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方法論記事

大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換

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DOI:

10.3791/53880

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2016年3月18日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

この記事について

サマリー

ここでは、成体の皮膚線維芽細胞をインスリン分泌細胞に変換する新しい方法が紹介されています。この技術はエピジェネティックな変換に基づいており、レトロウイルスベクターの使用や安定した多能性状態の獲得を伴いません。したがって、トランスレーショナルメディシンの応用に非常に有望です。

要約

再生医療は、変性または損傷した組織を修復するために、患者に届けられる新しい完全に機能する細胞を必要とします。そのような細胞が容易に利用できない場合、それらは、多くの中で、リプログラミングおよび分化転換を含む異なるアプローチを用いて得ることができ、異なる技術に特有の利点および制限を有する。ここでは、成体成熟線維芽細胞をインスリン分泌細胞に変換するための新しい戦略(エピジェネティックな変換細胞(EpiCC)として任意に指定されています)について説明します。この方法は、細胞の運命と分化のエピジェネティックな制御を制御するメカニズムの理解が深まっていることに基づいて開発されました。特に、最初のステップでは、エピジェネティックな修飾因子、すなわち5-アザ-シチジンを使用して、成体細胞を「非常に寛容な」状態に追い込みます。次に、このエピジェネティックな可塑性の短く可逆的な窓を利用して、細胞を別の系統に再アドレス化します。このアプローチは「エピジェネティックな細胞変換」と呼ばれています。これは、効率的で制御された安定した細胞系間スイッチを得るためのシンプルで堅牢な方法です。このプロトコルは遺伝子トランスフェクションの使用を伴わず、ウイルスベクターを含まず、安定した多能性状態を伴わないため、トランスレーショナルメディシンのアプリケーションとして非常に有望です。

概要

再生医療の基本的な目的は、修理または損傷置き換えるために使用することができる新しい機能細胞の生成は、組織を縮退します。別の細胞型からそれらを変換することによって、新しいものに容易に利用可能な成体細胞をリメイク、必要な細胞集団が豊富なまたはアクセスすることは困難ではない場合は特に、特に魅力的なアプローチです。しかし、成体細胞が著しく安定しています。彼らは成熟した端末専門に達すると、彼らは安定して1を保持し 、そのオプションの緩やかな制限を介して自分の分化状態を取得します。

体細胞（IPS）の多能性への再プログラミングを可能にするプロトコルの数が開発されている最後の年では、転写のセットは2,3因子の強制発現によって達成。あるいは、細胞の変換は、単一の4を導入し 、直接系列分化転換することによって得ることができますまたは転写の組み合わせは、5-7因子 。この戦略は、脱分化状態を経て移行を伴うが、特定の転写因子8の高発現を必要としません。

我々は最近、シチジン類似体5-アザシチジン（5-アザCR）、よく特徴付けられたDNAメチル化酵素阻害剤の脱メチル化特性に成体細胞の短時間の暴露に基づいて、変換プロトコルを開発しました。脱メチル化工程は、直ちに必要な端末の表現型を得ることを可能にする特異的な分化プロトコール9-11が続きます。この方法は、異なる系統の細胞への成熟、分化した細胞に変換することができ、ウイルスベクターを使用すると、任意の外因性の転写因子のトランスフェクションの両方を避けるために実質的な利点を有しています。セルの不安定性への安定した多能性状態の取得、及び関連する感受性の増加も避けられます。

ここに提示され、完全に機能するインスリン分泌細胞への成人ヒト皮膚線維芽細胞の変換を可能にする詳細なプロトコール。しかし、種々​​の分化経路に向けてセルをアドレス指定するとき技術は、異なる細胞型に適用され、肯定的な結果を生成したことは注目に値します。さらに、エピジェネティックな変換が成功したアプローチの広い有効性と堅牢性を示唆している（原稿は提出）は、ヒトおよびブタの種9-13ならびに犬で使用されています。

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プロトコル

注：以下で説明するすべての手順は、無菌条件下で層流フードの下で実行する必要があります。その取り扱いを通して37℃に維持されているすべての培養手順は、サーモスタット制御ステージと細胞上で行われていることを確認します。

