方法論記事

操作された複合三次元組織

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DOI：

10.3791/53885

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2016年4月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

私たちは、非小細胞肺がん(NSCLC)標的治療に対する感度を研究するために、生物学的コラーゲン足場に基づく3次元(3D)肺がんモデルを提示します。増殖指数、アポトーシス、および上皮間葉転換(EMT)の状態を決定するためのさまざまな読み出し技術を示します。収集されたデータは、薬物感受性の予測のためにin silicoモデルに統合されます。

要約

本研究では、我々は特定の突然変異背景に基づいて、薬物応答の予測を最適化するために、 シリコモデルで用いたin vitro 3D肺腫瘍モデルを組み合わせます。モデルは、基底膜を含む細胞外マトリックス組成物およびアーキテクチャに関する組織特異的特性を再現脱細胞化ブタの足場上に生成されます。私たちは、薬物治療の3日を含め14日以内に人工的な腫瘍組織の生成を可能にするプロトコルを標準化しました。私たちの記事では、読み出しの有効性を評価するための便利なツールである増殖指数Ki67染色の、M30-ELISAによって上清からアポトーシスと間葉転換 （EMT） に上皮の評価の決意のようなスクリーニング技術を、3Dのいくつかの詳細な説明を提供します治療用化合物。我々は、2D培養物にrelatある我々の3D腫瘍モデルにおける増殖の減少を比較し示すことができ臨床状況にエド。このより低い増殖のにもかかわらず、このモデルは、HCC827肺癌細胞株の比較によって示されるように正確にバイオマーカーの状態に応じてEGFR -targeted薬物応答を予測（EGFRは -mutated、KRAS野生型）およびA549（EGFR野生型KRAS -変異） チロシンキナーゼ阻害剤 （TKI）ゲフィチニブで処理しました。ビメンチン/パン - サイトケラチン免疫蛍光染色によって評価されるように、より高度の腫瘍細胞の薬物応答を調べるために、我々は、TGF-β-1との長期治療によりEMTを誘導しました。フローバイオリアクターは、組織の生成を改善し、生理的条件下に培養物を調整するために使用しました。アポトーシス、増殖指数とEMT - -ブール値へのシリコモデルではさらに、我々は、ゲフィチニブ治療またはTGF-β-1刺激の際に薬剤応答の統合を示しています。さらに、当社は、特定の突然変異背景とカウントを有する腫瘍細胞のどの薬物応答を説明します抵抗に対するerstrategiesを予測することができます。我々は、特にそのインシリコ拡大を用いたin vitroのアプローチで私たちの 3Dは2D細胞培養におけるよりもより現実的な条件での前臨床薬物検査のための付加価値を提供することを確信しています。

概要

製薬業界は、莫大なコスト1-5を引き起こす臨床段階における癌治療の分野で最大95％の高い離職率に直面しています。この赤字の1つの理由は、現在、潜在的な新規化合物の有効性は、癌細胞株の2D細胞培養でまたは動物モデルでの大規模スクリーニングで評価することです。動物モデルは、より高い複雑さを持っていますが、マウスと男性6,7間の決定的な違いがあります。 10年で、異なるアプローチを使用して3D癌モデルは、2D癌細胞株の培養およびインビボ腫瘍 6,8,9 における複合体との間のギャップを埋めるために生成されています。細胞分化にもシグナル伝達に対する3D環境の影響は数年前にいくつかの研究で示されている（ 例えば 、ミナザビッセルによって）10,11。今日では、多くの3D細胞培養モデルは、スフェロイド培養、ヒドロゲルまたはマイクロ流体チップ12-16として入手可能です。でもthesというかかわらずEモデルは、それらが主に腫瘍担持の効果と影響の薬効を有することが知られている組織の微小環境を欠いている、従来の2D培養システムと比較して複雑性を高めます。

この問題に対処するために、我々は、脱細胞化ブタ空腸に由来するSISmuc（ 小腸、粘膜下層+粘膜 ）と呼ばれる生物学的足場に基づいた3D腫瘍モデルを生成しました。これにより、組織構造や、異なるコラーゲンと同様に基底膜構造としてECMの重要な構成要素は、17を保持されます。このユニークな機能は、上皮から生じ、固形腫瘍の約80％を占める癌の腫瘍モデル生成のために重要です。さらに、我々の組織工学腫瘍モデルにおける増殖速度は、2D培養で達成され、人為的に高い速度に比べて低減されます。増殖が薬効を評価する上で重要なパラメータであるように、薬物検査は類似で我々のモデルで有効になっています17 in vivoでの腫瘍内への条件。

