BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

サマリー

多能性幹細胞から心筋細胞をin vitroで生成することで、基礎科学と臨床応用のための大量の心臓組織へのアクセスが可能になります。 このプロトコルでは、心房化因子Grem2を使用して、得られる心筋細胞の数を増やし、心房表現型を持つ心筋細胞を生成します。

要約

多能性幹細胞からの心筋細胞の集団を生成するためのプロトコルが開発されてきたが、これらは一般に、混合表現型の細胞をもたらします。特定の筋細胞のサブタイプを含む研究を追求することに興味の研究者は、より多くの有向分化アプローチが必要。 Grem2、 インビボでの心房室形成するために必要な分泌BMPアンタゴニストによるマウス胚性幹（ES）細胞を処理することによって、心房表現型を有する心臓細胞の多数を生成することができます。操作MYH6-のDsRed-のNuc多能性幹細胞株の使用は、識別、選択、および心筋細胞の精製を可能にします。このプロトコルでは胚様体は、ハンギングドロップ法を用いて、MYH6-たDsRed-のNuc細胞から生成され、分化4日目（D4）まで懸濁状態に維持しました。 D4セルでGrem2で処理され、ゼラチンコーティングしたプレート上にプレーティング。 D8-D10大型契約エリア間の培養で観察し、拡大を続けるとメートルされていますD14を通してature。分子は、組織学的およびelectrophysiogical分析はGrem2処理細胞における細胞は、心房心筋細胞の生物学および様々な薬理学的薬剤に対するそれらの応答を研究するためのin vitroモデルを提供心房のような特徴を獲得示しています。

概要

多能性幹細胞は、特にヒト^1-5に、基礎研究および前臨床研究のための組織にアクセスすることは困難での宿主から細胞を生成し、研究するための強力なツールです。発達シグナル伝達経路の適切な調節は、所望の表現型の運命への多能性幹細胞の分化を指示することができます。多くのプロトコルは、多能性幹細胞から心筋^{6-14（CMS）}を生成するために開発されています。これらのプロトコルは、一般的にTFGβスーパーファミリー（アクチビン、BMP、およびTGFβ）およびWnt外因性の成長因子および/ ​​または小分子^10,12-15の時限添加による経路の調節を伴います。これらのプロトコルは、一般のCMとなる細胞の割合を増加させるのに有効であるが、心房、心室、及び結節/伝導系の系統を示す細胞の混合集団を生成し、特異性を欠きます。特定の心臓を研究するために、より導か分化アプロサブタイプACHが必要です。

Gremlin2（ダンと短いためケルベロスまたはPRDCに関連Grem2、とも呼ばれるタンパク質）は、ゼブラフィッシュ¹⁶で心臓発生時に適切な心臓分化および心房室形成するために必要な分泌BMPアンタゴニストです。ただ、中胚葉マーカーT-ブラキュリと1のようなケルベロスのピーク発現させた後、分化4日目にGrem2との差別化胚性幹細胞を処理する、のCMの歩留まりを向上させ、主に心房系統¹⁴の細胞のプー....

プロトコル

細胞培養培地、ソリューション、および試薬の調製。

1. （孔径0.2μm）445 mlのグラスゴー最小必須培地（GMEM）を50mlの熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を混合し、滅菌濾過することによって、マウス胚性幹細胞を500ml（MESC）培地を調製5mlの100Xは、L-濃縮しました1mlあたり1×10 ⁷単位、および1.43μlのβ-メルカプトエタノール（最終濃度は、50μMである）のグルタミンの置換、5μlの組換えマウス白血病抑制因子（LIF）。使用する準備ができるまで4℃で保存してください。
2. 391 mlのイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、FBS不活化100 mlの熱を混合し、滅菌濾過することによって胚様体（EB）分化培地を500mlを調製5mlの100Xを5mlの100Xは非必須アミノ酸を濃縮し、L-グルタミンの置換を濃縮しました（NEAA）、および2.86μlのβ-メルカプトエタノール（最終濃度は100μMです）。使用する直前まで4˚Cで保存。
3. 0.2％のワットを準備濾過し、蒸留H ₂ O 500mlで1gのブタ皮膚ゼラチン粉末を混合してゼラチン/ v溶液オートクレーブ滅菌します。ゼラチンは、室温で水に完全に可溶性ではないかもしれないことに注意してください。ゼラチンをオートクレーブした後に完全に溶解する必要があります。使用する準備ができるまで室温で保管してください。
4. 0.5μg/μlのストック....

結果

分化前に、多能性幹細胞は、コンパクトかつ自発的分化の自由であるべきです。 図1（a）に示す細胞が単数化およびプロトコルセクション5.1で説明したように液滴を掛けるために使用される準備ができています。 図1（b）に示す細胞が自然に分化していると懸滴の調製のために使用すべきではありません。

パネルは、図2に含ま分化2日目品質のEBでのショー正常に形成されたEBは、一般的に、図2に示すように最善内に均等に間隔をあけ、よく丸い吊り下がる形成している。分化2日目では、EBを球状の手配などの肉眼で見えるはずですハンギングドロップ（ 図2）の先端に幹細胞を分化させます。プロトコルセクション5.3で説明するように、これらのEBは、ウォッシュダウンの準備ができています。

ディスカッション

このプロトコルは、日常的に心房系統の特徴であるのCMの割合が高いと文化を生成します。任意の分化プロトコルと同様に、分化に先立ったmESCの品質は、特に注意を与えられるべきです。たmESCは、日常的に適切な形態（ 図1A）を監視する必要があります。前EBの形成に発生した自発的な分化が厳しく心臓の効率を制限すると（ 図1B）を継代する前に削除する必要があります。 EBサイズも心臓に影響を与えます。 200とEBあたり1,000〜出発細胞数は、テストされているとEBあたり500個の細胞は、日常のCMの最高の数字を生成します。前日EB形成に継代された細胞はまた、より効率的に差別化する傾向があります。

「ハンギングドロップ」法は、このプロトコル²⁵にEBSを生成するために使用されます。心臓分化ヘクタールのために使用したEBを作製するための他の方法^26-29を報告されまし。 「ハンギングドロップ」の方法は、簡単で安価、容易に共通の細胞培養装置・材料と任意の実験室で採用され、細胞培養.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GMEM	ライフテクノロジー	ズ11710
FBS	ライフテクノロジー	ズ10082
Glutamax	Life Technologies	35050
LIF	EMDミリポア	ESG1107
ß-メルカプトエタノール	シグマ	M3148
IMDM	シグマ	I3390
非必須アミノ酸	Σ	M7145
10 cm 組織培養プレート	Sarstedt	83.3902
10 cm 細菌性ペトリ皿	VWR	25384-342
6 cm 細菌性ペトリ皿	VWR	25384-092
6 ウェル組織培養プレート	Sarstedt	83.3920
Gremlin 2 組換えタンパク質	R&アンプ;D Systems	2069-PR-050
滅菌フィルターユニット	サーモフィッシャー	09-741-02
ゼラチン (豚の皮から)	Sigma	G1890
10X PBS, Sterile	Sigma	P5493
BSA	シグマ	5470
0.05%トリプシンEDTA解決	Life Technologies	25300054
DPBS、カルシウム、マグネシウムなし	Life Technologies	14200