方法は、標的とマウスにおけるアイソ気道-神経支配感覚ニューロンへ

サマリー

臓器特有の感覚ニューロンを特定するのは困難です。Fast Blueトレースは、細胞ソーティングのために気道を神経支配するnodoseニューロンを特定するために使用されます。選別されたnodoseニューロンは、シーケンシング用の高品質のリボ核酸(RNA)を抽出するために使用されます。このプロトコルを使用して、気道特異的ニューロンの遺伝子発現が決定されます。

要約

体性感覚神経は、熱的、機械的、化学的、および内因性と環境因子によって引き起こされる有害な刺激を伝達します。これらの求心性ニューロンの細胞体は、感覚神経節内に配置されています。感覚神経節は、身体の特定の器官または一部を支配します。例えば、後根神経節（DRG）は、脊柱に配置され、身体や手足全体のプロセスを拡張します。三叉神経節は、頭蓋骨に位置し、顔を支配し、上気道されています。節状神経節の迷走神経求心性神経は、腸、心臓、肺全体に延びています。呼吸数、気道の炎症、および咳反射：結節ニューロンは、以下のような機能の多様な配列を制御します。したがって、それらの機能を理解し、操作するために、気道特定のニューロンのサブ集団を同定し、単離することが重要です。マウスでは、気道は、気道固有の結節ニューロンの逆行性トレーシングのために、蛍光トレーサー染料、ファーストブルーにさらされています秒。結節神経節を解離し、蛍光活性化細胞（FAC）選別染料陽性細胞を収集するために使用されます。次に、高品質のリボ核酸（RNA）は、次世代配列決定のための色素陽性の細胞から抽出されます。この方法は、気道の特定の神経細胞の遺伝子発現を使用して決定されます。

概要

体性感覚神経は、熱的、機械的、化学的、および内因性と環境因子によって引き起こされる有害な刺激を伝達します。これらの求心性神経の細胞体は、後根、三叉神経、または結節神経節のように、知覚神経節に位置しています。それぞれの感覚神経節は、身体の特定の領域を神経支配し、その領域内の別々の臓器や組織を神経支配する細胞が含まれています。三叉神経節は、顔、目、髄膜または上気道^1を神経支配するニューロンを含む、頭蓋骨内に配置されている間^、例えば、後根神経節（DRG）は、脊柱に配置され、身体や手足全体のプロセスを拡張します^2。迷走神経の節状神経節は、頭蓋骨下の首に位置し、消化管、心臓、および下気道や肺³を通して神経繊維を拡張する細胞体が含まれます。ヒトでは節状神経節は、しかし、マウスでそれが融合されて、一人で立っていますまた、肺^4を神経支配頚神経節、と。この融合した神経節は、しばしば頸静/結節複雑、迷走神経節、あるいは単に節状神経節⁵と呼ばれています。ここでは、結節性神経節と呼ばれています。

結節の求心性線維は、脳幹内の孤束核（NTS）の核に内臓からの情報を渡します。このユニークな神経節への感覚入力は、このような腸運動性^6、心拍数^7、呼吸^8,9、および刺激性活性化呼吸応答^10,11として機能し、多様な配列を制御します。機能や神経支配器官のこのような多様性と、個々のニューロン経路を研究するために、節状神経節の臓器特異的亜集団を標的とし、単離することが重要です。しかし、結節のサイズが小さく、それが、これは簡単な作業ではありません含まれているニューロンの数が限られて与えられました。神経節結節各マウスは、およそ5,000のニューロン^12が含まれ^てい^ます衛星細胞を支持する大規模な集団に加えました。 5000結節ニューロンの、唯一の三から五までパーセントの神経支配気道。そのため、呼吸器刺激や病理に対する気道-神経支配ニューロン内の任意の機能、形態学的または分子変化は、高密度に充填された節状神経節に失われます。

この問題を解決するために、この方法は、気道を神経支配するニューロンを同定および単離するために開発されました。気道は、その後の神経支配の結節ニューロンを同定するために蛍光トレーサー色素に曝露しました。ファーストブルーは、ニューロンによってピックアップし、それが最大8週間¹³のために保持され、それらの細胞体に素早く移動した^{- 15。}一度同定、まだ効率的な、穏やかな分離プロトコルは、蛍光活性化細胞（FAC）ソートする色素標識および細胞生存率を維持するために使用しました。選別された細胞は、遺伝子発現またはfを決定するために、高品質のリボ核酸（RNA）を抽出するために使用されまたは他の下流の分子解析。このプロトコルは、関心のある組織を神経支配する感覚ニューロンを単離するのに有用で堅牢な技術を提供します。

