方法論記事

エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

9.8K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/53883

⸱

2016年2月2日

 , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 3Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 4Genome and Systems Biology Degree Program, National Taiwan University and Academia Sinica

この記事について

サマリー

アブラムシの胚に対する全量免疫染色のプロトコルが提示され、バックグラウンド染色の減少と組織透過性の増加のための重要な条件が対処されます。これらの条件は、アブラムシの胚組織におけるタンパク質発現を効果的に検出するために特別に開発されました。

要約

配列決定されたゲノムと豊富な表現型可塑性とエンドウAcyrthosiphonエンドウアブラムシは、ゲノムおよび発達の研究のための新たなモデルとなっています。他のアブラムシ、Aのよう 。 エンドウ胚は卵巣管に組立ライン方式で卵の室内で開発単為生殖胎生再現、を経て急速に伝播します。これまで我々は、アブラムシの胚におけるmRNA発現の検出を可能にするin situハイブリダイゼーションホールマウントの堅牢なプラットフォームを確立しています。タンパク質の発現を分析するために、しかし、満足な結果を生じなかった無性胎生アブラムシのovariolesを免疫染色するためのプロトコルを確立しました。ここでは、組織透過性を増加させ、確立されたアプローチを適用する際に問題があったどちらもバックグラウンド染色を、減少させるための最適化された条件をレポートします。最適化が含まれます：必須のFを発見されたプロテイナーゼK（1 / mlの、10分）、の（1）のインキュベーション中・後期アブラムシ胚または抗体の浸透; （2）ジゴキシゲニン（DIG）により供給されるブロッキング試薬と正常ヤギ血清/ウシ血清アルブミンの交換は、バッファセットと、内因性ペルオキシダーゼを漂白するためにメタノールではなく、過酸化水素（H 2 O 2）、（3）アプリケーションをベース。これはかなりアブラムシ組織におけるバックグラウンド染色を減少させました。免疫染色のために最適化されたこれらの重要な条件は、A。 エンドウ及び他のアブラムシの胚における遺伝子産物の効果的な検出を可能にします。

概要

アブラムシは、小さな（1-10 mm）のソフトボディと半翅目の昆虫です。彼らはピアス口器と師部の樹液を吸引することにより、植物を餌に。さらに、彼らは師部樹液の食事で不足している必須アミノ酸を合成するために、必須の細胞内共生細菌、 ブフネラの aphidicolaに依存しています。アブラムシは、春と夏の長日日長、彼らは越冬卵1,2の数が限られて横たわっている間、短日の光周期によってトリガ性的卵生再生時の単為生殖胎生再生を含んで複雑 ​​な生活史を持っています。春に秋まで単為生殖の多くのラウンドに続いて、すべての女性のアブラムシ（fundatrices）の第一世代を生成するために、これらの卵が孵化。毎年恒例のライフサイクルにおける無性生殖と有性段階の代替アブラムシの周期的単為生殖は、進化のノベルティ1,2と見なされてきました。単為生殖胎生アブラムシで、胚発生は、卵巣細管（ovarioles）の卵の室内で行われます。これとは対照的に、性的卵生の胚は受精卵で開発しています。別に生殖可塑性から、アブラムシは、世代間の翼polyphenismを表示することができます。過密信号と捕食者の脅威に対応して、翼のない無性女性はviviparously長距離移動のための翼の子孫を生成することができます。エンドウヒゲナガアブラムシのゲノム配列の公表Acyrthosiphonエンドウ -theの最初のゲノム配列基礎不完全変態の昆虫ができます生殖可塑性、翼polyphenism、分子のアブラムシで昆虫植物の相互作用、ウイルスベクタとの共生など、他の機能のさらなる調査基礎3。

