タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します

Summary

MyoDは、多くの完全に分化した非筋肉細胞株の筋原性分化転換を誘導する強力な能力を持つ筋原性転写因子です。この分化転換に関与するエピジェネティックなメカニズムは、ほとんどわかっていません。ここでは、MyoDパートナーを網羅的に特性評価するためのダブルアフィニティー精製法とそれに続く質量分析法について説明します。

Abstract

骨格筋分化は、筋芽細胞への多能性中胚葉前駆細胞のコミットメントから始まります。これらの細胞はまだ増殖する能力を持っているか、彼らは筋線維を形成するために、さらに成熟さ多核筋管に分化するとヒューズができます。骨格筋分化は、様々な転写因子の協調作用によって編成され、特に筋肉調節因子またはMRFは（のMyoD、ミオゲニン、Myf5の、およびMRF4）のメンバーは、また、筋原性のbHLH転写因子ファミリーと呼ばれます。これらの要因は、骨格筋形成を達成するために精巧な転写制御ネットワーク内のクロマチンリモデリング複合体と協力しています。この中で、MyoDのは、筋分化を誘発におけるマスター筋原性転写因子であると考えられます。この概念は、骨格筋細胞への非筋細胞に変換するのMyoDの能力によって強化されます。ここでは、MyoDのを識別するために使用される方法を説明します骨格筋分化に関与するさまざまな要因を解明するために、徹底的な方法でタンパク質パートナー。長期的な目的は、骨格筋遺伝子の制御、 すなわち 。、MyoDの標的に関与するエピジェネティックなメカニズムを理解することです。 MyoDのパートナーは骨格筋分化の間に、関連するパートナーの役割の検証に続いて、質量分析（MS）特性評価、に結合された異種システムからタンデムアフィニティー精製（TAP-タグ）を使用して識別されます。筋再生における先天性筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、横紋筋肉腫および欠陥：筋原性因子、またはそれらの異常調節の異常な形態は、筋障害の数と関連しています。このように、筋原性の要因は、両方の病気自体を引き起こすメカニズムおよび疾患の治療を改善することができ、回生機構に関しては、筋疾患における潜在的な治療標的のプールを提供しています。したがって、詳細なunderstan筋原性の要因によって制御分子間相互作用や遺伝的プログラムの鼎は、効率的な治療法の合理的な設計のために不可欠です。

Introduction

真核生物の多細胞生物は、異なる器官及び組織で構成されています。それぞれの機能的な組織は、各分化段階で決定される特定の遺伝子パターンの発現を有します。細胞分化は、特定の遺伝子の活性化、一般的にそれらの発現の維持、遺伝子、細胞増殖に関与するものなどの組のサイレンシングを含みます。骨格筋分化、または筋形成、すなわち筋芽細胞に中胚葉幹細胞の決意から始まり、従って、多段階のプロセスであり、最初の単核、その後多核、筋管へのこれらの筋芽細胞の分化をもたらします。このように、筋芽細胞はまだ増殖することが可能である細胞を、「決定」されているが、それらは、骨格筋系統にコミットしている、したがって、胚発生中または成体の筋再生のいずれかで、骨格筋細胞にのみ分化することができます。骨格筋端末の処理が異なりますentiationは、E2F標的遺伝子¹のような増殖関連遺伝子の明確なサイレンシングを導く筋芽細胞前駆細胞の細胞周期から永久出口から始まる特定の遺伝的プログラムによって調整されます。実際、最終分化のプロセスの間に、筋芽細胞の増殖停止は、骨格筋特異的遺伝子の発現と筋管²への筋芽細胞の融合の前に重要なステップです。このようなプログラムは、衛星細胞と呼ばれる成体筋幹細胞は、骨格筋損傷後の再生処理中に分化することが可能になります。

