方法論記事

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

DOI：

10.3791/53909

⸱

2016年3月27日

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

この記事について

サマリー

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宿主細胞へのウイルス侵入中のインフルエンザAウイルスコアの分解は、多段階のプロセスです。ここでは、ウイルスのコーティング解除の初期段階をin vitroで解析する方法について説明します。このアプローチでは、速度勾配遠心分離を使用して、定義された条件下でコーティング解除を開始するステップを生化学的に分析します。

要約

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酸によって引き起こされる分子プロセスは、エンドサイトーシスシステムを通じて侵入する多くのウイルスの細胞侵入を密接に制御します。インフルエンザA型ウイルス(IAV)の場合、エンドソーム膜とのウイルス融合と、それに続くウイルスカプシドの分解(アンコーティング)は、エンドサイトーシス小胞内のイオン条件によって支配されます。ウイルスのライフサイクルの初期段階は、エンドソームに直接実験的にアクセスすることができないため、研究が難しく、in vitroアプローチの必要性が生じています。ここでは、IAVコアとその安定性の分析を可能にする、2層のグリセロールグラジエントによる精製ビリオンの速度勾配遠心分離に基づく方法について説明します。グラジエントは、ウイルスが底に向かって沈殿するときに可溶化することによりウイルス膜を除去するために、その下層に非イオン性界面活性剤(NP-40)を含んでいます。中性pHでは、ウイルスコアは安定な構造としてペレット化されます。主要なコア成分であるマトリックスタンパク質(M1)とウイルスリボ核タンパク質(vRNP)は、SDS-PAGEによってペレット画分で明確に同定できます。最下層でpHを6.0以下に下げると、ペレットからM1が選択的に除去され、続いてより酸性の条件下でvRNPが放出されます。Coomassie染色ゲル上のウイルスタンパク質バンドは、IAV分解の中間状態をモニターするために、デンシトメトリー定量にかけることができます。pH以外にも、塩分濃度や推定されるウイルスのコーティング解除因子など、ウイルスコアの安定性に影響を与える他の要因を、洗剤含有グリセロール層を適宜変更するだけで評価できます。まとめると、提示された技術は、in vitroでのウイルスコーティング解除の再現性の高い定量的な分析を可能にします。これは、複雑なコーティング解除プロセスを経る他のエンベロープウイルスに適用できます。

概要

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インフルエンザAウイルス（IAV）はエンベロープウイルスであり、 オルトミクソウイルス科に属します。その遺伝子は、セグメント化ネガティブセンス一本鎖RNAゲノム上にコードされています。ヒトでは、IAVは、季節の集団発生で発生する呼吸器感染症を引き起こし、世界的なパンデミック1の可能性を負いません。宿主細胞表面2上のシアル酸残基に結合すると、IAVは、クラスリン依存性エンドサイトーシスとクラスリン依存性経路3-8によって内在化されます。エンドサイトーシス液胞における酸性環境（pH値<5.5）は、ウイルスの融合および後期エンドソーム膜9の結果IAVスパイク糖タンパク質ヘマグルチニン（HA）、の主要なコンフォメーション変化を誘発します。サイトO - IAVキャプシドは、（ここではまた、ウイルス「コア」と呼ばれる）後期エンドソーム（LE）をから脱出した後、これを核に、ウイルスリボ（vRNPs）の輸送に続いて細胞質ゾルでコーティングされていませんFウイルスの複製および転写10-13。 HAの酸活性化の前に、ウイルスはその後の解体14-16のためのコアをプライムエンドサイトーシスシステム、内pHの漸減を経験します。この「プライミング」で陽子とK +10,14,16の流入を媒介するウイルス膜中のM2イオンチャネルをステップ。ウイルス内部のイオン濃度の変化は、相互作用がウイルスのマトリックスタンパク質M1と8 vRNPバンドルによって構築の妨げとなり、膜融合10,14-17以下の細胞質にIAVの脱殻を促進します。

プライミング工程の直接的かつ定量的な分析がエンドソームを実験的にアクセスすることが困難であるという事実によって妨げられてきました。エントリー方法は、さらに、非常に非同期です。また、このような放出されたウイルスRNAまたは感染力の測定値の定量RT-PCRのようなエンドポイントアッセイは、ウイルスcapsiの生化学的状態についての詳細な画像を提供していません。エントリの任意の段階で、D。 siRNAまたは薬物治療によってエンドソームの摂動が大幅IAVエントリ18-20の理解に貢献してきましたが、微調整が厳密に制御されたエンドソームの成熟プログラムで非特異的な副作用に困難となりやすいです。