ゲノム配列決定に加えて、遺伝子発現および機能を特徴づけるためのツールは、成熟したモデル生物として4エンドウアブラムシを促進するために必要とされます。我々は全体のマウントの堅牢なプロトコルを記載していますアブラムシ胚5-7でのmRNAの発現を検出するためのin situハイブリダイゼーション。二本鎖RNAの注入と給電ビアRNA干渉（RNAi）はアブラムシの幼虫及び成虫における遺伝子サイレンシングのために使用されてきたが、胚における遺伝子ノックダウンのための安定した条件がまだ8-10報告されていません。免疫染色、およびRNAiノックダウン後、エンドウアブラムシ胚11-13で行われた前のサンプル中のタンパク質の発現を検出することができる抗体に基づくアプローチ。しかし、組織透過性およびバックグラウンド染色の除去の増加は、エンドウアブラムシの無性胎生胚における免疫染色のための標準プロトコルを使用して、まだ不十分です。たとえば、私たちは、組織への抗体の浸透が（ステージ8-10）胚をgast​​rulatingに減少し、形態学的に識別可能な肢芽（ステージ13〜14）との胚は、抗体にほとんど透過性であることがわかりました。また、バッ​​クグラウンド染色は無性viviparoで可視化されました私たちエンドウアブラムシの胚は、生殖細胞系列マーカーヴァーサだけでなく、胚性セグメント12,13で表現エングレイルド/半円形の波形のタンパク質に対するそのに対する抗体を用いて染色しました。実際にはバックグラウンド染色は、まだ二次抗体のみで染色した胚ではっきりと見えました。

アブラムシ組織の完全性に損傷を与えることなく、透過性を高めるために、我々は慎重にプロテイナーゼKの濃度を滴定し、アブラムシの胚における組織消化のための最適条件を決定しました。エンドウアブラムシに非特異的な染色を避けるために、我々は、効率的に胚をブロックし、免疫染色の間、信号を増幅するために用いられる酵素の内因性のペルオキシダーゼ（POD）の活性を抑制し得る化合物について検索しました。伝統的に使用される通常のヤギ血清ではなく（NGS）、ジゴキシゲニン（DIG）ベースのバッファセットによって提供されるブロッキング試薬/ウシ血清アルブミン（BSA）は、有意にバックグラウンド染色を減少させました。また、メタノールはINHIことが見出されましたより効果的に過酸化水素（H 2 O 2）に比べ、内因性POD活性をビット。胚の免疫染色のためにこれらのアブラムシ、特定の条件に関する詳細は、以下のセクションで説明します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

アブラムシの1.文化

注：単為生殖胎生エンドウアブラムシAの実験室株エンドウは、もともと台湾中部に回収し、300以上の世代のために長日の光周期の下で宿主植物（エンドウのエンドウのマメやソラマメソラマメ ）で飼育されています（一世代：〜10日）。

  1. 種子の発芽
    1. 室温で3〜5日間水道水に宿主植物の種子を浸します。 1日1回、新鮮な水を補充します。
      注：別の方法として、ストレート湿った土壌に宿主植物の種子を置くことだけでなく、発芽を誘導することができます。
    2. 光周期16時間の明/ 20℃で8時間の暗闇の下で成長チャンバー内の土壌を持つ小さなポット（直径9cm×7センチ）で10発芽種子を栽培。
    3. 成長が始まる約10日後に、その高さが8つ以上センチ、植物にアブラムシを移します。
  2. アブラムシの譲渡
    1. 絵筆を使用して植物に8大人のアブラムシ転送、1リットルのガラスビーカー内の植物のそれぞれの鍋を保持し、その後、逃げるのアブラムシを防ぐために、このようなガーゼメッシュなどの通気性のカバーでビーカーをシール。
    2. 20℃での光周期16時間明/ 8時間暗下で成長チャンバー内のアブラムシをインキュベートします。毎日一回植物の各植木鉢に水を。
    3. アブラムシの次の世代を得るために、手順を繰り返す1.1.3-1.2.2 10日の一次アブラムシ転送後。

2.解剖と卵巣の固定

  1. 新たに固定緩衝液として1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製。
  2. PFA（約500μL）と、スポットプレートの1つのウェルを記入し、低倍率での立体顕微鏡下でプレートを配置し、解剖用のPFA内の大人のアブラムシを沈めます。
  3. 背の切開、鉗子の一組で頭と腹部を保持することによって卵巣を解剖腹部のクチクラ、および腹腔から離れて卵巣をドラッグします。
  4. 室温で20分間PFAの1ミリリットルを含む1.5 mlチューブに卵巣の3組を修正しました。
  5. トランスファーピペット（ガラスまたは使い捨てのいずれか）で固定バッファをデカントした後、10分間毎に1×PBS（PBST）中で0.2％トリトンX-100で3回卵巣を洗います。マイルドミキサー/ローテーターに揺れ（回転角：60°（F60）/回転数：8 RPM）は、固定および洗浄の両方をお勧めします。