そのEGFRの -biomarker状態が異なる2つの異なる肺癌細胞株のための正常なバイオマーカー依存性薬物の有効性を予測するために我々のモデルの可能性を評価するために、ここで現在のデータ。この変異状態は、NSCLC患者に日常的に決定され始めています。例えば、白金ベースの化学療法18-21のものと比較して、活性化EGFR変異ショー優れた成果を保有する腫瘍に対するEGFR -inhibitorゲフィチニブなどのTKIとターゲットを絞った治療法。

我々は、化合物の有効性を評価するために関連するいくつかの読み出し技術を確立しました。さらに、TGF-β-1刺激後に、我々は、悪性形質転換22,23における重要なステップであると考えられ、薬物RESISTANに接続されたEMTプロセスを、開始した腫瘍細胞における化合物の作用を調査することができますCE 24。

3D腫瘍モデルは、良好なコントラストで標的治療、化学療法、または薬物の組み合わせに細胞特異的応答を監視することができます。さらに強化し、薬剤スクリーニングをスピードアップし、抵抗に遭遇するために、これはシリコシミュレーションにによって補完されます。いくつかの実験に基づいて、腫瘍反応は、薬物およびそれらの組み合わせの完全な範囲についての結果についてインシリコで予測することができます。

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プロトコル

1.二次元（2D）細胞培養

  1. 商業的に腫瘍細胞株HCC827（DSMZ）を得ました。培養RPMI-1640で肺腺癌細胞株HCC827（変異したEGFR、KRAS野生型）、20％FCSを補充しました。 3日間 - すべての2培地に変更します。週に2回、細胞を分割します。通路20に到達するまで細胞が使用されます。
  2. 商業的に腫瘍細胞株A549（DSMZ）を得ました。培養物を10％FCSを補充したRPMI-1640中で肺癌細胞株A549（EGFR野生型KRASが変異）。上記のように文化を実行します。通路20に到達するまで細胞が使用されます。
  3. （ - 6週間ごとに4）このようなマイコプラズマ汚染などの汚染のために定期的に細胞をテストします。
  4. カバーガラス上A549またはHCC827細胞を培養します
    1. ピンセットを用いて、24ウェルプレートの各ウェルに1滅菌ガラスカバースリップを置きます。
    2. を含むウェル中500μlの容量で両方の細胞株の50,000腫瘍細胞を播種カバーガラス、それぞれ。
    3. 培養細胞は、標準的な培養条件下で70％の集密度に達するまで（37℃、5％CO 2）。 3日間の培養 - この間、すべての2パスツールピペットを使用して、古い培地を吸引し、500μlの新鮮な培地を追加します。

生物コラーゲン足場上の腫瘍試験システムの2世代

  1. 静的培養条件
    1. 脱細胞化小腸、粘膜下組織+粘膜（SISmuc）を生成し、前の出版物25で説明したように、二つの金属リング、いわゆる細胞冠の間にそれを修正。
    2. セル冠に固定された腸のかつての内腔の側面上に種子を500μlの総容積でHCC827またはA549細胞のいずれかの100,000個の細胞。
    3. 腫瘍細胞は、37℃、5％CO 2で2時間接着させます。外側の細胞クラウン内側培地1ミリリットルと1ミリリットルを追加します。
    4. 腫瘍文化14日間37℃で、インキュベーター中で5％CO 2で、静的条件下モデル。 3日間 - すべての2培地を変更します。 （：10％、HCC827：20％A549）細胞クラウン内側と外側同じ培地の1.5ミリリットルしたがって、パスツールピペットやピペットFCSの適切な量の1ミリリットルの新鮮なRPMIを使用して、培地を吸引除去します。
  2. 動的な培養条件
    1. 2.1.3にサブセクション2.1.1で説明したように、細胞クラウンおよび細胞播種内部の脱細胞化マトリックスと腫瘍テスト・システムを設定します。
    2. 培養静的条件下での腫瘍モデル、37℃、3日間インキュベーター中5％CO 2。
    3. オートクレーブ処理バイオリアクターを組み立て、以前25公開されているようシードのSISmucを挿入します。
    4. ピペットFCS適切な量の45 mlのRPMI（A549：10％、HCC827：20％）をフラスコへとバイオリアクターとの間の配管系に無針サンプリング装置を接続します培地をフラスコ。
    5. 37°C、5％CO 2で一定の媒体流（3 ml /分）で追加の14日間ポンプや文化腫瘍モデルに接続し、インキュベーターにバイオリアクターを配置します。
    6. 7日後に全体の培地を変更します。そのため、層流フードの下インキュベーターからバイオリアクターを移動します。パスツールピペットを使用してメディアフラスコに培地を吸引します。配管システム内の培地を取り除くために吸引しながらバイオリアクターを持ち上げます。フラスコにピペットで45ミリリットルの新鮮な培地。バックインキュベーターにバイオリアクターを配置し、ポンプに接続します。