1.皮膚線維芽細胞の単離

  1. 文化ディッシュ用塗布液を調製
    1. 水（最終濃度0.1％）100mlにブタゼラチンを0.1gを溶解させます。オートクレーブで溶液を滅菌します。
    2. 35ミリメートルペトリ皿に無菌0.1％ブタゼラチンの1.5ミリリットルを追加します。室温でそれらを維持し、コートに2時間待ちます。
      注：ヒト皮膚生検は、前腕の前面の無血管領域に局所麻酔下で切除することによって回収し、使用前に+4℃で2％抗生物質抗真菌溶液を補充したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に格納されています。
  2. 新しいPBSで洗浄生検は2％antibiを補っ耳の抗真菌ソリューション。
  3. 場所の100ミリメートルペトリ皿の中の生検とは、滅菌メスで約2mm 3の断片に切断します。
  4. 断片をメッキする直前に塗布液の過剰分を削除します。
  5. プレコート35ミリメートルペトリ皿に5-6皮膚の断片を配置します。
  6. 線維芽細胞培養培地を調製：77％ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、高グルコース、20％ウシ胎児血清（FBS）、1％L-グルタミン溶液、2％抗生物質抗真菌溶液。
  7. 5％CO 2中で37℃で各フラグメント（断片あたり通常100μl）を、文化、それらの上に繊維芽細胞培地の液滴を追加します。
  8. 24時間後、5％CO 2中37℃で湿ったそれらを保つために断片上で線維芽細胞培養培地500μlを追加します。
  9. 少なくとも一度は48時間ごとにピペットで培地を変更します。
  10. インキュベーションの6日後、慎重に組織片を除去し、それらを捨てます。
    注：6日後、線維芽細胞sが組織片から成長し、細胞単層を形成するために開始することを開始します。
  11. 培地を更新し、線維芽細胞培養培地2mlを追加し、5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞単層培養を続けます。

2.線維芽細胞培養

  1. 37℃での培養線維芽細胞を5％CO 2中で80％コンフルエントになるまで
  2. 継代のために組織培養皿から吸引線維芽細胞培養培地。 4mlのPBSで細胞を3回洗浄し、1％抗生物質抗真菌ソリューションを補いました。
  3. トリプシン-EDTA溶液の薄い層（培地体積の10％）（0.8グラム/ Lのブタトリプシンとは0.2g / L EDTA）を添加し、細胞単層は、組織の下から分離し始めるまで37℃でインキュベート培養皿、細胞を解離します。
  4. トリプシンの作用を中和するために線維芽細胞培養培地の9部を、細胞懸濁液を希釈します。遠心分離は必要ありません。
  5. 新しい培養皿でプレート細胞（と5％CO 2インキュベーター内で37℃でゼラチンアウト）と文化。成長率に応じて、4：2と1：1の間の通路比を保持します。
  6. 細胞は約80％のコンフルエンス、通路それら（通常は週2回）に達したとき。

エピジェネティックな変換のための3線維芽めっき

  1. 細胞培養皿に（1.1で説明したように準備し）0.26ミリリットル/ 0.1％のブタゼラチンのcm 2で追加します。コー​​トに2時間待ちます。
  2. 線維芽細胞をプレーティングする前に塗布液の過剰10月30日分を削除してください。
  3. 培養皿から線維芽細胞培養培地を除去します。 PBSで細胞を3回洗浄し、1％抗生物質抗真菌ソリューションを補いました。
  4. トリプシン-EDTA溶液の薄い層（培地体積の10％）（0.8グラム/ Lのブタトリプシンとは0.2g / L EDTA）を添加し、細胞単層は、組織の下から分離し始めるまで37℃でインキュベート培養皿、細胞を解離します。
  5. fibroblの9部で細胞懸濁液を希釈トリプシンの作用を中和するAST培地。
  6. 室温で顕微鏡下で計数チャンバーを用いて細胞を数えます。 7.8×10 4個の線維芽細胞/ cm 2の細胞濃度を得るために、細胞を再懸濁するために線維芽細胞培養培地の必要量を計算します。これは、使用室の特定のタイプに依存します。
    細胞/μlの=小グリッド×90（増倍率）×希釈あたりの細胞の平均数
  7. 室温で5分間150グラムで遠心し細胞懸濁液。上清を除去し、線維芽細胞培養培地の以前に計算された量で細胞を懸濁します。
  8. 0.1％ゼラチンプレコートディッシュ、5％CO 2インキュベーター中で37℃で24時間培養して上プレート細胞。

