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方法論記事

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

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DOI:

10.3791/53877

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2016年3月12日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を分離する方法、目的の細胞を濃縮する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムでゼブラフィッシュ細胞を捕捉する方法、および単一細胞からの遺伝子発現を評価する方法を説明しています。

要約

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、脊椎動物の発達を研究するための強力なモデル生物です。ゼブラフィッシュの胚発生の多くの側面が形態学的レベルで説明されていますが、生物の発達に伴って起こる細胞変化の分子基盤についてはほとんど知られていません。近年のマイクロ流体工学とマルチプレックス技術の進歩により、単一細胞での遺伝子発現を特徴付けることが可能になりました。これにより、特定の細胞集団の個々の細胞間の不均一性を調査して、細胞サブタイプを特定および分類し、細胞分化中に発生する中間状態を特徴付け、刺激に対する細胞の異なる応答を探索できます。この研究では、ハイスループットマルチプレックスアッセイのために、ゼブラフィッシュの胚から生存可能な単一細胞を単離するプロトコルについて説明しています。この方法は、蛍光マーカーを持つ任意のゼブラフィッシュ胚細胞タイプに迅速に適用できます。この方法の拡張は、ハイスループットシーケンシング技術と組み合わせて使用 し、単一細胞のトランスクリプトームを完全に特徴付けるためにも使用できます。原理の証明として、心分化マーカーの相対存在量を、nkx2.5陽性の心前駆細胞に由来する単離された単一細胞で評価しました。このデータは、単一細胞レベルおよび単一時点での遺伝子発現の評価により、心前駆細胞が分化した子孫と共存するモデルを支持しています。ここで説明する方法とワークフローは、ゼブラフィッシュの研究コミュニティに広く適用でき、標識されたトランスジェニック魚種とマイクロ流体技術へのアクセスのみが必要です。

概要

細胞及び分子生物学の最新の研究は、母集団平均に基づいています。マイナー集団は生物学的プロセスおよび疾患の結果で主要な役割を再生することができますので、重要な生物学的事象は、これらの伝統的な集団ベースの分析によってマスクすることができます。関連する生物学的および臨床的洞察1,2につながる（たと）単一細胞レベルでの不均一な集団における遺伝子発現をすることができます理解します。胚発生の研究に懸念されるのは、細胞の大きな集団において、前駆細胞は、それが困難な、最終的に細胞の運命の決定3を開始し 、遺伝子発現の微妙な変化を検出すること、しばしば過小評価されています。同様に、単一の細胞型は、微小環境4に対応して異なる発現プロファイルを有することができます。たとえば、同じ器官または異なる器官内に常駐内皮細胞（ 例えば 、大動脈または腎臓）は、共通のmorpを共有するにもかかわらず、有意な異質性を示しますhologicalおよび機能的特徴5。また、同じ腫瘍を移植癌細胞は、単一細胞レベルでの6分子プロフィールまたは突然変異を変化させることができます。

モデル系では、単一細胞におけるトランスクリプトが正常に、新しい細胞集団を同定し、細胞分化の間に生じる中間状態を特徴づけ、そして7,8,9を刺激するために、差動細胞応答を明らかにしました。このような洞察は、従来の集団ベースの研究でマスクされていたであろう。ゼブラフィッシュの胚は、単一の細胞の不均一や開発中の細胞のアイデンティティの分子調節の質問を探索するための幹細胞、前駆細胞、および分化する細胞の途方もなく過小利用源です。彼らの非常にステレオタイプ、ex vivoでの開発や遺伝子操作の容易さは、それらのこのアプローチ10,11のための優れたモデル系にします。具体的には、単一のセル世代の解釈に大きな制限Eの発現データは、開発中の新規な中間体セル状態の信頼性の識別は、組織収集9の非常に慎重にタイミングを必要とすることです。これは、捕捉された細胞との間の不均一性は、年齢依存性細胞分化によって提示される遺伝子発現における単一の時点で組織内の不均一ではなく、不均一性を表していることを保証する必要があります。マウスと比較して、ゼブラフィッシュ胚発生を正確に胚12の多数にわたって同期させることができます。さらに、大規模なクラッチサイズで、ゼブラフィッシュの胚は、幹細胞および前駆細胞の豊富な供給源として使用することができます。