哺乳動物の筋形成は、筋原性塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスの家族に決定的に依存している（のbHLH）転写があるMyoD、Myf5の、MRF4とミオゲニン因子、頻繁に骨格筋決意因子またはのMRFの家族と呼ばれる（筋肉の調節因子^）3。それらの各々は、本明細書及びDIFにおいて重要な役割を果たしています骨格筋細胞のferentiationと特異的発現パターン^{4 5-7}ました。 Myf5のとのMyoDの活性化は、筋原系統に細胞をコミットする決定的なステップを構成し、ミオゲニンのその後の発現は、MCK（筋クレアチンキナーゼ）などの骨格筋特異的遺伝子の活性化と筋形成を誘発します。筋原性のbHLH転写因子は、以前にサイレント遺伝子座⁸から筋遺伝子の活性化におけるMEF2ファミリーのメンバーと協力します。彼らはまた、様々な遺伝子調節領域⁸に、いわゆるE-ボックスに結合するEタンパク質として知られているユビキタスのbHLHタンパク質とヘテロダイマー、E12とE47、などの骨格筋遺伝子の転写を刺激します。ねじれは、ID（分化の阻害剤）、および他の要因は、負^8結合 Eタンパク質についてのMyoDと競合することによって、このプロセスを調節します。

MyoDのは、筋肉分化を誘発するの主要なプレーヤーとして考えられている⁹ 10-13に筋原決意/分化（トランス分化）プログラムを誘導する能力を有しているので>アップ。確かに、のMyoDの強制発現は、異なる細胞型のトランス分化を誘導する別の発生学的起源¹²から誘導されるものです。例えば、MyoDのは、筋様細胞に肝細胞、線維芽細胞、メラノサイト、神経芽細胞、および脂肪細胞に変換することができます。 MyoDのトランス分化作用は、元の遺伝的プログラム（特に、増殖遺伝子）のサイレンシングに付随する非筋肉環境での筋原性遺伝的プログラム（特にその標的遺伝子）の異常な活性化を伴います。

筋芽細胞の増殖では、MyoDのは発現するが、それはそれらのプロモーター^14-16に結合する場合でも、その標的遺伝子を活性化することができませんされています。したがって、連続的に未分化の筋芽細胞で発現されるのMyoDの要件は非常にELUままSIVE。 MyoDのは、酵素^14,17を改造クロマチンを活性化のロード前に増殖する筋芽細胞における抑圧的なクロマチン修飾酵素の補充のためにその標的遺伝子を抑制することができます。例えば、筋芽細胞増殖に、MyoDのは、ヒストンH3のリジン9またはH3K9とH3K27 KMTsなどの転写コリプレッサーKAP-1、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）と抑圧的なリジンメチルトランスフェラーゼ（KMTs）、関連付けられている、と積極的にその標的遺伝子の発現を抑制され、局所的に抑圧的なクロマチン構造^14,17を確立^することもできます。重要なことは、最近の報告では、MyoDのは、直接そのトランス活性¹⁶の阻害をもたらすH3K9 KMT G9Aによってメチル化自体であることが示されました。

MyoDによる非筋細胞のこのトランス分化に関与するエピジェネティックなメカニズムは不明な点が多いです。特に、いくつかの細胞株は、MyoDの誘導性のトランス分化に耐性です。このように、HeLa細胞では、MyoDのは、非アクティブかのいずれかでありますでもによる複雑なSWI / SNF ¹⁸クロマチン再構築のBAF60Cサブユニットの発現の欠如にリプレッサーではなく、転写活性化因子として機能する可能性があります。このモデルは、より良好MyoDの誘導性の遺伝子抑制機構を特徴づけるために選択されることができます。それに関連するパートナーとその標的遺伝子座で抑圧的なクロマチン環境を誘導し、したがって、最終分化を微調整する筋芽細胞の増殖でのMyoD依存抑圧的なメカニズムを明らかにするのMyoDの能力を検定することも好適です。

ここでは、質量分析（MS）特性評価に結合されたタンデムアフィニティー精製（TAP-タグ）を使用してのMyoDパートナーを識別するためのプロトコルについて説明します。安定フラグ-HA-のMyoDを発現するHeLa-S3細胞の使用は、分別核抽出物からのMyoD複合体を精製するために十分な材料を入手することを許可しました。異種システムでのMyoDパートナーの同定はvalidatiが続きました関連するシステムで上。