3.プロテイナーゼK（PK​​）での処置は、胚組織の透過性を高めるために

注：PK処理は、生殖帯域拡張以降（開発段階11）からの胚に適用されます。若い胚の場合、このステップはオプションです。

  1. 直列作業濃度を1μg/ mlから1×PBSでPKのストック溶液（10mg / ml）に希釈します。
  2. 穏やかな振盪しながら10分間、PK（約500μL）を1μg/ mlの卵巣をインキュベートします。
  3. デカントPK solutiそしてその後、グリシン700μlの（2 mg / mlの）5分ごとに、3回と卵巣を洗いに。
  4. 10分ごとに二回、0.2％PBSTで卵巣を洗ってください。
  5. 軽度に振盪しながら室温で15分間固定緩衝液で再び卵巣を修正しました。
  6. 上清を捨て、10分間ずつ二回、0.2％PBSTで卵巣を洗います。

内因性ペルオキシダーゼ（POD）活性を抑制するための4メタノールインキュベーション

注：メタノールのインキュベーションは、メタノールに敏感であるファロイジン染色または抗体エピトープを施した胚には適用されません。

  1. 直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を脱水（3：1：1：1、3：V / V 1）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。
  2. 穏やかな振盪しながら室温で1時間、100％メタノールで卵巣を脱水。
    注：染色の良好な結果がまだで、100％メタノール中に保存したアブラムシの組織から得ることができる-20＃176; C 1ヶ月。
  3. 直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を再水和（1：1：3：1：1 v / v 3）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。

5.抗体染色

  1. 1XのDIGベースのバッファセット（DIG-B）から10倍のブロッキング溶液を希釈します。
    注：1×DIG-Bブロッキング溶液は、5％（v / v）の正常ヤギ血清（NGS）からなる標準的なブロッキング試薬に比べ染色のバックグラウンドを低減し、0.5％（v / v）のウシ血清アルブミンに対してより効果的である（BSA ）0.2％PBSTインチ
  2. 穏やかな振盪しながら4℃でRTまたはO / Nで2.5〜4時間、1X DIG-Bブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。
    注：1.5ミリリットルチューブ内の卵巣の三対のために、200μlのサンプルブロッキングと抗体染色のための最小量です。
  3. 上清を除去し、適切なdilutiで一次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換比に。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。
    注：ここで説明する実験では、一次抗体の次の最適な希釈液を使用します（1）ApVas1抗体：1：発色性染色のための500を、免疫蛍光染色のために1時50分。 （2）抗αチューブリン抗体：1：500; （3）4D9モノクローナル抗体：1：25。
  4. 15分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。
  5. 1X DIG-Bは、穏やかな振盪しながら室温で1時間ブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。
  6. 上清を除去し、適切な希釈率で二次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換してください。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。
    1. 二次抗体の以下の希釈比を使用する：（1）免疫蛍光染色の場合：1：アレクサフルオロ633ヤギ抗ウサギIgGまたはAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGについて500。 （2）発色性染色のために1：ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG 200。
      注：ビオチン化二次抗体を染色シグナルが著しく増幅されるを通して基板ベース（発色）の検出にアビジン - ビオチン複合体（ABC）と対話するために適用されます。
    2. 二次抗体は、光に敏感であるため、免疫蛍光染色のために、暗所で染色を行います。
  7. 10分ごとに0.2％PBSTで4回、二次抗体を洗い流します。

6.核とF-アクチン染色

注：これは、免疫蛍光染色のために適用されます。

  1. 暗所で室温で2時間、DAPI（2 NG /μL）およびファロイジンTRITC（100 nM）を含む0.2％PBSTで染色卵巣。
  2. 10分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。
  3. 穏やかな振盪しながら4℃で封入O / Nで卵巣をインキュベートします。

