ここでは、フィールド全体でこの技術の標準化を促進するために死亡することなく、再現性の傷害をもたらすマウスにおける腸管虚血再灌流の詳細な手順を説明します。腸管虚血再灌流障害のこのモデルは、損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができます。
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この記事について
サマリー
要約
腸管虚血は、アテローム性動脈硬化症、血栓症、低血圧、壊死性腸炎、腸移植、外傷および慢性炎症などの臨床症状の広い範囲に関連した生命を脅かす状態です。腸管虚血再灌流（IR）傷害は、腸の損傷をもたらす、腸間膜血管を介して不十分な血流によって引き起こされる、急性腸間膜虚血の結果です。再灌流後の虚血は、さらに腸の損傷を悪化させることができます。 IR損傷のメカニズムは複雑であり、十分に理解されています。したがって、実験小動物モデルは、IR傷害の病態生理学及び新規治療法の開発を理解するために重要です。
ここでは、死亡することなく、小腸の再現可能な損傷を与える急性腸IR傷害のマウスモデルを記述しています。これは、時間的にオクルディンによって回腸遠位部の領域における虚血を誘導することによって達成されます。グラム微小血管クリップを使用して、60分間の上腸間膜動脈の末梢と端末側副枝。 1時間の再灌流、または組織学的分析によって調べ腸の再現可能な損傷で傷害の結果の後に2時間。微小血管クリップの適切な位置は、手続きのために重要です。したがって、ビデオクリップは、この技術の詳細な視覚的なステップバイステップの説明を提供します。腸IR傷害のこのモデルは、損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができます。
概要
腸は、虚血及び上皮損傷の原因となる血流の遮断に非常に敏感です。虚血後再灌流は、組織の再酸素化を提供し、さらに病状を促進することができます。したがって、腸管虚血および再灌流傷害は、壊死性腸炎、小腸移植における同種移植片拒絶反応、腹部大動脈瘤手術、心肺バイパス、および炎症性腸疾患1,2の合併症を含む病態の広範な、関連付けられています。腸IR傷害、特に急性腸間膜虚血は、罹患率および死亡率3で 得られた生命を脅かす状態です。
十分に理解するが、腸の虚血再灌流（IR）傷害は、腸内微生物叢ならびに活性酸素種と、炎症性サイトカインおよびケモカイン1,4-6の生産における変化と関連すると考えられています。これは、両方の活性化につながりますネイト炎症および組織損傷の1,7,8を促進適応免疫機構。
彼らは簡単にgain-と機能喪失の遺伝的実験を可能にするように動物モデルは、IR傷害のメカニズムを理解するために重要です。 IRのいくつかの動物モデルは、完全な血管閉塞、低流量虚血を含むが開発、および（最近の包括的なレビュー9にまとめた）血管閉塞をセグメント化されています。上腸間膜動脈（SMA）の完全な血管閉塞によって引き起こされる腸管虚血は、大型動物やげっ歯類9-11のIRの簡単で一般的に使用されるモデルです。....
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プロトコル
動物研究は、健康ガイドラインの国立研究所に従って行われ、動物実験によって承認されたとトルドー研究所の委員会を使用しています。 8-12週齢のC57BL / 6マウスを研究に使用しました。
外科1.準備
- 準備と手術器具を滅菌します。
- ノーズコーン、および加熱パッドでイソフルランベースの麻酔システムを準備します。加熱されたパッドが（<39ºC）を過熱されていないことを確認してください。
- イソフルランガス掃気キャニスターがブロックされたり、任意の方法で閉塞されていないキャニスターの底部に排気口を確保するために正しく配置されていることを確認してください。キャニスター上の手続きや書類の重量の前に掃気キャニスターを計量。キャニスターの重量が累積重量（〜12時間）の50グラムを超えたときにキャニスターを捨てます。
2.麻酔
- 誘導室中の3％イソフルランでマウスを麻酔（1 L /分O 2）。
- 意図的な随意運動、瞬目反射の消失、筋弛緩、および反射刺激（事務所の圧力でつま先や尾ピンチ）に対する応答の損失の直立し、損失を維持することができないことによって麻酔深度を評価します。
- 胸壁と腹部の動きを観察することによって、呼吸速度およびパターンを評価します。最適な麻酔下、呼吸数は、毎分〜55-65呼吸でなければ....
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結果
我々は、マウスにおける回腸の再現性のIR誘導性の傷害を得るために、IR手術の実験プロトコルを最適化しました。代表的な結果は、このセクションで実証されています。
図1は、回腸の虚血を誘導するために、微小血管クリップ位置の例を示しています。黒の矢印は、上腸間膜動脈の一次枝を閉塞メインクリップの位置を示しています。緑の矢印は、側副血管からの血液供給を遮断するための追加のクリップの位置を示しています。クリップの位置とintestinteの虚血領域の色の変化に対して遠位閉塞した血管のサイズの増加に注意してください。虚血血管の端部でクリップを除去した後の血流を回復し、通常のサイズに戻します。
図2は、詐欺から調製されたスイスロールを含む組織カセットの例を示しています再灌流の.......