これらの問題を回避するために、我々は速度勾配遠心分離17の使用に基づいて、以前に開発されたin vitroでのプロトコルを適応しています。主にタンパク質分解切断およびEM分析続く界面活性剤処理の組み合わせに基づいていた他の試み21,22、23,24、とは対照的に、このアプローチは、容易に定量化可能な結果を可能にしました。異なる傾斜層を介して遠心分離沈降粒子がに露出されることを可能にし、制御された方法で変化する条件に反応します。提示されたプロトコルでは、IAV清澄尿膜腔液または精製されたウイルス粒子に由来する二層グリセロール中に沈殿さ底部層は、非イオン性界面活性剤NP-40（ 図1）を含有する勾配。ウイルスは二、界面活性剤含有層に入ると、ウ​​イルスの脂質エンベロープおよびエンベロープ糖タンパク質は、静かに可溶化し、残されています。コアは、8 vRNPバンドルで構成され、ペレット画分に安定な構造としてマトリックス層、堆積物に囲まれています。例えばM1およびvRNP関連核タンパク質（NP）、ウイルスコアタンパク質は、SDS-PAGEおよびクマシー染色によってペレットに同定することができます。具体的には、市販の勾配ゲルを利用して高感度コロイド状クーマシー25で染色し、高精度及びウイルスコア関連タンパク質であっても、少量の検出を可能にします。

これは、pH、塩濃度、および推定脱殻因子コア成分及びコアSTABILの沈降挙動に影響を与えるように異なる条件かどうかを試験するための基準を設定します性。この目的のために、グリセロール勾配だけ低く、界面活性剤含有層は、目的の因子または条件を導入することによって改変されます。技術は、IAVコア16の完全に異なるpH値および塩濃度の効果を調査する際に特に貴重でした。 IAVの脱殻の中間ステップは、pHが5.5と低い16,17（ 図1）でvRNP解離に続いて、弱酸性のpH（<6.5）で、マトリクス層の解離を含む監視することができます。後者のステップは、さらに後期エンドサイトーシス環境16を反映し 、グリセロール層中の高K +濃度の存在によって増強されました。したがって、ウイルスおよび勾配を通って沈降コアとして、彼らはそのエンドソームにおける模倣条件変更環境を経験しました。結果は、細胞生物学アッセイから得られた結果を補完し、in vitroでのウイルスコアの段階的分解しました。

tは">ここで紹介する方法は、高速で有効になっているとIAV（X31およびA / WSN / 33）と、IBV（B /リー/ 40）の再現性の高い分析は、酸性pHによってトリガーされ、K +16,17だけでなく、分解を増加させること脱殻アルカリ性のpH暴露17時のパラミクソウイルスのコアの。アプローチが細胞侵入時にウイルスキャプシド構造およびキャプシド解体の生化学的性質への洞察を得るために、他のエンベロープウイルスに適合させることができると考えられます。

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プロトコル

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緩衝液および原液の調製

  1. 80ミリリットルののddH 2 Oで390ミリグラムMES水和物および580mgのNaClを、470mgのトリス塩酸塩を溶解することによりMNT緩衝液（20mMのMES、30mMのトリスおよび100mMのNaCl）を準備pH7.4に緩衝液を調整し、のddH 2 Oで最終容量100mlにそれを持って来ます
  2. 80ミリリットルのdH 2 O毎に9.76グラムのMES水和物を溶解することによって500mMのMES緩衝液の3つの同一の溶液を調製します。濃NaOHで滴定することにより、それぞれ、pHが5.8、5.4にバッファを調整し、5.0。 dH 2 Oで最終容量100mlに各バッファを持参
  3. 80ミリリットルのdH 2 Oそれぞれに7.88グラムのトリス塩酸塩を溶解することにより、500 mMトリス緩衝液の2つの同一のソリューションを用意し、濃HClで滴定することにより、それぞれ、7.4および6.4にpHを調整します。 dH 2 Oで最終容量100mlにバッファを持参
  4. dH 2 O中の50％グリセロール溶液を準備し、glycまでよくかき混ぜエロールは均一に混合されます。ガラス瓶にSteritopフィルタユニット（0.22μmの孔サイズ）を通して溶液をフィルタリングします。
  5. 10％NP-40ソリューションとのdH 2 O中1MのNaClを準備
  6. ddH 2 O 4ミリリットル中に2個の錠剤を溶解することにより25倍濃縮されたプロテアーゼ阻害剤を準備