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚からの細胞を単離し、市販の集積マイクロ流体回路のqRT-PCR遺伝子発現解析のために（IFC）チップとオートプレップシステムを用いて単一細胞を捕捉する方法を記載します。このプロトコルは、全体を含む任意の高スループット多重アッセイに急速に譲渡することができます細胞異質13のより包括的な分析を可能にするトランスクリプトーム配列決定。また、伝統的な遺伝子発現アッセイにいくつかの利点を提供しています。単一細胞単離プロトコールは、下流アプリケーションに含まれている妥協細胞の割合を減少さFACS、後に高い生存率をもたらします。 IFCを使用することにより、捕捉された細胞を直接捕捉率を評価し、形態学的細胞の健康を評価するために観察することができます。また、このプロトコルは、マイクロ流体細胞捕捉技術にのみラベルされたトランスジェニック魚のラインとのアクセスを必要とする、ゼブラフィッシュ研究コミュニティに広く適用可能です。

原理の証明として、心臓前駆細胞に由来する単一の細胞を単離し、IFCチップ上に捕捉し、次いで心臓分化マーカーの相対的存在量は、定量RT-PCRにより測定しました。単一細胞レベルでの遺伝子発現解析は、心臓前駆体が自分のdiffereと共存することを実証しますntiating子孫。心臓前駆体の単一細胞プロファイリングから得られた知見は、伝統的な集団ベースの解析でマスクされている可能性があり、脊椎動物の発生時に心臓前駆細胞間の遺伝子発現パターンの不均一性、に光を当てることがあります。

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プロトコル

このプロトコルは、胚を生成するために、ライブ、大人のゼブラフィッシュを使用する必要があります。胚は組織収集のために回収されています。この実験を行うために、適切な倫理審査委員会の承認を得ることが不可欠です。

1.段階的な胚を入手

  1. 実験の前日には、繁殖のための健康、大人のゼブラフィッシュを準備します。 1雄と繁殖タンク内の明確な分周器の反対側に一人の女性を配置します。
  2. 下流側のアプリケーションのための十分な胚の生産のために必要な数の繁殖タンクのための1.1を繰り返します。野生型の魚と目的の細胞型に蛍光タ​​ンパク質を発現するトランスジェニック魚の両方から胚を入手します。
    注：ステップ2-8の下流のアプリケーションに必要な胚の数は、関心のある時点で目的の細胞の相対的な量に依存します。これは、細胞の種類によって異なる場合がありますが、200胚は2,000〜5,000ソートされた細胞を生成するとき、C関心のellsは<24 HPF（時間受精後）における全細胞の1.0％を表します。
  3. 翌朝には、新鮮な繁殖タンクに魚を転送することにより、パン粉タンク内の水を変更し、仕切りを取り外します。繁殖を奨励する角度でタンクを傾けます。
  4. 段階的な胚を収集します。
    1. 15分ごとに、新鮮な繁殖タンクに大人を転送し、茶こしを通して残された卵を渡すことによって、胚を集めます。
      注：同等の密度と温度に維持するときゼブラフィッシュの胚は、同期の開発します。
    2. （1 L二重蒸留水に0.21グラム/ Lインスタントオーシャン塩）卵水と卵をすすぎ、ペトリ皿に移します。空気循環と28.5℃の高温多湿インキュベーターにシャーレを転送します。
  5. 二時間最後の収集後、ソート10センチメートルペトリ皿に、多細胞胚を受精し、皿当たり50の胚に密度を低減。シングル、15から胚を選択下流側のアプリケーションのためのコレクションの分の時間ウィンドウ。 28.5℃で胚を培養します。
    注：たとえば、午前8時30分、8時45、午前9時00分、午前9時15分、午前9時30分、9時45分、午前10時と10時15分AMに胚を収集します。受精胚の最大数は9時で収集クラッチからのものである場合、時間ポイント間で比較すると、その後、下流のアプリケーションのためにのみこれらの胚を使用しています。