7.シグナル開発

注：これは、発色性染色のために適用されます。

  1. 100μlの準備試薬アビジン - ビオチン複合体（ABC）、0.2％PBSTの98μlの試薬A（アビジン）の1μLを加え穏やかにピペッティングを経由して十分に混合し、試薬Bを1μlを追加することにより、信号を向上させるための（西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートビオチン）、即座に混合し​​ました。穏やかな振盪しながら室温で30分間混合物をインキュベートします。
  2. 穏やかな振盪しながら室温で30分間、試薬AとBの混合物に（関連付けを解除卵室を含む）の卵巣をインキュベートします。
  3. 10分ごとに0.2％のPBSTで4回試薬A及びBの混合物を洗い流します。
  4. プラスチックスポイトでスポットプレート上のウェルに、PBST中に沈め卵巣を転送します。
  5. 3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）の基質溶液を調製：1 DABタブレットを加え、1分間激しくボルテックスを経由してのddH 2 O 1ml中の尿素過酸化水素を含む別のものを溶解させます。
    注：DAB、ペルオキシダーゼの沈殿させる基板は、免疫染色のために人気の色原体です。これは、BRを生成ペルオキシダーゼによって酸化された後の自分と不溶性の沈殿物。弱い信号は、基質溶液（最終濃度0.05〜0.08％）と塩化ニッケルを添加することによって高めることができます。
  6. ウェル内に残っているPBST溶液を除去し、信号の開発のためのDAB基質溶液100μlを補充します。
  7. 低倍率での実体顕微鏡下で信号の強度を監視します。
  8. すぐに1×PBSで再充填が続くDAB溶液を除去することにより反応を停止します。二回洗浄を繰り返します。
  9. 1.5mlチューブに戻って卵巣を転送した後、15分間ずつ二回、1×PBSまたはPBSTで洗浄します。
  10. 穏やかな振盪しながら4℃でグリセロールベースの​​封入剤（70％グリセロール）、O / Nで卵巣をインキュベートします。

8.アブラムシ胚をマウントします

注：アブラムシ胚の厚さは、開発の段階との間で変化します。マウントの戦略は、このように、中間（ステージ、早期（germariaやステージ0-10）を合わせて変更されています11-18）、および図2Bに示されてい後期胚（ステージ19〜20）、 - D。胚のステージングは、三浦らを追った。12

  1. プラスチックスポイト付きセルトレイにメディアをマウントするとともに卵巣を移し、低倍率でステレオ顕微鏡でサンプルを観察します。
  2. 虫ピンを使用して横方向の卵管に関連する腎杯をカットした後、スポイトでよく空のグラスに分離された卵巣管を転送します。マウンティング培地を用いて50〜100μlに最終容量をアップしてください。
  3. ガラススポイトでスライド上に卵巣管を転送して、虫ピンを使用して卵室を分析。
    注：開発のステージ6よりも古い胚の場合、卵室の分離が提案されています。 germariaとステージ6歳未満の最初の二つの卵室のために、分離はオプションです。
  4. ガラススポイトを使ってきれいなスライドに解剖卵室を再配置します。
  5. カバースリップ（サイズを置く：22×22ゆっくりと泡を避けるために、解剖germariaまたは卵室mm以上）（発達の段階1-10で胚を含みます）。
    1. 片側カバーガラスの橋でスライド上の（開発段階11-18で胚を含む）マウント卵室と他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。
    2. マウント卵室両面カバーガラスの橋でスライドに（開発のステージ19よりも古い胚を含む）および他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。
  6. サンプルの乾燥を避けるために取り付けたメディアとトップカバースリップの下のスペースを埋めます。
  7. 軽度の観察のための正しい方向を得るために、カバースリップをスライドさせて胚をロールバックします。
  8. マニキュアと（ブリッジカバーガラスを含む）カバーガラスのエッジの周りにシール。

9.イメージング解析

  1. compouでホールマウント胚の写真微分干渉コントラスト（DIC）画像NDカメラに接続され、DIC光学系および乾燥系対物レンズ（10X、20X、40X）を備えた顕微鏡。製造元の指示を使用して、カメラとパソコンの画像転送用のソフトウェアをインストールします。
  2. レーザー走査共焦点顕微鏡14と、蛍光標識された胚の投影を取得します。 、Z-スタッキングを撮影し、3Dがイメージングソフトウェアを投影するための製造元の指示に従ってください。
    1. 逆さまにスライドを回して、10倍の対物レンズとマウントされたサンプルを見つけ、細かい油を塗ったベースのペンでサンプル領域を一周。
      注：これは、共焦点顕微鏡の対物レンズを介してそれを検索するときにサンプルが容易に識別することができます。
    2. 反対側9.2.1で説明したようにラベル付けされたカバースリップ領域の上に油の滴を追加します。
  3. 63×油浸対物レンズに変更し、その後40X油浸対物レンズで焦点面を検索します。手動で微細なフォーカス制御を移動して行いますWNは、最良の焦点面をキャプチャします。
    注：germariaと初期胚の構造の詳細を観察するために、我々は40X目的または高倍率のものを使用することをお勧め。
  4. 異なる励起チャンネルで胚をスキャンし、zスタック画像を得ます。
    注：エンドウアブラムシの組織のために、1.5μm以下にまで、各光学部の厚さを薄くします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