Protocol

HeLa細胞-S3核塩抽出可能とクロマチン結合画分の調製

1. 細胞のコレクション
   1. 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン（成長を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中のHeLa-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HA（コントロール細胞株）を成長さ湿ったインキュベーター内で37℃で培地）および5％CO _2。
      注：空のベクター（ヒーラ-S3フラグ-HA）で形質導入したHeLa-S3細胞を安定に発現するフラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3細胞を、記載されたプロトコルを使用して確立することができたのいずれか^：19,20、または著者によって提供さ。
   2. 各細胞株（HeLa細胞-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HA細胞）の10完全にコンフルエント150ミリメートル皿に細胞を増幅します。
   3. 5 Lスピナーに（非接着亜集団が含まれている）、上清を収集します。
   4. 部屋のTEMで1分間細胞をトリプシン処理、150ミリメートル皿当たり10mlのPBSで付着亜集団を洗いますperature（0.05％トリプシン-EDTA溶液を、15cmのディッシュ2 ml）で。
   5. 150ミリメートル皿当たり培地4mlを加え、50ミリリットルチューブに細胞を収集します。
   6. （5 Lスピナーに）ステップ1.1.3からの上清を合わせ、ステップ1.1.5からの細胞は、各細胞株についての新鮮な予め加温した成長培地の500ミリリットルを追加します。
   7. 5 Lスピナーに細胞懸濁液を移し、湿ったインキュベーター中で37℃、5％CO ₂で少なくとも60時間、細胞を増殖させます。
   8. 新鮮な増殖培地の500ミリリットルを加え、24時間細胞を増殖させます。
   9. 新鮮な増殖培地の1リットルを加え、24時間細胞を増殖させます。
   10. 細胞を計数し、細胞生存率をチェックするために、細胞懸濁液1mlを取り出します。色血球計数器を用いて顕微鏡下で30青色の0.4％トリパンμlのカウント生きている（青ではない）細胞と細胞懸濁液の30μlの。
   11. 、毎日新鮮な成長培地を添加することによって、6×10 ⁵細胞/ ml - 2の細胞密度を保ちます1×10 ⁶細胞/ mlを超えません。最大1 5 Lスピナーのボリュームは2.5 Lです。
       注：以下の手順については、2のバッチにより進行-密度1×10 ⁶細胞/ mlで培養物の2.5 L。約20 Lを収集するために1.1.14 - 繰り返して、1.1.12ステップ 次のステップに進む前に、各細胞株の（乾燥ペレットの≈20グラム）。
   12. 4℃で5分間、500×gで遠心分離により細胞をペレット化し、上清を捨てます。
   13. ペレットを洗浄するために4℃で5分間、500×gでピペッティングし、遠心分離によって氷冷PBSの100ミリリットル中に細胞を再懸濁し。
   14. 50mlチューブに懸濁液を移し、4℃で5分間、500×gで遠心分離し、氷冷PBS 25mlで細胞を再懸濁することにより洗浄を繰り返します。
       注：細胞ペレットを直ちに使用するか、または液体窒素中で凍結し、数日間-80℃で保存することができます。
2. 核の単離
   注：手順1.2.1実行-低温室で1.4.3を。
   1. 事前冷却ブフェRSとホモジナイザー。
   2. 凍結した材料を使用する場合は、すぐに37℃の水浴中で細胞ペレットを解凍。
   3. 再懸 ​​濁し20 gで20 ml単位セルの（≈20ml）で、次いで、次いで、5ミリリットル追加、最初に緩衝液10mlを用いて加算することにより低張緩衝液A（ 表3）の（細胞ペレットのサイズに等しい体積）別の5ミリリットル。細胞の最大値を取得するために、新鮮な緩衝液でよくピペットを洗ってください。
   4. タイトフィット乳棒で予備冷却ホモジナイザーへの転送40ミリリットルの細胞懸濁液。
   5. ホモジナイザーで20ストローク（中や動きアウト20）で細胞をホモジナイズし、50mlチューブに細胞懸濁液を転送します。
   6. セルの最大を回復するために、ショ糖バッファ（初期セル容量の1/3、 表3）の7ミリリットルでホモジナイザーを洗ってください。核を維持し、漏れを制限するために、ステップ1.2.5から50ミリリットルチューブに迅速にこの懸濁液を転送します。
   7. 0.4％TRの30μlの30μlのアリコートを染色（溶解が成功した場合、すべての核は青でなければならない）溶解効率を制御するために、顕微鏡下で分析し、青ypan。必要に応じて、均質化工程を繰り返します。
   8. 核をペレット化する万×gで4℃で7分間遠心分離します。細胞質画分として上清を保存します。
3. 原子力塩抽出可能（SE）画分の調製
   1. ショ糖バッファー（核ペレットのサイズに等しい体積）8mlに核ペレットを再懸濁します。 300mMのNaClの最終濃度を得るために渦に徹底的に高塩緩衝液の8ミリリットル（1核ペレットの量は 、 表3）を混合しながら一滴ずつ加えます。氷上で30分間インキュベートし、5分ごとに混ぜます。
   2. ショ糖バッファの8ミリリットル（総容量の1/3）を添加することにより150mMのにNaCl濃度を減少させます。 13,000×gで4℃で10分間遠心分離します。上清（核塩抽出物画分、SE）を収集します。
      注：いずれかのSEを1.3.3ステップまたは残すために進んでクロマチン結合画分と両方の画分を同時にその後、超遠心機の準備中に氷の上で分数。
   3. 4℃で85,000×gで30分間超遠心SE。上清（≈26ミリリットル）を取ります。
   4. 液体窒素中で100μlのアリコートを凍結します。抽出物の残りの部分を使用して、2「タンパク質複合体の精製」をステップに進みます。
      注：アリコートは、ステップ5.1.1の間、入力制御として使用されます。
4. クロマチン結合画分の調製
   1. （ステップ1.3.5から。）ペレットを再懸濁細心の注意を払ってスクロースバッファの7ミリリットル（ペレットのサイズに等しい体積）に。
   2. MNase（ステップ1.4.4）を活性化し、混合するために1 mMの（サスペンションの14ミリリットルのための0.5MのCaCl ₂の28μL）の最終濃度までのCaCl _2を追加_します。
   3. 37℃で1分間プレヒートサスペンション。
   4. 0.5から0.0025 U /μlの最終濃度（1/200希釈を得るために70μlのにミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）を追加U /μlのストック）と混ぜます。
   5. 37℃で正確に12分間インキュベート。すべての4分を混ぜます。
   6. 直ちに氷上に反応を配置します。
   7. MNaseの活動を停止するには、4 mMの最終濃度が0.5 M EDTA pHが8.0（1/125希釈）の112μlを添加します。氷上で5分間インキュベートします。
   8. 2超音波処理の間の高振幅で1分間超音波処理を5回には、1分（合計10分）の休憩を可能にします。
   9. 85,000×gで、4℃で30分間超遠心機。
   10. 上清（ヌクレオソーム濃縮画分、NE、≈12ミリリットル）を収集します。
   11. 液体窒素中で50μlのアリコートを凍結します。抽出物の残りの部分を使用して、2「タンパク質複合体の精製」をステップに進みます。
       注：アリコートは、ステップ5.1.1の間、入力制御として使用されます。