2.単一細胞解離のための設定します

  1. 前関心（18 HPF）の時点まで約30分、微細な鉗子を使用して手動で自分の絨毛膜から胚を削除します。
  2. 収集し、各条件について、次のラベル：2 2ミリリットルのマイクロチューブ、140μmのセルストレーナー、1 35ミリメートルの細胞培養皿、および35μmのセルストレーナーをトッピング2 FACSチューブを。
  3. 氷上で以下の試薬を冷やす：卵、水は1L蒸留水に0.21グラム/ Lインスタントオーシャン塩を含みます。 55のNaCl、1.8mMのKClと1.25 mMの炭酸水素ナトリウムを含有する緩衝液を脱yolking;そしてFACS緩衝液を、5％熱不活化ウシ胎児血清を補充したリーボビッツのL-15培地を含みます。
  4. RTに細胞解離試薬1のサンプルあたり1ミリリットルを持参してください。氷上でサンプル当たり1ミリリットルの細胞解離試薬2を解凍します。使用直前に室温に持参してください。

3.単一細胞解離

  1. 広口ガラスピペットを用いて、卵の水の最小容量で2ミリリットルマイクロ遠心チューブに100から300の胚を移します。
  2. 1ミリリットルの氷冷卵水と水を交換し、20分間氷上でチューブを沈めることによって胚を安楽死させます。
    注意！（二次安楽死などの細胞解離に続いて氷上で冷却）この安楽死法のための適切な制度上の動物のケア監督委員会の承認を得ることが重要です。標準的な安楽死は、典型的には冷蔵された後の胚<3日後に受精が生細胞を得るために適切ではないである、漂白されていること。必要で
  3. 1ミリリットルの氷冷卵水で胚を2回洗浄します。洗浄するために、卵水と卵の水を追加するにはP1000を削除するには、広口ガラスピペットを使用しています。
  4. P1000チップで8-12回1ミリリットルDeyolking Bufferで胚の水を交換し、粉砕することにより、卵黄を削除するか、または卵黄が溶解し、されるまで、胚の唯一の体が表示されます。
  5. 1分間300×gで遠心分離することによって組織を収集します。優しく組織ペレットを中断することなく、上清を除去するために、ピペットを使用してください。 1ミリリットル卵水に再懸濁します。
  6. 繰り返し合計3回の洗浄のためのステップ3.5が、最終的な洗浄に、1ミリリットルRTの細胞解離試薬1中に再懸濁します。
  7. 水平に置い管を室温で10分間、細胞解離試薬1でインキュベートします。すべての2-3分、軽く凝集を防止するために、P1000ピペットで粉砕します。
    注：摩砕工程中に静かにサンプルを処理します。いつか、単一の大きな塊は、胚体のもつれからチューブ内に形成することになります。この意志穏やかな粉砕により支援追加の消化を分散させます。 VORTEXしないでください。
  8. 3分間300×gで遠心分離することによって組織を収集します。 1ミリリットルの細胞解離試薬2に上清および再懸濁を削除します。
  9. RTで5-15分間インキュベートします。水平にチューブを入れます。すべての2-3分は、静かに凝集を防止するために粉砕します。 5分毎に、消化の進捗状況を評価します。
    1. 消化の進行状況を評価するために、18μlのFACS緩衝液および細胞培養皿上に液滴としてピペット内に2μlの上清を希釈。
    2. サンプルの上にカバースリップを置き、10Xと20X倍率で組織培養顕微鏡下で観察します。
      注：準備は単一細胞、小さなクラスター、大規模なクラスタ、および臨時のほとんどが無傷胚体のミックスとして表示されます。
    3. 視覚的に単一細胞と小さなクラスターである準備の割合を評価します。
      注：過剰消化の生存率が低下します。下消化単一細胞収量が減少します。
  10. 5分間、300×gの遠心分離によって細胞調製物を収集します。上清を捨て、冷たいFACS緩衝液1ml中に再懸濁します。
  11. FACS緩衝液で40μmのセルストレーナーを湿ら。 35mmの細胞培養皿上に40μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡します。バッファをソートする1​​ミリリットルのFACSを用いて細胞ストレーナー1時間を洗ってください。
  12. 2ミリリットルのマイクロチューブにフロースルーを転送します。 5分間、300×gの遠心分離により細胞を回収し、100μlのFACS緩衝液に再懸濁します。
  13. 血球計数器を用いて細胞収量をカウントします。また、5×10 6ミリリットルあたりの細胞、または選択のFACSマシンの推奨される最適な濃度にサンプルを希釈します。血球計数器で細胞収率をカウントすると、オプションの-、トリパンブルーで対比染色死んだ細胞は、FACS選別の前に細胞調製の生存を確認しました。
    注：あまりにも希薄されている準備がソートするために時間を過剰になります。あまりにcは準備oncentrated多量体に凝集する傾向があり、純粋な集団をソートするための次善のです。
  14. 無染色のコントロールとして使用するには、各サンプルの準備百分の10から20まで。各試料中に蛍光（L / D）デッド/ライブ判別色素を添加することにより、残りのサンプル、汚れ死んだ細胞について。洗浄しないでください。
    注：核酸は、L / Dの染料として使用することができる損なわれた細胞膜や汚れを細胞に浸透する任意の蛍光染料は、蛍光スペクトルは、対象の選択及びフルオロフォア標識細胞のFACS機器と互換性があることを条件とします。
    1. いくつかの細胞は、FACS精製に輸送中に死んでしまうと、ソートされた集団から除外されるべきである色素を添加した後の準備を洗浄しないでください。
  15. 20μlのFACS緩衝液でFACSチューブキャップさ35μmのセルストレーナーを湿ら。ストレーナーにセルを追加し、重力によって収集します。氷の上に保管してください。