グリセロール勾配の調製

  1. 5ミリリットルの洗剤バッファマスターミックス準備（pHは7.4、6.4、5.8、5.4、および5.0）のテストに各pH条件の溶液（300mMのNaCl、2％NP-40を、2倍は、プロテアーゼ阻害剤を濃縮します）。この目的のために、1MのNaClの9ミリリットル、10％NP-40の6ミリリットル、25×プロテアーゼ阻害剤の株式の2.4ミリリットル、及び9ミリリットルののddH 2 0を混ぜます。
  2. 各pH条件ピペット用の50mlコニカルチューブにマスターミックス4.4 mlです。
  3. 5.8以上のpH値についてチューブにそれぞれのpH調整500 mMトリスストック溶液の0.6ミリリットルを追加します。 pHが5.8と低いために、それぞれのpH調整の500mM MESストック溶液の0.6ミリリットルを追加します。
  4. 5を作ります300mMのNaClを含む緩衝液、2×プロテアーゼ阻害剤、pHが7.4とのddH 2 Oに調整し、60mMのトリスミリリットルこれは、界面活性剤を含まない対照勾配バッファとして機能します。
  5. 必要に応じて、それぞれ、濃HCl又はNaOHソリューションを追加することにより、pHが7.4、6.4、5.8、5.4、および5.0に溶液のpHを微調整します。
  6. 6別の25％グリセロール溶液が得られる界面活性剤含有および界面活性剤を含まない緩衝液の混合物の5ミリリットルに50％のグリセロールストックの5ミリリットルを追加します。 pH指示薬ストリップを用いてpH値を確認します。
    注：測定したpHが所望の値と大きく異なる場合は、それぞれの溶液を再度準備する必要があります。
  7. 7比：3でのdH 2 Oで50％のグリセロールストックを混合することにより、15％グリセロール溶液を準備します。

IAVの3超遠心

  1. 5ミリリットルの注射器や旧姓を使用することにより（13.2ミリリットル、X 89ミリメートル14ミリメートル）の超クリアな遠心チューブに3ミリリットル15％グリセロール溶液を追加DLE（9 cmの長さ21 G、）。これは勾配の整合性を乱す可能性があるとして、管の内壁に水滴を残さないでください。 6遠心分離管、テストに5 pH条件ごとに1つの対照試料のための1つの合計のためにこれを繰り返します。
  2. 注意深く5mLの注射器と長い針を使用して、15％のグリセロール層の下に3.4 mlの25％グリセロール溶液を置きます。二つの層を混在させないように注意してください。それぞれのpH調整グリセロール溶液でテストするために、すべての6つの条件のためにこれを繰り返します。
    注：以下の手順については、クラスII安全キャビネットで作業。
  3. 静かに1ミリリットルMNT緩衝液で希釈IAV（X31、H3N2）を含む尿膜液を明らかにした30μlのグリセロール勾配を重ねるごとグラデーションの（周り20-30μgの総ウイルスタンパク質のに相当します）。
  4. バランスチューブに反対し、SW41超遠心ローターに入れます。 55,000×gで、150分間遠心し、12°C。
  5. 遠心分離した後、慎重にきれいなパスツールピペットや吸引器を使用して上清を除去し、 すなわち 、両方のグリセロール層。 40μL（1×）非還元LDSサンプル緩衝液中にペレットを再懸濁します。完全にペレットを溶解するには、上下に数回ピペッティングすることが重要です。 1.5ミリリットルのマイクロチューブにサンプルを移します。