ゲフィチニブによる静的腫瘍モデルの3治療

  1. 文化腫瘍モデル2.1節で説明したように。
  2. 文化の日11時、1μMゲフィチニブ（各セルの王冠のための2.5ミリリットル）を含むRPMI / FCSを準備します。パスツールピペットを用いてウェルから古い培地を吸引し、トンの内側に準備されたRPMI / FCSは/ゲフィチニブの1ミリリットルを追加彼セル王冠と外側の同じ培地の1.5ミリリットル。
    注：解凍ゲフィチニブストック溶液を1週間4℃で保存することができます。
  3. サブセクション3.2で説明したように13日目で培地を変更します。

EMT誘導のためのTGF-β-1での静的腫瘍モデルの4刺激

  1. 文化腫瘍モデル2.1節で説明したように。
  2. 文化の3日目に、2 ngの/ mlのTGF-β-1キャリアと（各セルの王冠のための2.5ミリリットル）を含むRPMI / FCSを準備します。吸引し外部の古いパスツールピペットを用いて、ウェルから培地および細胞クラウン内側に準備されたRPMI / FCS / TG​​F-β-1の1ミリリットルを追加し、同じ培地の1.5ミリリットル。 4.2で説明したように、14日目まで3日 - 中TGF-β-1毎に2を補充して変化します。