2.タンパク質複合体の精製

注：各細胞株（HeLa細胞-S3フラグ-HA-のMyoDおよび制御、HELから並列抽出物に進みます-S3フラグ-HA）。

1. FLAG-ベースの精製
   1. プレウォッシュフラグ樹脂。各実験点（各細胞株のためのSEおよびNE画分）のために（商業50％ストックから）旗樹脂600μlのを使用してください。
   2. 転送15ミリリットルチューブに樹脂、冷たいTEGN（ 表3）の13ミ ​​リリットルで再懸濁し、千×gで2分間遠心分離し、上清を除去します。 5回繰り返します。最後の洗浄再懸濁フラグ樹脂後TEGN等量の（各実験点について300μlの）へ。
   3. 各実験点について、（NEおよびそれぞれ26ミリリットルSE画分、50 mlチューブに12ミリリットルのための15ミリリットルチューブ中）600洗浄した旗樹脂μlの対応するタンパク質抽出物を混ぜます。 4℃で回転ホイールの一晩でインキュベートします。
   4. 4℃で千×gで2分間遠心分離し、脇上清を入れて、浄化効率試験（2.2）の結果まで4℃で維持。
   5. SEのサンプルについては、フラグ樹脂を再懸濁TEGNの4ミリリットルで、15 mlチューブに移します。ビーズを失うことを避けるために、同じ15ミリリットルチューブに移し、この手順を毎回3回繰り返します。千×gで遠心分離し、2分、4℃、上清を除去します。
   6. ウォッシュ旗樹脂15mlチューブで7回TEGNの13ミリリットルを使用して、1,000×gで4℃で2分間遠心分離します。
   7. 最後の洗浄後、1ミリリットルTEGNで再懸濁し、1.5ミリリットルに低結合チューブを移します。千×gで遠心分離し、2分、4℃、上清を除去します。
   8. 各実験点についてのpH 7.8で4ミリグラム/ mlのFlagペプチド溶液200μlで再懸濁。ビーズおよびペプチドを混ぜます。 TEGN緩衝液200μlを加え、結合したタンパク質を溶出するために、少なくとも4時間または一晩4℃でインキュベートします。
   9. 4℃で千×gで2分間遠心分離し、樹脂及び上清（フラグ溶出液）2 mlチューブに配置された空のスピンカラムに移します。
   10. 遠心分離カラムは、2ミリリットルチューブに左オーバー上清を収集します。
   11. カラムにTEGNバッファを追加することにより、フラグ樹脂を収集し、各実験点のために4℃で一晩Flagペプチド溶液200μl（4 mg / mlで）を有する第二旗溶出に進みます。
   12. 2回目の溶出を収集するために2.1.10 - 繰り返して、2.1.9を繰り返します。第一および第二の溶出液を兼ね備えています。
2. 浄化効率のテスト
   注：ステップ2.1.11の間に - 2.1.12、SDS-PAGEおよび銀染色（ - 2.2.2 2.2.1）を行います。
   1. 溶出液の15μLを取り、4倍のローディングバッファーを5μlと還元剤を10倍の2μlを添加、96℃で5分間沸騰させ、SDSポリアクリルアミド4実行 - 製造業者の説明書に従って、12％ゲルを。
   2. 銀染色キットを用いてゲルを染色（製造元の指示に従ってください）​​。旗-HA-のMyoDとフラグ-HA間のタンパク質パターンにおける明確な違いモック溶出液、旗-HAのMyoDの特定のバンドがある場合（50 kDaの、 図1Aの周り）、次のSTEに進みますP。
3. 赤血球凝集素（HA）は、精製をベース
   1. TEGNの13ミリリットル中に再懸濁し、4℃で千×gで2分間遠心分離し、15ミリリットルチューブに転送することにより洗浄HA樹脂。洗浄工程を5回繰り返します。 TEGNバッファ等量の中で最後の洗浄再懸濁ビーズの後。
      注：ボリュームが旗ベースの精製の効率に応じて調整する必要があります。各実験点のための市販の50％の株式から300μlで開始します。
   2. 1.5ミリリットル低い結合チューブに各実験点のHA樹脂を転送します。 4℃で千×gで遠心分離し、2分間、洗浄緩衝液（ 表3）の最大値を排除し、HA樹脂に旗ベースの精製からの溶出液を追加します。
   3. 4℃で回転ホイールの一晩にチューブをインキュベートします。
   4. 4℃で千×gで2分間遠心分離は、上清を脇に置くと、浄化効率試験の結果まで4℃で維持（2.3.12）。
   5. リ1.5mlチューブを結合新しい低に転送、TEGNの0.5ミリリットルでHA樹脂を一時停止します。千×gで4℃でビーズや遠心分離機2分の損失を避けるために一度に同じ1.5mlチューブに追加し、再懸濁を繰り返します。上清を取り除きます。
   6. ウォッシュ（ビーズを失うことを避ける）千×gで4℃で2分間遠心分離し、上清を除去し、TEGNの1ミリリットルを毎回使用して8回ビーズ。最後の洗浄後、0.5ミリリットルチューブにビーズを移します。
   7. できるだけ多くの上清を取り除きます。結合したタンパク質を溶出するビーズ上のpH 7.8でのHA遊離ペプチド溶液（4mg / mL）の100μLを加えます。 4℃で一晩回転ホイール上でインキュベートします。
      注：HAペプチドの量は、複合体の存在量に応じて調整する必要があります。
   8. 4℃で千×gで2分間遠心し、2 mlチューブに配置された空のスピンカラムに樹脂および上清（HA溶出液）を転送。
   9. 2ミリリットルチューブに左オーバー上清を回収し、カラムを遠心します。
   10. 各実験点のHAペプチド100μlの（4 mg / mlで）との2回目の溶出を実行します。 4℃で一晩回転ホイール上でインキュベートします。繰り返しステップ2.3.8 - 2.3.9は、2回目の溶出を収集します。
   11. 第一および第二の溶出液を兼ね備えています。
   12. SDS-PAGE及び銀染色による試験精製効率（ステップ2.2を参照してください。）（ 図1A）。
   13. 製造者の指示に従って10 kDaのカットオフ（公称分子量限界、NMWL）を用いて遠心分離フィルターユニットを用いて30μlにHA溶出液を濃縮します。
   14. 22.5（3/4）7.5（1/4）μL：二つの部分に集中し、サンプルを分割します。スナップは、-80℃で液体窒素とストア内のサンプルの1/4を凍結します。ステップ3のための3/4の部分を使用してください。
       注：1/4凍結部分はウェスタンブロットによる質量分析結果を確認するために使用される（ステップ5.1参照）。