4. FACS濃縮

  1. 単一のために豊かにするために、FACSを使用して、、蛍光マーカーを発現する細胞が住んでいます。
    1. 側方散乱振幅（SSC-A）、リニアスケーリングで両方の振幅対前方散乱（FSC-A）の散布図に破片から細胞を区別するためにゲートを設定します。
      注意！ゼブラフィッシュ細胞は、典型的にはマウスまたはヒト細胞よりも小さいです。これは、細胞および破片間の低い基底の分離に反映されています。
    2. 4.1.1で設定されたゲートからは、単一の細胞を濃縮し、前方散乱の高さ（FSC-H）とロー側方散乱の高さ（SSC-H）の散布図を使用して多量体、リニアスケーリングとの両方を除外するためにゲートを設定します。
      注：不相応に高いFSC-Hと低SSC-Hを有する細胞は、おそらく多量体であり、ソートの対象から除外されています。
    3. 4.1.2におけるゲートセットから、単一のカラーコントロールを使用して、チャネルのリニアスケーリングおよび振幅でFSA-Aの散布図を使用している唯一の生きた細胞が含まれるようにゲートを設定するには、対数スケールでのL / Dの汚れを検出するために使用されます。 L / D陰性細胞が含まれます。
    4. からゲートは、単一色のコントロールを使用して、4.1.3に設定されたログスケールで蛍光タンパク質の細胞マーカーを検出するために使用されるチャネルの線形スケーリングおよび振幅FSA-Aの散布図を使用して正の蛍光を有する唯一の生細胞を含むようにゲートを設定します。陽性細胞が含まれます。
    5. 必要に応じて、L / D染色および蛍光タンパク質のスペクトル間の干渉を考慮して、任意の補償制御を設定します。
  2. ステップ4.1で設定されたゲートのすべてに該当した細胞にソートロジックを設定します。
    1. 二重標識された細胞を用いて、細胞選別のためのゲーティングを確認してください。
      注：ソート用の細胞は、細胞よりもむしろ破片、むしろ多量体よりも、単一細胞、L / D負および蛍光陽性細胞となります。
  3. 氷上でマイクロ遠心チューブ内の冷たいFACSバッファーを5μlへの関心の人口からソート2,000〜4,000細胞。セルのために可能な限り最低の圧力を使用して、並べ替えの際に細胞上のせん断ひずみを最小限に抑えるために、ソーター。
    注：FACSバッファー5μlの滴はFACS装置を出た細胞のためのクッションとして機能します。直接FACSバッファに2,000〜4,000細胞を収集することはIFCチップ上にロードする前に遠心分離する必要がなくなります。細胞はペレットに互いに接着した場合、遠心分離は、多量体の形成につながることができますので、この戦略が推奨されます。
  4. ポストソート生存率分析を評価します。
    1. L / D染色の千希釈：転送1μlをバッファと1を並べ替え100μlのFACS新鮮なFACSチューブに細胞を選別しました。ステップ4.1でのゲーティング戦略にFACSソーターを介して細胞を渡します。ソートされた細胞の生存率を推定するための正にL / Dの負の割合を使用してください。