4. SDS-PAGEペレット画分のクマシー染色

  1. 10分間95℃ですべてのサンプルを加熱します。これらはSDS-PAGEによって分析されるまで、この時点で、サンプルは-20℃で保存することができます。
  2. 負荷溶解ペレット20μlのプレキャスト勾配（4から12パーセント）ビス - トリスミニゲル上に、バッファを実行している1×MOPS SDSで200 Vで1時間実行します。
  3. ddH 2 O中の40％メタノールおよび10％氷酢酸固定液を作ります
  4. コロイド状クーマシー液の十分な量で一晩15cmの細胞培養皿に1時間と染色のための固定液中でゲルをインキュベートしながらそっと室温で振とう。
    注：これは、染色溶液の蒸発を回避するために、皿を閉鎖することが重要です。
  5. ddH 2 O中でゲル脱色ゲルの背景が透明になるまでのddH 2 Oごとに15〜20分を交換してください。それはバンドの定量化のためにスキャンされるまで4℃でのddH 2 Oでゲルを保管してください。
  6. 高解像度でゲルをスキャンし、タンパク質バンド強度の定量化のために市販されているか、またはカスタムメイドのソフトウェアを使用しています。各バンドに近い領域からバックグラウンド信号を減算し、界面活性剤を含まない対照試料（pH7.4で）にこれらの値を正規化します。

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結果

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既に論じたように、エンドソーム内のプライミングコンピ脱殻IAVコアをレンダリングするために必要とされます。コアのプロトンは、（ウイルスRNA、NP、およびポリメラーゼ複雑PB1 / PB2 / PAから成る）M1とvRNPsの相互作用を弱めます。入ってくるウイルスは初期エンドソーム（のEE）6.5（またはそれ以下）のpHに露出してのLEでpH約5.0でのウイルスのヒューズまで継続されると、このプロセスが開始されます。

pH値の減少を模倣するために、グリセロール勾配の最下層は、一定の塩濃度でpHを7.4と5.0の間の値に調整しました。清澄尿膜腔液から誘導X31は、速度勾配遠心分離にかけ、SDS-PAGE（ 図2A、B）で分析しました。の特徴的なパターンに反映されるように勾配（ 図2A、レーン1）に存在する洗剤なしで無傷のビリオンは、ペレット化されていま...

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ディスカッション

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ウイルスキャプシドは、準安定巨大分子複合体です。ビリオンのアセンブリは、ウイルスゲノムのキャプシド形成及び縮合を必要とするが、感染の次のラウンドの開始は、このコンパクトなキャプシド構造の分解に依存します。ウイルスは、細胞受容体、シャペロン、タンパク質分解酵素、モータータンパク質またはヘリカーゼ、ならびにpHおよびイオンスイッチ26,27により提供される物理的な力を含むコーティング-脱殻サイクルを制御するために、様々な細胞機構を利用するために進化してきました。ここでは、特にIAVコアの分解を促進因子の効果をテストするために、グリセロール勾配遠心分離に基づいて、in vitroでのアプローチについて説明します。技術は、潜在的には他のエンベロープウイルスの脱殻のプロセスを解剖するために適合させることができます。

コロイド状クーマシーを使用して、主要な構造IAVタンパク質M1、NPおよびHAは明らかに比較的小さなウイルス気難しいとSDS-PAGEで検出することができますル数。しかし、より詳細な沈降キャプシド構造の特徴付けおよびフォローアップを必要とす...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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私たちは、試薬をご提供するため洋平山内とロベルタマンシーニに感謝します。 AHの研究室は、マリー・キュリー初期研修ネットワーク（ITN）、欧州研​​究会議（ERC）によると、スイス国立科学財団（Sinergia）によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤Sigma-Aldrich11873580001ストック溶液は2〜8°Cで保存できます。C 1〜2週間
氷酢酸メルクミリポア100063
無水グリセロール BioChemicaAppliChemA1123
塩酸メルクミリポア100317
ロング注射針 (21 G、9 cm、斜角または鈍い端)
MES水和物Sigma-AldrichM8250
メタノールMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896IGEPAL®CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris ミニゲル、10 ウェル、1.0 mmLife TechnologiesNP0321
NuPAGE LDS サンプルバッファー (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー (20x)Life TechnologiesNP0001
pH インジケーターストリップ、pH 4.0-7.0Merck Millipore109542
QC Colloidal Coomassie StainBIO RAD1610803
Sodium塩化物メルク ミリポア106406
水酸化ナトリウムメルク ミリポア106498
ステリトップ フィルターユニットメルク ミリポアSCGPT05RE
SW41 Ti、超遠心ローターセットベックマン・コールター331336
薄壁、超透明遠心チューブ、13.2 ml、14 mm x 89 mmベックマン・コールター344059
トリス塩酸塩 AppliChemA1087
X31インフルエンザAウイルス(H3N2)、卵子成長、清澄尿Virapur4°Cで新たに解凍。ハ

参考文献

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