本研究では、無性エンドウアブラムシ（ 図1A）の胚のホールマウントの免疫染色を行いました。これらの女性は、単為生殖とviviparously子孫を生産します。これらの女性の胚は、卵巣細管（ovarioles）（ 図1Bおよび図2A）の卵の室内で開発しています。顕微鏡検査の前に、解剖ovariolesは染色標的です。しかし、卵室の分離は、顕微鏡（ - D 図2B）の下で胚を観察するために必要とされます。

組織透過性の増加

プロテイナーゼK（PK）の治療は、組織浸透性を高めるため、いくつかのモデル生物-ような線虫 （線虫）として、 キイロショウジ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

私たちは、エンドウヒゲナガアブラムシAの成功免疫染色するために重要最適な条件を特定した。 エンドウ 、ゲノムおよび発達研究3,15のための新たなモデル生物。組織透過性を増加させ、バックグラウンド染色を低減するための最適化された条件は、信号の強度および特異性を増強しました。それらは、細胞膜の孔を作成して、非特異的抗体結合をブロックするためのステップの他の動物モデルにおける免疫染色のための標準プロトコルとは異なります。

免疫染色のため、およびin situハイブリダイゼーション 、プロテイナーゼK（PK）消化は、組織浸透性16-19を増加させるための一般的な手法の一つです。 （1）PK消化が大幅ものの、胚芽帯域拡張（ステージ11〜14）（ 図3B ''、C ''）中の単為生殖胎生胚における免疫染色シグナルを強化：アブラムシ組織の抗体染色では、我々の結果は、ことを示しました弱い信号は、PK処理（ 図3B、C）<...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