5.リードアウト

  1. ELISA測定用のサンプルを採取
    1. 静的（セクション2.1）と動的（セクション2.2）の培養上清中からサンプルを取ります日図2に示すように、培養の11から14にゲフィチニブ（セクション3）を用いた治療。また、治療前（T0）にサンプルを取ります。
    2. 静的な培養条件下で、細胞クラウンの内側から100μlのサンプルを取ります。動的な培養条件の下では、サンプリング装置に注射器をネジ込み、バイオリアクターシステムのうち、1ミリリットルの媒体を取ります。 ELISAを行うまで-80℃で収集されたすべての上清を保管してください。
  2. アポトーシスの定量化のためのM30-ELISA
    1. 上清中のアポトーシスを定量化することは、製造業者の説明書に従って、細胞死アッセイを行います。すべての試薬は、アッセイを行う前に、RTに到達させます。
    2. ボルテックスすべての試薬。 500ミリリットル新鮮な脱イオン水で洗浄タブレットを溶解させます。コンジュゲート希釈バッファーの9.2ミリリットルでHRPコンジュゲートを希釈し、混合します。ピペットの標準またはサンプルウェルあたり25μlの。
    3. 希釈したHRP Conjuの75μLを追加ウェル当たりゲートソリューション。プレートを覆い、室温で4時間、シェーカー上でインキュベートします。準備された洗浄液250μlの、手動で5回プレートを洗浄します。
    4. 各ウェルに、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）基質3,3 'の200μLを加えます。室温で20分間暗闇の中でインキュベートします。各ウェルに50μlの停止溶液を加えます。 10秒間のマイクロプレートをシェイクし、吸光度を読み取る前に5分間、マイクロプレートを残します。マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を決定します。このような原点としてELISAタイプのデータを処理するための適切なプログラムを使用して標準曲線とサンプル中の濃度を算出します。
  3. サンプル染色
    1. 固定、パラフィン包埋し、3Dモデルのセクションの準備
      1. 2時間細胞クラウン当たり2.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用してシードのSISmucを修正し、パラフィンにそれを埋め込みます
      2. 以前に公開されたように染色のために3μmの組織切片を準備25。
    2. 2D培養条件で増殖させた細胞の固定
      1. 70％コンフルエンスに達したとき、PBSで一度24ウェルプレート中のカバーガラス上で培養した細胞を洗浄し、500μlの4％で固定しPFA /ウェルで10分間。
      2. PFAを削除し、染色が行われるまで4℃でPBSで覆われたウェルプレート中のカバーガラスを格納します。
    3. H＆E染色
      1. 標準的なプロトコルに従って概要染色としてヘマトキシリン​​/エオシンで再水和したセクションを染色。
    4. 3Dモデルの免疫蛍光染色
      1. 免疫染色のために、20分間予熱したクエン酸緩衝液（pH 6.0）で蒸気調理器に脱パラフィンし、再水和したスライドを配置することにより、抗原の検索を行います。
        注：クエン酸緩衝液を調製するための材料および機器のの表を参照してください。
      2. スライドを転送洗浄緩衝液（0.5 M PBS緩衝液+ 0.5％のTween）に、PAPペンで円のセクションでは、染色・ソリューションの必要量を最小限にするため、湿気チャンバー内でスライドを配置します。
      3. 室温で20分間、サブセクション5.3.4.6に使用される二次抗体の宿主種由来の5％血清を組織切片をブロックします。
      4. そっとティッシュペーパーにスライドをタップすることで、ブロッキング血清削除し、製造業者の指示に従って希釈で囲まれたセクションに一次抗体を適用します（ウサギ抗Ki67の1：100、ウサギ抗ビメンチン1：100、マウス抗パンサイトケラチン1 ：100）。 4℃でO / Nインキュベートします。二重染色のために、異なる宿主種からの一次抗体を使用する必要があります。
      5. 慎重に洗浄緩衝液で5分間3回、非結合抗体を洗い流します。
      6. セクション400及び室温で1時間インキュベート：特定の抗原 - 抗体結合の検出のために、希釈1に二次抗体を適用します。
      7. UNBを洗い流します洗浄バッファーでound抗体5分間3回洗浄しました。
      8. 核を対比染色し、乾燥O / NそれらをできるようにDAPIを含む水性媒体でスライドをマウントします。
    5. 2D培養細胞の免疫蛍光染色
      1. PBSを削除し、透過化のため5分間、PBS中の0.2％のTriton-X100でシードされたガラスカバースリップをカバーしています。ガラスカバーは、5分間、洗浄緩衝液（0.5 M PBS緩衝液+ 0.5％のTween）でスリップ洗います。
      2. 5.3.4.7へのステップ5.3.4.3を実行します。ロッキングプラットフォーム上でウェルプレートのすべてのステップを実行し、プレートを反転させることにより試薬を除去。
      3. 取り付けのために、コーティングされていないスライドガラス上に核を対比染色し、鉗子を用いた実装媒体との対向細胞とそれにカバースリップを転送するためにDAPIを含む水性媒体のドロップを見つけます。撮影前にそれが乾燥してみましょう。
  4. 増殖指数の決意
    1. 免疫蛍光を行いますセクション5.3.4に従ったKi67に対して染色。または5.3 5。
    2. 倒立顕微鏡で組織切片または2D培養細胞の蛍光画像を撮ります。 DAPI染色のおよびKi67染色の画像を撮影するための異なるフィルタを使用してください。定量化のために、試料の非重複部分から各条件の3Dセクションの10画像または2D培養（倍率20X）の5イメージを使用しています。
    3. 核と2DでのKi67について陽性の核の数の数を決定
      1. ソフトウェアフィジー26のプラグインセルカウンタを使用して手動でのKi67陽性核を数えます。そのため、画像を開いて、「プラグイン」→「分析」→「セルカウンター」をクリックします。押して「初期化」とカウンタタイプを選択します。それぞれのKi67陽性の核をクリックします。クリック数は、選択したカウンタのタイプの横に示されています。
      2. 核の合計数の自動細胞計数のためにフィジー27,28を使用してマクロを作成します。 ADJ全ての染色および細胞株のためのマクロをUST。続いて、マクロを作成する方法の例を参照してください。
        1. マクロの記録を開始します。 DAPI-画像を開いて、「イメージ」→「タイプ」→「8ビット」をクリックすることで、8ビット形式に変換します。 「1」と「飽和」に設定し、「正規化」、「コントラストを強調」をクリックします。
        2. 画像をシャープにする「アンシャープマスク」を設定します。 「1」の「半径」と「0.60」の「マスク」を使用してください。 「自動しきい値」をクリックして、画像をbinariseするには「黒地に白のオブジェクトの持つメソッド "RenyiEntropy"を選択します。
        3. 細胞を分離する「5」の侵食半径「プラグイン」→「BioVoxxel」→「流域不規則な機能」をクリックしてください。 「粒子の分析」と「0.02 - インフィニティ」に「サイズ」を設定→「分析」をクリックします。
          注：粒子/細胞の数がありますカウントとして集計表に示されています。
        4. さらに画像の分析のためにマクロを保存するために、「作成」をクリックします。
    4. サブセクション5.4.3.1に記載されているように、手動で3Dで核の数およびKi67について陽性の核の数を決定します。
    5. 次の式に従って平均増殖指数（PI）を計算します。
      figure-protocol-1
      N =画像の数（3D：10、2D：5）

