒い部屋で静かに水平管を敷設し、2時間、この位置に保管してください。この時間の後、ゆっくりとバック垂直位置にチューブをまっすぐにし、氷の上に置きます。グラデーションは現在、使用される準備ができています。また、前者の従来の勾配を使用して、百分の15から50までのショ糖勾配を準備します。
   4. すなわち、上清をSTEで得られた（低温室で勾配の上部から慎重に1.0ミリリットルを除去し、細胞質ゾル溶解物とのドロップによりショ糖降下をオーバーレイP 1.2）。
   5. 慎重スイングバケットローターのバケットにチューブを下げます。超遠心機を用いて、4℃で18万×gで100分間の勾配を遠心分離します。
   6. 遠心分離後、勾配は安定化させるために4℃で20分間、彼らのバケットにチューブを残します。
4. スクロース勾配分画（2時間）
   1. 慎重に超遠心ローターから1超遠心管を削除し、密度勾配分画システムのコレクタ装置にマウントします。 （ 図1上パネルを参照してください）UV / VIS検出器を用いて260 nmの吸光度を監視する1ミリリットルの画分を収集します。氷の上で集めた画分を保管してください。
   2. 、関心の画分の30-40μlのアリコートを準備し、使用するまで-80℃で保管する前に、氷の上に保管してください。二つ以上の凍結融解サイクルを受けたアリコートまたはショ糖画分を使用しないでください（ 図1下のパネルを参照）。

原子間力顕微鏡（3時間）2.サンプル調製

1. マイカシートをはがし、テープを使用しました。
2. DEPC水でマイカシートを3〜4回​​洗浄し、小さなペトリ皿に入れてください。その後、空気を用いて表面を乾燥させます。
3. 1 mMののNiSO _4200μlでマイカをカバーし、室温で3分間インキュベートします。
4. ニッケル溶液を外し、空気を用いて表面を乾燥。氷の上に雲母とペトリ皿を置くことによって4℃で将来のすべてのステップを実行してください。
5. 氷の上に1.4.2で得られた一定分量を解凍し、軽く雲母のドロップにより試料滴のすべてを追加します。 100~200μlのチップを使用して、雲母の表面全体にサンプルを広げ。 3分間氷上でサンプルをインキュベートします。
6. 200μlの冷緩衝液-AFM（ 表1参照）でドロップすることによりマイカシートの低下をカバーし、氷上で1時間インキュベートします。
7. 液体中のイメージング
   1. 慎重にバッファ-AFMを削除し、マイカシート3-4時間を洗います200μlの冷緩衝液-AFMでのsが過剰ショ糖を除去しました。次いで、溶液のいくつかのマイクロリットルで覆われた雲母表面を残し、（ 表1参照）冷洗浄液でマイカシートを3回洗浄します。
   2. 3（画像取得）を指すように移動します。
8. 空気中のイメージング
   1. 慎重にバッファ-AFMを削除し、過剰ショ糖を除去するために、200μlの冷緩衝液-AFMでマイカ3-4回洗浄します。そして、マイカを冷洗浄溶液で3回洗浄する（ 表1参照 ）、紙を使用して余分な水分を排出します。
   2. 部分的に開いたペトリ皿の上部との化学フード下で乾燥させるためにサンプルを残します。 2時間後、室温でペトリ皿と店を閉じます。彼らは何年も安定しているように2〜3時間後のサンプルを測定します。

3.画像取得（熱安定化後の画像あたり15分）

注：雲母上に固定化されたポリソームがACモードを使用して、空気中または液体中で画像化することができます。

1. 両面テープを使用して、サンプルホルダーに雲母を取り付けます。
2. 製造元の指示に従ってAFMステージにおけるサンプルホルダーを挿入します。可能な場合、撮像は、液体中に、時間的にポリソーム安定性を高めるためより低い温度25℃でサンプルを維持しようとします。
3. ACイメージングに適したカンチレバーを選択して、チップホルダ以下のメーカーの指示にマウントします。ここでは、空気のイメージングのための2-20 N / mおよび液体イメージングのための周りに0.1 N / mの間に一定の力で使用カンチレバー。
4. カンチレバー上のレーザスポットを調整し、象限検出器信号をゼロ。
5. 時宜を得た駆動周波数を選択して、10から20ナノメートルの振幅でカンチレバーを駆動します。
6. 先端が表面に係合するまでサンプルに近づきます。
7. 2×2ミクロンのスキャン領域を選択し、少なくとも512×512ピクセルの画像を取得する（ピクセル幅<4 nm）を、ライブバックグラウンド減算モードと20〜25ナノメートルのZスケールを選択します。
8. トンを点検彼は、画像範囲25から30ナノメートルの空気と25と液体中の30nmの幅で取得する際の10と15nmの間の高さによって特徴づけラウンド物体の存在を探しています。鋭利なものを可視化されるまで、設定値とフィードバックのパラメーターを調整します。背景には、いくつかの2-4 nmの高さのオブジェクト（ 図2AおよびBを参照）で、良好な試料中の比較的平坦な表示されます。
9. （ポイント3.8で示されるように）画像が良く見える場合は、別のサンプル領域におけるいくつかの（少なくとも10）2×2ミクロンのスキャンを取得します。
10. （任意）。必要であれば、選択されたポリソームの高解像度の画像を取得する（ 図2C参照 ）。
11. AFM像の任意の傾きを除去し、効果を漂流を修正するためにソフトウェアの修正（平面減算およびライン・バイ・ライン補正アルゴリズム）を適用します。