3.質量分析

注：次の手順は、分析を実行する質量分析施設で議論されるべきです。

1. 4Xローディング緩衝液の7.5μlのと10倍還元剤の3.3μlのサンプルの3/4（22.5μl）を補足し、96℃で5分間沸騰させます。
2. 12％ゲル - SDSポリアクリルアミド4の負荷サンプル。すべてのタンパク質が分離せずにゲルを入力できるようにするために5分間150 V一定でゲルを実行します。
3. 水でゲルを洗浄し;超きれいな水に一定のゲルを5回洗浄後、固定液（10％酢酸、50％メタノール、40％超きれいな水）と30分 - 20のために固定します。
4. 1.5mlチューブに水1ml中のタンパク質、店舗を含むバンドをカットし、質量分析施設に送ります。

4.データ解析

注：これは、分析のための一般的なガイダンスです。正確な手順は、MS機能によって与えられたデータの特定のモードに依存します分析を実行するために使用される（ 例えば^{、21,22）。}

1. ネガティブコントロールの準備を対応から得られたリストで「MyoDの "溶出液中の同定されたタンパク質のリストを比較してください。分析から、両方のリストに見出されるタンパク質を除外します。
2. 残りのリストから同定されたペプチドの≤2総数を有するタンパク質を除去します。
3. アクセス機能注釈とDAVIDバイオインフォマティクスリソースを使用して、タンパク質の得られたリストの機能分類（http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp）およびタンパク質^23,24のリストを分類します。
4. （オプション）負DNA ²⁵に帯電する強い結合不定で非核タンパク質の荷電リスト「ヒッチハイカー」から削除します。これらは、細胞骨格、細胞質、ミトコンドリア、膜および受容体タンパク質を含有する（タンパク質の折り畳み、 表1における細胞骨格およびその他のグループタンパク質および2）。</李>
5. 各画分（ 図2）に特異的な共通のタンパク質およびタンパク質を同定するためにSEとNE画分からのMyoDの相互作用の得られたリストを比較。