HCC827細胞における抗EGFR療法のシリコ腫瘍モデルの生成とシミュレーション6.

  1. ネットワーク世代ネットワーク解析ソフトウェアを使用して、
    1. 重要な実験的な読み出しパラメータとHCC827細胞株の突然変異背景に基づいて、腫瘍のネットワークを生成するために、異なる既知のデータベースを使用してください。
    2. 可視化するために、ネットワーク解析ソフトウェア21を開きネットワーク。
      1. 「ファイル」→「新規」→タイプ 'JoVE_tumorモデル」をクリック→新しいネットワークを生成するために、「OK」をクリックします。二重膜に受容体を可視化する「スクエアクローズアップ北」→「OK」をクリックしてください。長方形としてのノード（=タンパク質）を可視化する「ジェネリックプロテイン」をクリック→タイプ 'EGFR」→「OK」をクリックしてください。ネットワーク内の各ノードのためにこれを繰り返します。
      2. ネットワーク内のノードにラベルを付ける：右クリック→「色の変更＆Shapeを...」→ノードEGFRおよび（EGF-EGFR）カラーコード「255,0,0」（赤色）のために選択します。ノードのc-MET及び（c-MET）カラーコード「0,255,0」（緑色）のために。ゲフィチニブのカラーコードのための「255,255,0」（色黄色）。 PI3K-INHのカラーコード「204204204」（色ライトグレー）のために。 MEK-INHのカラーコード「102102102」（色ダークグレイ）のために。ネットワークセレクトカラーコード内の他のすべてのノードのために4; 255255255」（色ホワイト）。
      3. →タイプ「増殖」六角形などの読み出しパラメータを可視化するために、「表現型」をクリック→「OK」をクリック→右クリック→「色の変更＆Shapeを...」→カラーコード「255204204」（カラーサーモン）を選択します。セレクトカラーコード「255,51,204」（カラー紫）→パラメータのアポトーシスのためにこれを繰り返します。
      4. エッジ（=相互作用）可視化：阻害（平滑化矢印）のためにクリックして、アクティベーション（矢印）は、「状態遷移」をクリックして「阻害します」。ネットワーク内の各相互作用のためにこれを繰り返します。
    3. 「ファイル」→「名前を付けて保存...」→タイプ 'JoVE_tumorのmodels.xml」をクリック→.xml形式として生成されたシグナル伝達ネットワークを保存するために「保存」をクリックします。
  2. シリコシミュレーションで SQUADを使用して、
    注：SQUADは目を表し、離散論理ブールシステム（AND、OR、NOT）、定常状態分析を実行するように、電子ネットワークトポロジ。定常状態の分析は、システムの平衡およびシグナリングの刺激の際に責任（ 例えば 、薬物適用または突然変異）を反映します。
    1. オープンSQUAD 17ソフトウェア、アップロード→「ロード・ネットワーク」「JoVE_tumorのmodels.xml 'ファイルをクリックします。 「ファイル名を指定して実行分析」をクリックしてください：
      注：次に、SQUADはブーリアンネットワーク接続を補間する指数関数を適用し、時間をかけてネットワーク動作の動的シミュレーションを可能にする（着色シグモイド活性曲線）。
    2. シミュレーションプロトコルを記述するために「詳細設定」→「摂動」をクリックしてください。抗EGFR抵抗をシミュレートする：クリックして「編集プロトコル」
      1. 「摂動」→標準使用「初期状態= SS-4」（定常状態4）→「新しい一定のパルス」を追加するために「追加」をクリック→セをクリックします択パラメータ「状態」→選択目標「FLIP」→選択時 "0"→選択値「0.4」→「OK」をクリックします。
      2. これを繰り返します。→選択したパラメータは、「状態」→選択ターゲット」のc-MET」→選択時 "0"→選択値「0.4」→「OK」をクリックし、「追加」をクリックします。 "0"→選択パラメータ「状態」→選択目標「ゲフィチニブ」→選択した時間を「追加」をクリック→選択値「1」→「OK」をクリックします。
      3. アクティブノード（EGF-EGFR）に状態値を設定します。「activenode」をクリック→「編集」をクリック→状態を選択して「0.8」→「OK」をクリックします。他のすべてのノードのために：「編集」をクリック→状態が "0"→ "OK"をクリックして選択します。プロトコルを保存するために「OK」をクリックしてください。
      4. 特定の曲線を表示します。パネルに移動し、「オプション」→「*（EGF-EGFR） "、" * MEK」、「カスパーゼ」、「（C-MET）」、「PI3K」」（EGF-EGFR）」を選択し、 「ゲフィチニブ」、「アポトーシス」、「増殖」、「MEK-INH」とグラフィック表現のための「PI3K-INH」。システムの応答の完全なシミュレーションを開始するには、「初期化」→「ファイル名を指定して実行」をクリックします。新しいシミュレーションを開始するには、「リセット」をクリックします。
    3. 組み合わせPI3KおよびMEK阻害剤治療をシミュレートする：クリックして「編集プロトコル」
      1. 6.2.2.3 - 6.2.2.1で説明したように同じノードのパラメータを使用します。 「摂動」をクリック→「0」→選択した値が「1」→「OK」をクリックしてください→「新しい一定のパルス」を追加するために「追加」→選択パラメータ「状態」→選択目標「PI3K-INH」を選択し、時間をクリックします。クリックして "追加"「新しい一定のパルス '→選択パラメータ "状態"→選択目標「MEK-INH」→選択時 "0"→選択値を追加するために「1」→「OK」をクリックします。
      2. プロトコルを保存するために「OK」をクリックしてください。 「オプション」パネルに移動します：6.2.2.4で説明したようにグラフィカルな表現のために同じノードを使用してください。システムの応答の完全なシミュレーションを開始するには、「初期化」→「ファイル名を指定して実行」をクリックします。シミュレーションを終了し、「リセット」をクリックします。