4.データ解析（画像あたり30分）

1. ImageJの中のエクスポート画像（オプション：スケールファクタを適用）preferentially 例えば 、可逆圧縮フォーマットを使用して、TIFF形式（ 図3A参照 ）。
2. （ 図3Cを参照）ポリソームでリボソームをカウントする（ 図3Bを参照）、サンプルの統計的特性を計算するために（ImageJのマクロ/ツールセットのサブディレクトリにコピーする）ImageJのマクロツールセットRiboPick.ijmを使用してください。
   1. プログラムの初期化<読み取り画像>ツールを使用して画像をロードを開始。
   2. 標準ImageJの<ポイント選択>ツール（シフト+左クリックは、リボソームの複数選択を可能にする）とリボソームセンターを選択してください。 <マークリボソーム>ツールで選択されたリボソームをマークします。リボソーム座標は、カスタムテキストウィンドウに表示されます。
   3. ポイント4.2.2で示す手順を繰り返す同じポリソームへのより多くのリボソームを追加します。
   4. 第1に最後に追加されたリボソームから取り外す開始する（<最後のピックを元に戻す>ツールを使用して、誤ってマークされたリボソームを削除します212;現在のポリソーム中のみ）。
   5. ポリソームが完了すると、<新規ポリソーム>ツールを使用します。ポリソーム数は画像のオーバーレイとして追加されるように、テキストウィンドウが更新されます。
   6. リボソームを書くために、<結果を保存して閉じを>使用して、ファイル（画像のデフォルトの単位が使用されている）と、選んだリボソームおよびポリソームをまとめたPNG画像を調整します。元の画像は保存されずに閉じられています。

結果

全マウス脳のショ糖勾配ポリソームプロファイリング

彼らの重量とサイズに合わせて巨大分子を分離ポリソームプロファイリングによって、細胞溶解物からポリソームを精製することが可能です。ポリソームプロファイリングでは、このような本例のように培養した細胞または組織から得られた細胞質溶解物は、（その沈降係数に従って40Sおよび60Sサブユニット、80Sリボソームおよびポリソームから無料でRNAを分離するために超遠心分離することにより、線形ショ糖勾配上にロードされ、処理されます図1上パネル）。 254 nmでサンプルの吸光度とフラクションコレクションは、転写物あたりのリボソームの数が異なるリボソームやポリソームに富むショ糖画分の分離を可能にします。画分を集め、AFM画像化のために等分し、-80℃で保存することができる（ 図1下のパネル）。

ディスカッション

DNAの構造は転写およびクロマチンの組織化は、遺伝子発現の転写制御の我々の理解を進めたようなプロセスを記述するために最も重要であることが証明されたように、真実の理解を向上させるためにポリソームの組織構造を分析することが不可欠です翻訳とその調節の。

記載されたプロトコルを用いて、穏やかに平坦な表面上に固定化されたポリソームの最適密度は、AFM画像化に適したが得られます。好都合に調製したサンプルでこれらの条件を使用して、毎時約50ポリソームは、さらなる分析および特徴付けのための準備ができて取得することができます。また、室温で保存された乾燥した試料を、一年以上後のイメージングに適していることが証明されています。

成功した私たちのプロトコルでポリソーム画像を得るために、いくつかの重要なステップがあります：適切dissectio直後に瞬間凍結された組織を使用しますnおよびRNA分解を最小限に抑えるために-80℃で保存しました。 mRNAからリボソーム解離を避けるために、シクロヘキシミドおよびRNase阻害剤を含む溶解緩衝液を使用します...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シクロヘキシミド	Sigma	01810	ライセートの調製
DNAseI	Thermo Scientific	89836	ライセートの調製
リボロック RNAse阻害剤	ライフテクノロジー	EO-0381	ライセートの調製
DEPC	Sigma	40718	ライセートの調製
Triton X100	Sigma	T8532	ライセートの調製
DTT	Sigma	43815	ライセートの調製
デオキシコール酸ナトリウム	Σ	D6750	ライセートの調製
微量遠心分離機	エッペンドルフ	5417R	ライセートの調製
ショ糖	Sigma	S5016	ショ糖勾配調製
超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマ LE-80K	ショ糖勾配遠心分離機
超遠心分離機 ローター	ベックマン・コールター	SW 41 Ti	ショ糖勾配遠心分離
ポリアロマーチューブ	ベックマン・コールター	331372	ショ糖勾配遠心分離
Density Gradient Fractionation System	Teledyne Isco	67-9000-176	糖勾配分画
AFM	アサイラム研究	サイファー	ポリソームの視覚化