マイクロフルイディクスチップ上に5.ロードセル

  1. 血球計数器を使用して、ソートされた細胞の濃度とサイズの両方を測定します。
    1. 少なくとも10μlにソートされた細胞を希釈します。 5μのアリコートを希釈; 5μlのトリパンブルーとL細胞。血球計数器上にロードし、カバースリップを適用します。
    2. 血球計数器の4×4のグリッド内のすべてのセルの明視野画像を収集します。生細胞の数をカウントし、生細胞/ mlを計算します。生細胞は、トリパンブルーを取るこ​​とはありません。
      注：すべての生細胞の直径を測定するために、任意の標準的な画像解析ソフトウェアを使用してください。細胞の大きさの平均値と標準偏差を計算し、目的の細胞サイズの範囲に適したIFCプレートを選択します。セルサイズ範囲は、IFCプレートセルサイズ範囲にまたがっている場合、関心対象の細胞の全範囲を捕捉するために複数のプレートを使用します。
  2. IFCプレートへのロードセル製造業者の指示に従って（材料を参照されたいです）。
    1. 1×10 6細胞/ mlに細胞を希釈し、製造業者の説明書に従って浮力の最適化を行います。
      注：浮力の最適化は、細胞が底に沈むことも、ローディングWELのトップにフロートもないことを保証しますIFCのチップに最適なロード用リットル。細胞へのバッファの割合は、細胞型によって異なりますが、一般的に6の範囲にあることがあります。4-7：細胞の3：バッファ。
    2. 下塗りされた-IFCプレートに細胞を追加します。ロード互換性流体工学のマシンにプレート、およびマイクロ流体回路を介して、キャプチャレーンに細胞をプッシュするセルロード・スクリプトを実行します。
  3. 細胞はIFCプレート上の捕捉部位に留まっていることを確認してください。
    1. 流体工学マシンからIFCプレートを取り外します。プレートアダプターを備えた顕微鏡でIFCプレートをマウントします。
    2. 10X倍率で各捕捉部位のための明視野および蛍光のスナップショットを収集します。
      注：明捕捉時間は、ランプの強度に応じて、10〜50ミリ秒の範囲であってもよいです。蛍光捕捉時間は、フルオロフォアの明るさに応じて、250〜750ミリ秒の範囲であってもよいです。光損傷を防ぐために、細胞をover​​exposing避けてください。

6. cDNA合成

  1. Iに従ってin situで細胞溶解を行いますFCプレートの製造元の指示。
    1. IFCプレート上のウェルに溶解緩衝液を追加します。ロードプレート互換性流体工学のマシンにあたり、メーカーの指示通り細胞溶解スクリプトを実行します。
  2. IFCプレートの製造元の指示に従って逆転写を行ってください。
    1. IFC板に逆転写試薬を追加します。互換性のある流体のマシンにロードプレート。逆転写スクリプトを実行します。サンプルサイクリング条件：5分間85℃を1サイクル、10分間25°Cで1サイクル、1時間、42℃で1サイクル。
  3. IFCプレートの製造元の指示に従って、遺伝子特異的プローブを用いてプレ増幅を行います。
    注：低コピー数とのより高い特異性のため、インターカレーター色素での使用に最適化された蛍光性標識プローブではなく、プローブを使用しています。
    1. プールのプライマーと最終180 nMのそれぞれに希釈します。 IFCプレートにプールされたプライマーを追加します。互換性のfluidiにロードプレートCS機。プリアンプスクリプトを実行します。
  4. 以下のサイクル条件で予備増幅を行う：1サイクル、95℃で10分間、次いで18サイクルを4分間60℃で、15秒間、95℃でのアニーリングおよび伸長を変性して。ストアは、収穫まで4℃でのcDNAを予備増幅しました。メーカーの指示および使用するまで-20℃で保存によるマイクロ流体プレートから収穫するcDNA。