ウエスタンブロットによって識別されるインターアクターの5確認

1. HeLa細胞-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HAで確認
   1. 氷の上でステップ2.3.14で得られた溶出液のサンプル（7.5μl）を解凍します。 TEGNバッファー12μlの、4Xローディング緩衝液10μlと還元剤の10倍の3μLを加えます。 96℃で5分間沸騰サンプル。
   2. ウェスタンブロッティングのために入力サンプルを準備します。
      1. ステップ1.3.9と1.4.11からのアリコートを解凍し、BCAキットを（製造元の指示に従ってください）​​を使用して、例えば、タンパク質濃度を測定します。
      2. レーンあたり15μgのタンパク質を使用してください。抽出物の適切な量を測定し、TEGNバッファーで15μlのまでのサンプルの音量を調整します。
      3. 5μlの4倍のローディングバッファーを追加し、1.5μlの10倍還元剤。 96℃で5分間沸騰サンプル。
   3. 溶出液のサンプル15μLを使用して（MS分析中に識別パートナー候補に特異的）目的の抗体を用いたウエスタンブロット分析を実行します。内因性タンパク質レベル（ 図3A）の制御などの入力抽出物を使用してください。
2. 関連するセルラーシステムで確認
   1. C2C12マウス筋芽細胞の全核抽出物の調製。
      1. 湿ったインキュベーター中で37℃、5％CO ₂で15％ウシ胎児血清を補充したDMEM培地、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンでC2C12マウス筋芽細胞を成長させます。増殖状態で細胞を維持するために、80％の細胞集密度を超えないようにしてください。
      2. 免疫沈降（IP）の一点（1抗体）のために、C2C12の少なくとも二つの150mmディッシュを成長させます。培地を吸引除去し、10mlのPBSで細胞を2回洗浄します。
      3. 細胞をこすり落とし、15ミリリットルチューブに集めます。 Ceの4℃で5分間、250×gでntrifuge。上清を捨てます。
      4. 細胞ペレット（= V _電池 ）の容量を見積もります。静かに細胞質膜（ 表3）を破壊する低張緩衝液Bの3体積V _セルにペレットを再懸濁します。
      5. 1％（v / v）の最終濃度に達するように10％のNP-40の0.44のx V _細胞ボリュームを追加します。穏やかに混合するためにチューブを数回転倒。
      6. 核整合性を保持するために、SR（ 表3）の0.89のx V _電池容量を追加します。静かに核をペレット化するために2000×gで5分間サスペンション、および遠心分離機を均質化するために、チューブを数回転倒。
      7. 上清（細胞質画分）を取り外します。核ペレット（= V _NUC）の量を推定します。ショ糖バッファの1体積V _NUCに核ペレットを再懸濁。
      8. 300mmの最終濃度を得るために、高塩緩衝液の渦1体積V _NUCに徹底的に混合しながら一滴ずつ追加します。NaClを、氷上で30分間インキュベートします。 5分ごとに混ぜます。
      9. （150mMのにNaCl濃度を減少させる）スクロース緩衝液の容積V _NUCを追加のCaCl _2（最終濃度1mMの）。ミックス。
      10. 予熱懸濁液を37℃で1分間、濃度0.0025 U /μL（0.5 U /μlにストックから1/200）の最終的な取得するミクロコッカスヌクレアーゼを追加します。ミックス。
      11. 37℃で正確に12分間インキュベート。 3分毎に混ぜます。
      12. 直ちに氷上に反応を配置し、MNaseの活動を停止するために、EDTA（最終濃度4 mm）を追加します。氷上で5分間インキュベートします。
      13. 超音波処理、高振幅で0.5分間、5回。 2超音波処理の間に、0.5分（合計で5分）の休憩を可能にします。