プロトコル

動物を対象とする手順は、デューク大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。

ファーストブルーの1鼻腔内投与

ファーストブルーの場合、少なくとも2日間、マウスを安楽死前に染料を管理します。染料は、最大8週間持続します。

1. 呼吸が遅くし始めるまで光吸入麻酔（2.5％セボフルラン）でマウスを麻酔。
2. マウスを確保するために時折一時停止、ゆっくり鼻孔に染料溶液40μl（0.4mMのファーストブルー、1％ジメチルスルホキシド、DMSO、リン酸緩衝生理食塩水、PBS）を植え付ける濾過ヒントを200μlのピペットを使用して溶液を吸引され（ 図1A）。
3. 、垂直方向にマウスを押したままヘッドアップ、そして優しく色素が肺全体に広がる確保するために胸をマッサージします。

解剖と分析日に2.準備

1. 10ミリリットルを準備0; 表1に指定されている成分を組み合わせることによって神経節解離ソリューション（GADS）。
2. 専用ラボエリア内のRNAの抽出を行います。実験を開始する前に、70％エタノール、10％の漂白剤、およびRNaseの汚染除去試薬と清浄な表面。これは、RNA遠心分離機、任意のチューブラック、およびピペットを含んでいます。専用のフィルターチップボックスはRNAのみでの使用のためにそこにあることを確認してください。これはサンプルを汚染するとして、DNA調製のために、この機器やエリアを使用しないでください。
3. RNaseフリー水を用いて新鮮な70％、および80％エタノールを混合します。 RNAの抽出に使用されるサンプルごとに1 mlで調製します。

成分	量
高度なDMEM / F12	9.5ミリリットル
グルタミン	100μlの
HEPES（10mMの）	100μlの
N2サプリメント	100μlの
B27（なしビタミンA）	200μlの
NGF（50μg/ mlの）	10μlの

神経節解離ソリューション（GADS） 表 1. 試薬混合物。

3.解剖手順

1. 500μlのGADS、各実験試料について1、ポジティブソート制御のための1、および負の仕分け制御のための1つの1.5 mlチューブを埋めます。解剖を通してチューブを氷上に保管してください。
2. 節状神経節を解剖し、解離を促進するために、二つの部分のカットを行い、その後、実験試料管に入れて。節状神経節¹⁶とDRG ¹⁷の解剖については、次のJoveのプロトコルを参照してください。
3. ソートのコントロールのために、このような後根神経節（DRG）などの神経節を、解剖し、部分的に非標識カット。ポジティブコントロールと2 gangliための2つの神経節を使用しますネガティブコントロールのために。
4. 成功した並べ替えのための十分な結節ニューロンを得るためには、GADSを含む1つの実験サンプル管に5匹のマウスからの神経節を兼ね備えています。