脱メチル化剤5-アザCRを使用して4.増加​​細胞の可塑性

  1. 0日目
    1. DMEM高グルコースメディ10ml中5-アザCRの2.44ミリグラムを溶解させることによって、5-アザ - CRストック溶液を調製しますええと。濾過により滅菌します。使用直前に5アザ-CRの株式を準備します。
    2. 線維芽細胞培地（最終濃度1μM）1ml中、5-アザ - CRストック溶液1μlを希釈します。
    3. 、細胞プレーティング（小見出し3.8）24時間後の細胞の可塑性を高めるために、播種された線維芽細胞から培地を除去し、5％CO 2インキュベーター内で37℃で18時間、1μM5-アザCR原液と文化を追加します。
  2. 1日目
    1. 表1に記載されているように、新鮮なヒト多能性（HP）培地を準備します。
    2. 1μM5-アザCRとのインキュベーション後、培地を除去し、5-アザCRが洗い流されることを保証するために、PBSで細胞を3回洗浄します。
    3. 5-アザCR 5％CO 2中で37℃で3時間（回復期間）は、HP培地で線維芽細胞を処理した培養します。
    4. 回復期間の後、培地除去し、PBSで3回洗浄します。
    5. 5-アザCR処理の効率を監視するには、このステップfで確認または形態学的変化の存在は、（結果セクションで詳述します）。細胞は、線維芽細胞の典型的な細長い形態を失い、拡大核と、サイズが小さくなって、円形または楕円形の形状を取得します。
    6. 膵臓分化に進みます。

5.膵臓分化プロトコル

  1. 日1-6
    1. 表2に記載されているように膵臓基礎培地を準備します。
    2. 原液をアクチビン準備：滅菌水の166.6μlの組換えヒトタンパ​​ク質をアクチビン5μgのを溶解します。
    3. 文化5は、アザ- CR 5％CO 2インキュベーター中、37℃で6日間（5.1.2を参照）1μL/ mlのアクチビン原液を補充し、0.26ミリリットル/ cmの膵臓基礎培地の2に線維芽細胞を処理しました。毎日培地に変更します。
  2. 日7-​​8
    1. レチノインACIの50 mgのジメチルスルホキシド（DMSO）16.6 mlで添加することによって、レチノイン酸のストック溶液を調製D。
    2. 膵臓基礎培地の0.26ミリリットル/ cm 2の中の培養細胞/ mlのアクチビン原液（5.1.2を参照）、37℃で2日間、1μL/ mlのレチノイン酸原液（5.2.1を参照）1μlの補足しました5％のCO 2。毎日培地に変更します。
  3. 日9-36
    1. 膵臓基礎培地0.26ミリリットル/ cm 2の中の培養細胞（v / v）のインスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）、2％（v / v）のB27および0.1％（v / v）の組換えヒトFGFは、基本1％を補充しました5％CO 2インキュベーター中、37℃で（のbFGF）原液（ 表1参照）。最初の15日間、毎日培地を変更します。
    2. 以降16日目からは、培養皿の底から切り離すことが集計セルを形成するので、顕微鏡下で、一日おきに培地を更新します。

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結果

皮膚生検からの初代培養の確立
皮膚生検を小片に切断し、ゼラチンプレコート皿に入れました。 6日後、線維芽細胞は組織断片から成長し始め、細胞単層（ 図1A）を形成しました。細胞は、典型的な細長い形状を示したと、期待どおりに、線維芽細胞特異的マーカーであるビメンチン（Vimの、 図1B）のために均一な免疫陽性を示しました。

5-アザ-CRに18時間曝露後の形態学的変化および皮膚線維芽細胞のメチル化パターン
インスリン分泌細胞への線維芽細胞の正常なエピジェネティックな変換を得るために、我々は、5-アザCR、脱メチル化剤を使用して、可塑性を増加させました。ヒト線維芽細胞は、7.8×10 4線維芽細胞/ cm 2の濃度で0.1％ゼラチンを予めコートディッシュ上にプレーティングしました。ワット、細胞を播種した後二十四時間ERE 18...