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結果

SISmuc足場（Cに図2A）に基づき、我々は3D腫瘍試験システム（ 図2D）の生成、刺激及び治療 ​​のための標準化された操作手順を確立しました。それぞれ、 図1および図3に示すように、このモデルは、増殖指数及びM30-ELISAを使用して、アポトーシスの定量化の決意を可能にします。3に示すA549およびHCC827モデルの代表的なH＆E染色とゲフィチニブとの一つの代表アポトーシスの測定図 。ここに提示さモデルが正常に診療所における標的阻害剤で治療されているEGFR -mutated NSCLCの例を使用して設計されています。これに対応し、唯一のEGFRは HCC827細胞を-mutatedおよびA549細胞は、アポトーシスの増加によって評価されるように我々のモデルでTKIのゲフィチニブによるEGFR阻害に応答しな...

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ディスカッション

我々は、バイオマーカー誘導の治療の予測のためのシリコ腫瘍試験システムのin vitro /で組み合わせ確立しています。 in vitroモデルは、また、 シリコ 17 でシミュレートすることができ、特定の突然変異背景に、腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスの変化などの化合物のアクションの異なる重要な側面を評価します。ここでは、3D腫瘍モデルの生成および増殖およびアポトーシスの定量化とシリコモデルで予測の確立を含む化合物試験のための標準化されたプロトコルを提示します。 3D腫瘍モデルは、特定の変異を有する腫瘍細胞株に基づいています。細胞は、細胞冠における脱細胞化組織マトリックス上で増殖させます。行列の脱細胞化、二つの金属リング（セルクラウン）、バイオリアクターシステムの組み立てとの固定だけでなく、足場の播種は25前にJoveの中で可視化されています。