4.知覚神経節解離

1. チューブ内の神経節を残して、500μlのGADSをピペット。一度1mlのPBSを添加することにより洗浄神経節は、その後、PBSをピペット、チューブの底に沈殿する神経節を待ちます。
2. 1ミリリットルGADSと消化酵素の22μlの（コラゲナーゼI / IIおよびプロテアーゼ混合物は、2.5 mg / mlで中のH ₂ O）を各チューブを追加します。
3. 陽性対照チューブに20μlのファーストブルー（5.26ミリモル）を追加します。
4. 既に37℃に設定した水浴または加熱ブロックにチューブを入れてください。
   注：神経節消化の時間は、消化酵素の年齢に依存します。消化酵素を溶解する1ヶ月以内に、30分間のダイジェスト、2の内部 - 6ヶ月、45分間のダイジェスト。酵素は6ヶ月以上古いものであれば、神経節Fをダイジェストまたは60分。
5. 15分毎に振盪管簡単と神経節を確実にするために、それらをフリック溶液で覆われています。
6. 神経節が消化されている間、粒子溶液（ポリビニルピロリドンで被覆されたコロイドシリカ粒子）を用いた密度勾配を調製します。
   1. GADS、サンプルあたり500μlの12％の粒子溶液を混ぜます。
   2. GADS、サンプルあたり500μlの28％粒子溶液を混ぜます。
   3. ゆっくりと慎重に、各サンプルの新しい1.5 mlチューブに400μlの28％濃度溶液の上に400μlの12％濃度の溶液を添加します。 2つの層が混在しないようにしてください。二つの異なる層は、チューブ内に表示されるはずです。他のより暗い1。
7. 神経節を消化されている間、（1ファーストブルー陽性およびサンプルを分類ごとに1ファーストブルー負のチューブ）をソートするための新しい1.5 mlのコレクションチューブにラベルを付けます。干渉しないようにソート機能要件に応じて、これらのチューブは、取り外し可能な蓋を持っている必要がありますセルソーターた電子。
8. 適当な消化時間後、消化酵素でGADSを除去し、1mlのPBSで2回神経節を洗います。各チューブに新鮮なGADSの200μLを加えます。
9. 離れて細胞を破壊するには、上下に数回200μlの100μlの容量に設定さピペット、ピペット神経節を使用してください。組織のない無傷の作品が見られなくなるまで繰り返します。溶液中の気泡を作成しないでください。
10. 70μmのセルストレーナーを通して解離した細胞を渡します。
11. 残された残りの浮遊細胞をピックアップし、セルストレーナーを介して追加のソリューションを渡すために、元の解離管に別の100μlのGADSを追加します。新しいピペットチップを使用して、ストレーナを通過し、メッシュにしがみついた残りの細胞含有液を収集します。 GADSに懸濁された細胞の最終容量は300μLです。
12. 慎重に以前に作られた密度勾配の上に細胞を300μlをレイヤー。 Cの泡と混合を避けます密度層を有するells。
13. 室温で2900×gで10分間遠心します。
14. 細胞は遠心分離器であるが、以下のように、溶解バッファー（実験サンプルあたり1ミリリットル）を混ぜる：10μlの2-メルカプトエタノール（RNA抽出キットから）1ミリリットルのBuffer RLTインチ
    1. ファーストブルー正のコレクションチューブに300μlの溶解バッファーとファーストブルー負のコレクションチューブ（ステップ4.7からラベルされたチューブ）に600μlのを追加します。この体積は、収集されると予想される細胞の数に依存します。 7000細胞600μlを添加するために、<2,000細胞、300μlを添加する>が。これはかなりの溶解緩衝液を希釈しないソートシース流体を保証します。
15. 遠心分離が完了したら、慎重に取り外し、トップ700μlの層を捨てます。この層は、他の方法で細胞選別を妨害する細胞の破片の大部分が含まれています。
16. 溶液およびピペットを含む残りの細胞に700μlの新鮮なGADSを追加TE数回上下に混合します。
17. 細胞をペレットに2900×gで15分間遠心します。
18. 細胞は遠心分離器であるが、1ミリリットルのGADSに5μlのDNアーゼ（10mg / ml）を添加することにより、GADS（サンプルあたり500μl）をソート混ぜます。
19. 遠心分離が完了したら、慎重に細胞ペレットを残し、上澄み液を除去し、廃棄します。
20. 再懸濁200で細胞ペレット - と200μlの数倍に設定千μlをピペットで上下にピペッティングすることにより、GADSをソート300μLを。氷の上にサンプルを置きます。細胞は、今ソートする準備ができています。

5.蛍光活性化細胞（FAC）並べ替え

注：このセクションでは、運用FACSソーターの知識や熟練者の支援を必要とします。

1. 細胞生存度を試験するために、各サンプルに1μlのヨウ化プロピジウム（PI）ストック溶液（50μg/ ml）を加えます。 2チューブ、PIと1と1なしに負の制御を分割します。 PIは死んだ細胞のDNAと結合します。もし最初のいくつかの種類の後に標識する全く死んだ細胞が存在しない、PIの使用は必要ありません。
2. 交通細胞を氷上で例えば 、BD FACS AriaIIは、歌姫8ソフトウェアを実行して、楽器フローサイトメトリーします。
3. セルサイズがこの集団内の変数であるため、ソートに大ノズル（100μm）を使用します。ストレス細胞経験の量を減少させ、細胞生存率は、低圧（20 PSI）を使用して増加させます。
4. 必要に応じて、解析プロット、前方散乱、側方散乱（SSC）、ファーストブルー、およびPIを設定するために、FACSソーターのソフトウェアを使用してください。
5. 細胞を再懸濁するために、そっとソーターにロードする前にサンプルを簡単にボルテックス。
6. ゲート閾値（ 図2A）を設定するために、ネガティブコントロール、無ファーストブルーまたはPIで始まります。これは、細胞集団内の自己蛍光の量を決定します。オプション：死んだ細胞の集団があるかどうかを識別するために、PIで負のサンプルを実行します。
7. 陽性対照サンプル（株式会社を並べ替えます補正パラメータを設定するには、）ファーストブルーでubated。
8. ゲートおよびパラメータを設定した後、実験サンプルを選別始めます。試料は、RNA溶解緩衝液を含む準備コレクションチューブにソートされます。
9. 細胞選別が完了するまで氷上でソートされたサンプルを保管してください。
10. 細胞がソートされた直後のRNA抽出工程を開始します。