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ディスカッション
腸IR傷害のマウスモデルの開発は非常に組織損傷のメカニズムの理解を改善し、組織損傷7,9,11,34を最小限にするために潜在的な治療戦略の開発を支援しています。このプロトコルの重要なステップは、微小血管クリップの適切な位置決め、IR傷害の虚血と適切な組織学的評価の正しいタイミングです。
虚血の持続時間は、その後の上皮傷害のために重要です。実験用マウスの罹患率と死亡率なしで再現可能なIR傷害を誘導するのに必要な典型的な時間は2-3時間の再灌流に続いて45-60分です。虚血の延長期間もよい上皮および死亡率の増加の完全な喪失をもたらします。 120分間の閉塞は絨毛上皮35の完全な喪失につながったのに対し、例えば、空腸の虚血のブタモデルでは、60分間の閉塞は、ヴィラ上皮の部分的な喪失をもたらしました。私mportantly、無菌および遺伝子操作したマウスは、IR傷害に対する感受性の増加を表示することができるため、虚血および再灌流の最適な時間は、予備実験で最適化する必要があるかもしれません。再灌流後の組織損傷を評価するための典型的な時間は2~3時間.......
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開示事項
著者は利益相反がないことを宣言します
謝辞
ロシア科学財団によってサポートされていたこの作品は、無許可します。 14-50-00060およびLLC RUSCHEMBIO。この作品は、また、（CJ）は294083（AVTへ）、およびNIH助成金RO1 DK47700によって付与アメリカのCrohn`sと大腸炎財団によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 加熱パッド | サンビーム | E12107-819 | 代替: Braintree Scientific 加熱パッド |
| テーブルトップ研究麻酔器 | Vasco | UCAP 0001-0000171 | 代替: パークランド サイエンティフィック、V3000PS |
| ノーズ コーン | パークランド サイエンティフィック | ARES500 | |
| スカベンジャー キャニスターと交換用カートリッジ | パークランド サイエンティフィック | 80000、80120 | |
| 誘導チャンバーSurgivet | V711802 | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | 規制物質、IACUC |
| アニマルクリッパーに連絡してください | オスター | オスターゴールデンA5 078005-050-003 | |
| 眼科軟膏 | スター | 8804604 | |
| ブプレノルフィン | McKesson | 562766 | 規制物質、IACUC |
| ケタセット(ケタミンHCl) | ファイ | ザーNADA 45-290 | 規制物質、使用 |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Yodine |
| 滅菌生理食塩水 | Aspen | 46066-807-60 | 使用前に室温に調整 |
| IR げっ歯類温度計 | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| マイクロ血管クリップ、70 g | Roboz Surgical | RS5424、RS5435 | 代替品: WPI 14121、SMA 閉塞用 |
| マイクロ血管クリップ、40 g | Roboz Surgical | RS6472 | 代替:WPI 14120、側副血管閉塞用 |
| 鉗子を適用するクリップ | World Precision Instruments | 14189 | 代替:Roboz #RS-5410 または #RS-5440 |
| Gill's 3 ヘマトキシリン | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| 外科用ステープル、反射 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| オートクリップアプライヤー | BecktonDickinson | 427630 | |
| Byopsyフォームパッド | Simport | M476-1 | |
| ッシュカセット | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette IIコンビネーション蓋とベース |
| 10%緩衝ホルマリン | フィッシャーサイエンティフィック | 245-684 | |
| 用虹彩はさみ | ワールドプレシジョンインスツルメン | ツ501263-G SC | 代替:Roboz RS6816 |
| 手術用ハサミ | World Precision Instruments | 501219-G | 代替品: Roboz RS6814 |
| ドレッシング鉗子 | Roboz Surgical | RS-5228、RS-8122 | 代替: World Precision Instruments 1519-G |
| ヘパリン、エンドトキシンフリー、300 USP ユニット/バイアル、50 mg | シグマ | 2106 | |
| 反射創傷クリップ鉗子除去 | Roboz Surgical | RS-9263 | 代替品: World Precision Instruments: 500347 |
| マウス C57BL/6J マウス | ジャクソン研究所 | 在庫番号 0664 | |
| Telfa 非接着性包帯、3 x 4、滅菌 | Coviden | 1050 | |
| フィッシャーブランド トランスファーピペット | フィッシャー サイエンティフィック | 13-711-5AM | ピペットを使用して生理食塩水を滴下します |
参考文献
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
- Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. <....
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再版と許可