シングルターゲット定量RT-PCRのための単一細胞から7. [cDNAを

  1. 製造者の指示に従って25μlの希釈剤中のcDNAを希釈します。
    注：おおよその最終収率は、セル当たりプレ増幅したcDNAの28μlです。定量RT-PCRで無鋳型対照として使用するための希釈剤の一定量を確保。
    1. 明視野とステップ5.3.2に記録蛍光画像を参照すると、各捕捉部位をスコア。手動でカウントし、細胞数を記録。各セルはインフルエンザであるかどうかを評価し、記録しますorescent。
      注：個々のサイトは、> 1のセルが複数のセルおよび/または識別不能な破片を含む捕捉部位を含む0,1、または> 1細胞を含有してもよいです。画像が十分な品質である場合、画素値はまた、蛍光シグナルの強度を定量化するために割り当てられてもよいです。
  2. 定量RT-PCR分析のためのサンプルを選択します。
    1. 正の蛍光を有する正確な1セルが含まれているステップ7.2で識別された捕捉部位からcDNAサンプルを選択します。各サンプルからのcDNAのプール1μlのアリコート。
      注：これは、目的の遺伝子が選択された細胞のいずれかにおいて発現されるかどうかを決定するために使用される「プール」陽性対照です。
    2. ネガティブコントロールとして正確に0細胞を含む少なくとも1つの捕捉部位からcDNAを選択します。無鋳型対照としてステップ7.1.2からの希釈剤を使用してください。
  3. 定量RT-PCRアッセイを実行します。
    1. ステップ6.4.1でプレ増幅のために使用されるプローブのみを使用してください。 triplicat内のすべてのサンプルをロードします電子。 384ウェルプレートに10μlの反応のためのサイクリング条件：10分間の1サイクル、50℃2分、1サイクル、95℃、1 60℃でのアニーリングおよび伸長後、95℃15秒で変性と40サイクル分。

8.データ解析

  1. 標準的なゲル電気泳動によって定量RT-PCR産物を検証します。製品を確認して予想される分子量（各プローブごとに異なる​​）で単一バンドです。
    注：プローブは不適切なサイズで複数のバンドまたは単一バンドを生成した場合、特異性は疑問であり、これは解析から遺伝子を除外します。
  2. 異常14のすべての増幅曲線とアカウントを確認します。各サンプル/遺伝子の組み合わせ15の平均CT値を計算します。
    注：ポジティブコントロールのCT値は、一般的に10から30の範囲です。ネガティブコントロールのCT値は、典型的には35〜40（増幅なし）の範囲です。 CT値は、30から35は、非常に低い発現と考えられていますそして、注意14と解釈されるべきです。
  3. レポートデータ
    1. サンプルはCT = 10から30に落ちた場合、データはまた、対照試料と比較し転写産物量の変化倍率として報告されることがあります。
      注：（ - ΔΔCT）の変化を折るは2 ^等しいΔCTは、ハウスキーピング遺伝子からのサンプルの平均CTを減算することにより、ハウスキーピング遺伝子に対して相対的であるとΔΔCTは、サンプルおよび陽性対照15との間の ΔCTの違いです。

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結果

原理の証明として、遺伝子発現は、心臓の開発中分化の動態を調査するために評価しました。ゼブラフィッシュでは、心臓前駆体は、彼らが線形心管を形成するために融合し、前方側板中胚葉に移動する細胞の中胚葉集団から生じます。融合の前に、心臓前駆体は、心臓前駆体16,17の最も初期の特異的なマーカーであると考えられる転写因子nkx2.5（NK2ホメオボックス5）、発現し始めます。ここでは、先に述べたBACトランスジェニック魚のTg（nkx2.5：ZsYellow）18、nkx2.5 を略記：ZsYは 18体節期、18時間後に受精（HPF）12で単一細胞における心臓分化マーカーを調べました。これはZsYellow信号が視覚的に検出した最も早い時点でした。以前にこのトランスジェニック系統のために説明したように、ZsYellowは、私たちのように、心臓前駆体を標識28 HPF 19における咽頭弓の内...