      14. 85,000×gで、4℃で30分間超遠心機。上清（総核抽出物）を収集します。
      15. 例えばBCAキットを用いて、総核抽出物のタンパク質濃度を測定する（製造者の指示に従う）とimmediatを続行エリー5.2.2に進みます。
   2. 内因性のMyoDの免疫沈降（IP）。
      1. 、エキスクリアプレ各IP点についてプロテインGアガロースビーズを10μlを洗浄します。
         1. 1.5ミリリットルチューブにプロテインGアガロースビーズの必要な量を移し、冷たいTEGNの1.4ミリリットルで再懸濁し、1,800×gで2分間遠心分離し、上清を除去します。 3回繰り返します。
      2. 総核抽出物の適切な量で予め洗浄したプロテインGアガロースビーズを混ぜます。 IP点当たりの総核抽出タンパク質500μgのを使用してください。
      3. 抽出物を事前にクリアするために2時間4℃で回転ホイール上でインキュベートします。
      4. 4℃で1800×gで5分間遠心分離します。上清を保管してください。
      5. 1.5ミリリットルで500μgのプレクリア総核抽出物低結合管を5のMyoD抗体のμgのまたはウサギIgG5μgのを混ぜます。 TEGNが1ミリリットルまでバッファに追加します。 4℃で一晩回転ホイール上でインキュベートします。
         注：Fを実行しますステップ5.2.2.3時の手順をollowing。
      6. IPポイントごとに予洗7.5μlのプロテ​​インA / Gストックビーズ溶液を。
         1. 2分間、4℃で1800×gで、1.5ミリリットルチューブにTEGNと遠心分離機の1ミリリットル中に再懸濁ビーズをビーズの必要な量を転送します。上清を取り除きます。 3回繰り返します。
      7. ブロッキング溶液1.5 ml溶液に再懸濁し、タンパク質A / Gビーズ（ 表3）と4℃で回転ホイールの一晩のインキュベート。
      8. 4℃で10分間16,000×gでABS（ステップ5.2.2.5）と共にインキュベートし、遠心分離総核抽出物。上清を保管してください。
      9. 遠心分離機は、4℃で2分間、1800×gでプロテインA / G樹脂（ステップ5.2.2.7）を遮断しました。 TEGN緩衝液1mlで上清と再懸濁を捨てます。再び遠心分離し、4℃で2分間1800×gでブロッキング緩衝液洗い流すします。
      10. 再懸濁は、7.5μlのBLOを得るために新しい低タンパク質結合チューブにTEGNバッファとアリコート1mlのプロテ​​インA / G樹脂をブロックIPポイントごとckedプロテインA / G樹脂。 2分間、4℃、1,800×gで遠心分離し、上清のできるだけ多くを削除。
      11. A / G樹脂にABS（またはコントロールIgG）とインキュベートし、総核抽出物を追加します。混合し、回転ホイール上で室温（RT）で2時間インキュベートします。
      12. 2分間、室温で遠心分離サスペンション1800×gで。上清を、新しい低結合チューブに洗浄バッファーと転送懸濁液1ml中に再懸濁を捨てます。 5分間回転ホイール上で室温でインキュベートします。
      13. 2分間室温で1800×gで、洗浄用緩衝液1ml中に再懸濁での遠心分離サスペンションと5分間回転ホイール上で室温でインキュベートします。 4回繰り返します。新しい低い結合チューブに最後の洗浄転送のため。
      14. 上清の最大値を削除します。 、洗浄バッファーの7μlを、4倍のローディングバッファーの7μlのビーズに還元剤を10倍3μlを添加混合し、96℃で5分間沸騰させます。
      15. int型の抗体を用いてウェスタンブロット分析を実行erest（免疫のためのパートナー候補に特異的なタンパク質を沈殿させました）。内因性タンパク質レベル（ 図3B）の制御等の入力抽出物の1％（5μgの）を使用します。