試験管内で の

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この研究は学際臨床ヴュルツブルクの大学病院の研究（IZKF、グラントBD247）及び（平家Wallesに付与された）バイエルンフィットプログラムのためのセンターが主催しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
組織工学および再生医療のバイオリアクター議長、Würzburg (GER)Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crownsChair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER)静的3D培養用
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-このソフトウェアは、ネットワークの描画に使用されました。
クエン酸緩衝液原液(10倍)自社生産42 g/L クエン酸一水和物、17.6 g/L 水酸化ナトリウムペレット、脱イオン水、pH 6.0、RTで保存
自社生産クエン酸緩衝液の作業溶液10% クエン酸緩衝液 脱塩水中の溶液、RTで保存。
クエン酸一水和物VWR, ダルムシュタット (GER)1002441000エン酸緩衝液に使用
カバー スリップVWR, ダルムシュタット (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (USA)SBA-0100-20
KEGG, HPRD, QIAGEN などのデータベース (Genes &Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-ネットワークトポロジーの生成には、異なる既知の文献データベースが使用された。
女性ルアーラグスタイルTシャツメドネット、Münster (GER)FTLT-1バイオリアクター セットアップ
メス ルアー スレッド スタイル、5/16" 六角から 1/4-28 UNF スレッドMednet、Münster (GER)SFTLL-J1A バイオリアクターのセットアップ
子牛胎児血清バイオ&SELL、Feucht(GER)FCS。ADD.0500熱不活化されていない
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH, München(GER)S1025-100 mg100 mMストック溶液、DMSO
グラスフラスコ(Schott、GER)グラスホース接続付きッケルト、キッツィンゲン(GER)カスタムメイド
Histofix 4%(パラホルムアルデヒド)カール・ロス、カールスルーエ(GER)P087.1
ホースカップリングMednet、Münster (GER)CC-9バイオリアクターセットアップ
バイオリアクター用インキュベーター組織工学および再生医療の議長、Würzburg (GER)バイオリアクターのセットアップ
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
オス ルアー インテグラル ロック リングMednet, Münster (GER)MTLL230-J1Aバイオリアクターのセットアップ
モイスチャーチャンバーカスタムメイド
マウス抗汎サイトケラチンSigma-Aldrich, Munich (GER)  C2562-2MLクローンC-11 + PCK-26 + CY-90 + KS-1A3 +M20+A53-B/A2、免疫蛍光法に1/100を使用
ニードルフリースワブルバルブメス ルアーメドネット、Münster (GER)NVFMLLPCバイオリアクターのセットアップ、サンプリング用、ガンマ滅菌済み
O-リング MVQ 10 赤 37 x 3 mmArcus Dichtelemente、Seevetal (GER)21444O-リング大、バイオリアクターセットアップ
O-Ring MVQ 70 赤 27 x 2.5 mmArcus Dichtelemente、Seevetal (GER)19170O-リング小、バイオリアクターセットアップ
PAP ペンDako、ハンブルク (GER)S002
パラフィンCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
蠕動ポンプIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)バイオリアクターのセットアップ
Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich, Munich (GER)  D8537-6x500ml
ポンプ チューブ カセットIsmatec、ヴェルトハイム (GER)IS 3710バイオリアクターのセットアップ
Rabbit anti Ki67Abcam、ケンブリッジ (英国)ab16667クローン SP6、1/100 に使用
Rabbit anti VimentinAbcam、ケンブリッジ (英国)ab92547/100 IF
RPMI-1640 mediumLife technologies、ダルムシュタット (GER)61870-04437°Cで暖かい。使用前のCウォーターバス
シリコンチューブカール・ロスGmbH、カールスルーエ(GER)HC66.1バイオリアクターのセットアップ
水酸化ナトリウムSigma-Aldrich、Müクエン酸バッファー30620-1KG-R
半定量シミュレーションに使用したソフトウェアです。
滅菌エアフィルター、細孔サイズ0.2 & マイクロ;mザルトリウス・ステジウム・バイオテック、Göttlingen (GER)16596-HYKBioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 mlBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649for bioreactor sampling
組織培養試験プレート: 6-,     12、24、96ウェルTPPテクノプラスチックプロダクツAG、Trasadingen(GER)92006、92012、92024、92048 
トランスフォーミング成長因子-ベータ1(TGF-&β;1)キャリア細胞シグナル伝達、フランクフルト(GER)8915LCストック溶液、滅菌クエン酸緩衝液pH 3.0
Triton X-100Sigma-Aldrich、München (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, München (GER)P7949-500ml免疫蛍光染色の洗浄バッファー用
。における クウェ 1分隊 http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm に使用したnchen(GER)-

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