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ディスカッション

本明細書に記載される方法は、単一の心臓遺伝子のサブセットの発現を評価するために、マイクロ流体アシスト単一細胞捕捉システムで使用するためのゼブラフィッシュ胚からの心臓前駆細胞の集団を濃縮するために細胞型特異的プロモーターの制御下で蛍光タンパク質の発現を使用して細胞。 FACSレーザ励起と発光の機能が選択されたフルオロフォア（複数可）と適合することを、この方法は、任意の蛍光レポーターラインのために使用することができます。多くのゼブラフィッシュのレポーターラインがすでに存在しており、新たなレポーターを保有するトランスジェニック魚はわずか3ヶ月で生成することができます。また、このワークフローは、単一細胞RNA配列決定のための全トランスクリプトームからcDNAを生成するように適合されてもよいです。これを行うには、ステップ5-7 RNA配列決定に適したライブラリーを作製するためのcDNAを調製するために最適化された化学反応で使用するためにわずかに修正する必要があります。しかし、人口の異質性を検証することをお勧めしますハイスループットシークエンシングアプリケーションを追求する前に、ここで説明した方法を使用して。

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

魚類資源について、Dr. C. Geoffrey Burnsに感謝します。著者らは、このプロジェクトを可能にするリソースを提供してくれたUNC Flow Cytometry Core Facility、UNC-CGIBD AACコア、および動物ケアのためのZAC施設に感謝しています。L.S.はNIH T32 grant HL069768-13(PI, Nobuyo Maeda)の支援を受けています。N.F.は、NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081の支援を受けています。本研究は、NIH P30DK034987助成金(UNC Advanced Analytics Coreへ)、American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010、Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13(Qian博士へ)、NIH R00 HL109079助成金(Liu博士へ)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Supplies
Dumont #5 鉗子ファイン サイエンス ツール11254-20胚から絨毛膜を除去するため
微量遠心チューブ 2 mlGeneMateC-3261-1
40 um 細胞ストレーナーバイオベーシックSP104151
35 mm 培養皿ファルコン351008
35 umセルストレーナーFalcon352235
P1000とヒントRainin17005089
P20とヒントRainin17005091
IFCチップメーカーのプロトコルFluidigm100-6117バージョン100-6117 E1をトッピングしたFACSチューブは、代表的な実験で使用されました
ボアパスチュアガラスピペット胚の移植
成体野生型ゼブラフィッシュN/AABラインを使用しました
成体トランスジェニックゼブラフィッシュN/ATg(nkx2.5:ZsYellow)
NameCompanyカタログ番号Comments
Reagents for cell dissociation
double蒸留水N/A
の即刻の海洋の海塩即刻の海洋SS15-10
NaClFisherScientificS271-3水で在庫を作り、de-yolking緩衝液のために使用
KClシグマAldrichP5405水で株を作り、de-yolking緩衝液
NaHCO3シグマのための使用AldrichS6014水でストックを作り、脱卵バッファーに使用
Leibovitz's L-15Gibco21083-027
FBSFisherScientific03-600-511熱不活性化; FBSのどのブランドも罰金でなければなりません
細胞解離試薬 1 -TrypLELife Technologies12605-010室温で保存してください。
細胞解離試薬 2 - FACSmaxGenlantisT200100Store -20; 氷上で解凍し、使用前に室温に戻してください
プロナーゼ (オプション)シグマP5147
L/D 色素 - Sytox BlueLife TechnologiesS34857フローサイトメトリーに適した任意の生/死染色が機能します
トリパンブルーGibco15250-061
名前会社カタログ番号strong><コメント
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probesプローブは実験によって異なります
TaqMan Probe ef1aLife TechnologiesDr03432748_m1
TaqMan Probe gata4Life TechnologiesDr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5Life TechnologiesDr03074126_m1
TaqMan Probe myl7Life TechnologiesDr03105700_m1
TaqMan Probe vmhcLife TechnologiesDr03431136_m1
TaqMan Probe isl1Life TechnologiesDr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master MixLife Technologies4369016
IFC メーカーのプロトコール
C1 試薬キットFluidigm100-5319IFC プレートに細胞をロードするための試薬
Ambion Single Cell-to-CTTMLife Technologies4458237逆転写および前増幅ステップ用の試薬
PreAmp (5-10 um)のための
のための名前Companyカタログ番号コメント
C1 AutoPrep MachineFluidigm100-5477IFCプレート用
血球計算盤 シグマ・アルドリッチZ359629細胞のカウントと細胞サイズの評価用
解剖顕微鏡絨毛膜からの胚の除去用
組織培養顕微鏡シングルセル消化の評価用
FACSマシン目的の細胞を単離するため
ワイドVWR14673-010 ははに記載されている試薬分子生物学の質の水コーニング46-000CM C1 IFCのFluidigm 100-5757小さい細胞strong>Equipment

参考文献

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