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ディスカッション

本原稿は、組織特異的な誘導プロトコールに続いて5-アザCR、過渡および短時間の曝露を介して、インスリン産生細胞へのヒト皮膚線維芽細胞の変換を可能にする方法を説明します。このアプローチは、転写因子またはマイクロRNAの強制発現や細胞がより不安定とミス14になりやすいなり安定した多能性状態の取得、なし、中胚葉から内胚葉関連細胞への切り替えを可能にします。

第1のステップでは、細胞の可塑性は、最終分化細胞に一過性、可逆的な寛容状態を誘導する合成エピジェネティックな修飾子のおかげで増加します。具体的には、5-アザCRは、皮膚線維芽細胞の全体的なメチル化の減少を引き起こすために使用されました。 5-アザCR直接メチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、新たに合成されたDNAに新規メチル化を防ぐことが知られています。理由は、その効果の、この分子以前にサイレント遺伝子を再活性化するだけでなく、真核細胞15,16の分化状態を変更するために使用されています。これと一致して、ポスト5アザ- CRの皮膚線維芽細胞は、本実験に用いられる細胞内で可塑...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

この作品は、Carraresi財団と欧州糖尿病財団（EFSD）によって賄われていました。 GPは、ミラノの大学のポスドクフェローシップによってサポートされています。著者は、COSTアクションFA1201 Epiconceptのメンバーである：エピジェネティクスとPericonception環境とコストのアクションBM1308共有は大型動物モデル（サラーム）に進みます。 TALBはCOSTアクションCM1406エピジェネティックなケミカルバイオロジー（EPICHEM）のメンバーです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水SigmaD5652PBS; 細胞洗浄および溶液調製用
抗生物質 抗真菌剤溶液ΣA5955線維芽細胞、HPおよび膵臓培地の成分
100 mm ペトリ皿Sarstedt83.3902線維芽細胞単離用
豚ゼラチンシグマG1890皿コーティング用
ウォーターシグマW3500溶液調製用
35mmシャーSarstedt83.39線維芽細胞単離
用 DMEM、高グルコース、ピルビン酸ライフテクノロジー41966052線維芽細胞培養培地用
胎児ウシ血清ライフサイエンステクノロジー10500064FBS;線維芽細胞およびHP培地の成分
L-グルタミン溶液シグマG7513線維芽細胞、HPおよび膵臓培地の成分
トリプシン-EDTA溶液シグマT3924線維芽細胞解離用
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDSHycor Biomedical87144Cell counting
5-AzacytidineSigmaA23855-aza-CR, for increrase cell線維芽細胞の可塑性
ハムのF-10栄養素ミックスライフテクノロジー31550031HPミディア
ムDMEM、低グルコース、ピルビン酸ライフテクノロジー31885023HPミディア
ノックアウト 血清補充ライフテクノロジー10828028 HPミディア
の成分 MEM非必須アミノ酸溶液ライフテクノロジーズ 11140035HPおよび膵臓基礎培地の成分
2-メルカプトエタノールΣM7522HPおよび膵臓基礎培地の成分
グアノシンSigmaG6264HP培地のヌクレオシドミックスストック
アデノシンSigmaA4036HP培地のヌクレオシドミックスストック HP培地のストック成分
シチジンシグマC4654HP培地のヌクレオシドミックスストック成分
ウリジンシグマU3003HPミディアムのヌクレオシドミックスストック成分
チミジンシグマT1895HPミディアムのヌクレオシドミックスストック成分
Millex-GS 0,22 & micro;mミリポアSLGS033SB溶液の滅菌用
FGF-Basic (AA 1-155) 組換えヒトタンパク質Life TechnologiesPHG0261bFGF;HPおよび膵臓基礎培地ウ
シ血清アルブミンSigmaA3311BSAの成分。膵臓基礎培地の成分
DMEM/F-12ライフテクノロジー11320074膵臓基礎培地用
B-27サプリメント マイナスビタミンAライフテクノロジー12587010膵臓培地の成分
N-2 サプリメントライフテクノロジー17502048膵臓基礎培地の成分
アクチビンA 組換えヒトタンパク質ライフテクノロジーPHG9014膵培地
レチノイン酸SigmaR2625膵臓培地
ジメチルスルホキシドΣD2650DMSO; レチノイン酸ストック調製用
Insulin-Transferrin-SeleniumLife Technologies41400045ITS; 膵剤 最終培地
用 抗ビメンチン抗体 Abcamab8069免疫細胞化学分析用。作業希釈 1:100
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩Sigma32670DAPI.免疫細胞化学分析用。作業希釈率 1 &マイクロ;g/ml
5-メチルシチジンEurogentecMMS-900P-B免疫細胞化学分析用。使用希釈率 1:500
抗Cペプチド抗体 Abcamab14181免疫細胞化学分析用。使用希釈液 1:100
Anti-PDX1 anti-PDX1 antibody Abcamab47267免疫細胞化学分析用。作業希釈率 1:500
Mercodia Insulin ELISAMercodia10-1113-10インスリン放出検出用
レ ムム用 用

参考文献

  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
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