6. RNA抽出

1. 1分間、溶解緩衝液で渦選別された細胞をホモジナイズします。
2. 数回ピペッティングにより70％エタノールとミックスの1ボリュームを追加します。
3. スピンカラムに700μlのサンプルまで移します。 8000 x gで15秒間遠心します。フロースルーを捨てます。
   1. 試料の全量をスピンカラムを通過するまで繰り返します。
4. メーカーのprotocoに従って、DNase処理工程を含む、350μlのBuffer RW1を追加し、RNA精製プロセスを続行細胞についてリットル。
5. RNAを抽出した後、製造業者の仕様書に従って、マイクロ流体電気泳動システムを用いてRNAの品質をテストします。

結果

この方法を使用して、気道神経支配するニューロンは、鼻腔内にファーストブルー（ 図1A）を浸透することによって標識されます。 2日後、ファーストブルー標識された細胞は、節状神経節（ 図1C）に表示されます。節状神経節の全ニューロン集団の5％ - これらの細胞は、3を構成しています。この目的のために使用されてきた他の逆行性染料はのDiI（1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチル過塩素酸塩）およびフルオロゴールドを含みます。ニューロン結節のDiIラベルへの肺暴露。しかし、DiIでは神経節に達するのに時間がかかり、7から14日点眼^18,19の後、したがって、積極的に輸送染料を使用しました。フルオロゴールドはまた、気道ニューロン^14,20を標識するために使用されている積極的に輸送色素です。我々の経験では、しかし、一度この染料は（データは示していない）、それは迅速に衛星細胞ではなく、神経細胞によってピックアップされた結節神経節に細...

ディスカッション

このプロトコルは、迷走神経の節状神経節で気道神経支配ニューロンをターゲットにする方法を説明しています。一旦標識神経節を穏やかに最適細胞数および生存率を維持するために分離されています。これらのニューロンは、その後、FACは、溶解緩衝液に直接ソートされ、RNAが抽出されます。このプロトコルの重要性は、標的に切り分け、および特定の感覚細胞集団の品質を維持する能力です。遺伝子発現は、ニューロンのこの小集団に記載されており、器官特異的機能とニューラルネットワークが識別されます。

このプロトコルでの重要なステップは、解離過程を経て急速な進行とそれに続く細胞選別を含みます。解離後直ちに開始するように、並べ替えの時間をスケジュールすることが重要です。 70％と80％のエタノール溶液を新たに作製された、すべてのRNA抽出試薬が新鮮であることも重要であり、そしてRNA抽出のための全てのチューブおよび機器無料の清潔およびRNaseです。

このプロトコルは、細胞が単一細胞RNA抽出およびシークエンシングのためにウェルプレートに個別にソートされるように...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ファスト・ブルー	・ポリサイエンス・インク	17740-2	ストック 2 mg/ml 水
NeuroTrace 530/615 赤ニッスル染色	Life Technologies	N21482
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca および Mg フリー	Gibco	14190-144
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
グルタミン (Glutamax)	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
N2	Gibco	17502-048
B27 (ビタミンAなし)	Gibco	12587-010
神経成長因子(NGF)	Sigma	N6009	ストック 50 & マイクロ;PBS/10% FBS
消化酵素、リベラーゼDH研究用グレード	ロシュ	5401054001	ストック2.5 mg/ml、水
粒子溶液(Percoll)	Sigma	P1644-25ML
加熱ブロック	LabNet
70 &m cell strainer	Falcon	352350
Absolute Ethanol (200 proof)	Fisher Scientific	BP2818-500
RNase free water	Fisher Scientific	BP2484-100
RNase deinfection reagent, RNase AWAY	invitrogen	10328-011
2-mercaptoethanol	VWR	EM-6010
RNA extraction kit, RNeasyプラスマイクロキット	Qiagen	74034
DNase キット、RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254
DNase	Sigma	D5025-15KU	ストック 10 mg/ml in 0.15 M NaCl
Propidium Iodide	Sigma	P4170-10MG	Stock 10 & micro;g/ml in PBS
マイクロ流体電気泳動システム (TapeStation 2200)	Agilent