モノクローナル4D9抗体を提供してくださったChau-Ti Ting氏(台湾のFly Core社)、共焦点顕微鏡法を提供してくださったNTU生命科学部のTechnology Commons社(TechComm)、原稿の校正をしてくださったHsiao-Ling Lu氏、撮影を手伝ってくれたChen-yo Chung氏に感謝します。CCは特に、戦略的な提案を提供し、原稿の批判的な編集を行ったCharles E. Cookに感謝します。この研究は、科学技術部(101-2313-B-002-059-MY3および104-2313-B-002-022-MY3(GWLおよびCC用)および国立台湾大学(NTU-CESRP 101R4602D3、GWL用103R4000)の支援を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
30% ペルキシダーゼ水素 (H2O2)Sigma-Aldrich18304胚の内因性ペルオキシダーゼの漂白用。
4フィート6-ジアミジノ-2-フェニル-インドール二塩酸塩 (DAPI)Sigma-AldrichD9542二本鎖DNAの標識用。毒性。手袋を着用し、小さなアリコートに分配し、露出を最小限に抑えるためにフィーズ
4D9 抗エングレイル/インベクトマウスモノクローナル抗体発生研究 ハイブリドーマバンクAB_528224胚の発達中のセグメントをラベリングするため。
ApVas1ウサギポリクローナル抗体私たちの研究室N/A胚中のアブラムシ生殖細胞特異的Vas1タンパク質の標識用。この抗体は当研究室で作製しました。 
Austerlitz 昆虫ピンENTOMORAVIAN/A卵巣から各卵室を分離するため。サイズ000、ブラックエナメル 
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8抗体の非特異的結合を阻害します。
カメラは、アブラムシの胚の撮影のために複合顕微鏡キヤノンEOS 5D
比色8細胞トレイKartell Labware357アブラムシ胚の染色シグナルを発達させます。直径95 x 57 mm、セル深さ2 mm。
DIC光学系複合顕微鏡ライカマイクロシステムズDMRスライドに取り付けられたアブラムシの胚の撮影用。
DIGウォッシュ&ブロックバッファーセットSigma-Aldrich(ロシュ社)11585762001抗体の非特異的結合をブロックします。10x Blocking 溶液を 1x に希釈してブロッキング試薬として使用しました。
鉗子Ideal-tekN/Aアブラムシの卵巣の解剖用。メーカー部品番号5:5 SA. 
ガラススポイトN/A N/Aラムシの卵巣をスプロットプレートからチューブに移すため 全長150mm、先端長5 3/4インチ。
グリセロールSigma-AldrichG5516アブラムシの胚の清澄化とマウント用。
グリシンバイオショップN/AプロテイナーゼK(PK)の酵素活性を阻害します。
ヤギ抗マウスIgG標識Alexa Fluor 488InvitrogenA11017マウスからの一次抗体の検出用。
ヤギ抗ウサギIgG標識Alexa Fluor 633InvitrogenA21072ウサギ由来の一次抗体の検出用。
Intelli mixerELMI実験装置RM-2M試薬と卵巣の反応を改善します。
レーザー走査型共焦点顕微鏡ライカマイクロシステムズSP5florecent tagでスライドに取り付けられたアブラムシの胚の撮影用。
メタノール Burdick and JacksonAH2304胚の内因性ペルオキシダーゼの漂白用。
顕微鏡スライド Thermo scientific10143560胚のマウント用。SUPERFROSTの地面の端、ca。76 x 26 mm。
顕微鏡カバーガラスマリエンフェルド0101030スライドに胚をマウントするため。サイズ 18 x 18 mm 厚さ No.1 (0.13 から 0.16 mm)
顕微鏡カバー メガネマリエンフェルド0101050スライド上に胚をマウントします。サイズ 22 x 22 mm. 厚さ No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
マウスモノクローナル抗αチューブリン抗体 (DM1A)Santa Cruz Biotechnologysc-32293細胞のα-チューブリンの分布を標識します。
マニキュアN/AN/Aスライドのカバースリップを密封するため。
正常なヤギ血清(NGS)Sigma-AldrichG9023抗体の非特異的結合を阻害します。
パラホルムアルデヒド(PFA)VWRMK262159ラムシの卵巣の固定用。
ファロイジン-TRITCSigma-AldrichP1951胚上のF-アクチンの分布を標識するため。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)N / AN / Aアブラムシ卵巣の等張液として。
プラスチックスポイトN/AN/Aアブラムシの卵巣をチューブから細胞トレイに移すため。サイズ 3 ml. 
プロテイナーゼKメルク124678細胞膜に孔を作製(パンチング)し、抗体へのアクセスを促進するため 
PyrexスポットプレートN/AN/A顕微鏡下でのアブラムシ卵巣の解剖および色反応用。直径22 mmの各キャビティと 奥行き7mm。
SIGMAFAST 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)錠剤 Sigma-AldrichD4168基板信号の現像用。DABペルオキシダーゼ基質錠剤セットとも呼ばれます。
実体顕微鏡ライカマイクロシステムズEZ4アブラムシの卵巣の解剖と観察用。
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787細胞膜に毛穴を開ける(パンチング)用 
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)ベクターラボPK-6101シグナルの強化に。ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG二次抗体、AおよびB試薬を含みます。
VECTASHIELD封入用剤ベクター研究所H1000アブラムシの胚の清澄化と埋込用。
します 、に接続されています。 アブアブ

参考文献

  1. Blackman, R. L. Reproduction, cytogenetics and development. Aphids: their biology, natural enemies. Minks, A. K., Harrewijn, P. , Elsevier Press. Amsterdam. 163-195 (1987).
  2. Davis, G. K. Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties. J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).
  3. The International Aphid Genomics Consortium. Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biol. 8 (2), e1000313(2010).
  4. Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).
  5. Chang, C., et al. Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)). Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).
  6. Chang, C., et al. Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility. Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).
  7. Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis. Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).
  8. Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Sci. 6, 38(2006).
  9. Jaubert-Possamai, S., et al. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC Biotechnol. 7, 63(2007).
  10. Sapountzis, P., et al. New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments. Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).
  11. Braendle, C., et al. Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis. PLoS Biol. 1 (1), e21(2003).
  12. Miura, T., et al. A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea). J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).
  13. Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers. Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).
  14. Koshy, A. A., Cabral, C. M. 3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237(2014).
  15. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).
  16. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  17. Harland, R. M. In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  18. Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).
  19. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23 (4), 345-358 (2001).
  20. Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum. Evodevo. 5, 18(2014).
  21. Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures. J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

K DIG

関連記事