Results

MyoDの活性の調節を理解するために、我々は、質量分析（MS）、続いてのMyoDの二重タグ付けされた形の免疫精製に基づいて、生化学的精製を用いてのMyoD複合体の網羅的特徴付けを行いました。フラグ-HAタグ付きのMyoDとフラグ-HA-のMyoDの二アフィニティー精製を行うことにより、MyoDの複合体を精製するための十分な材料を得るためにフラグ-HA許可を発​​現する対照細胞株を発現するHeLa-S3細胞株の使用。

私たちは、その後、さらに塩抽出（核塩抽出性、SE）に核画分を分画し、ヌクレオソーム（ヌクレオソームに富む、NE）の画分について濃縮、細胞質および核画分に細胞抽出物を分画しました。これらの分離した核画分（ 図1、表1および2）からのTAPタグの精製は、比較的低いABを持つパートナーを解明許可しました一つの特定の核内コンパートメントに局在undance。さらに、このような戦略...

Discussion

提示された方法は、転写因子、のMyoDのパートナーの網羅的同定を可能にします。これは、MyoDの誘導性の分化、すなわちのHeLa-S3細胞に耐性異種システムでのMyoDパートナーを明らかにしました。したがって、定義により、識別されたのMyoDのパートナーは、遍在的に発現されています。これらは一般的かつ配列特異的な転写因子、クロマチン修飾酵素、RNA処理タンパク質キナーゼ（ 表1および2）が挙げられます。 HeLa-S3細胞はMyoDの誘導性のトランス分化に耐性があるので、MyoDの活性は、主に抑圧され、識別されたパートナーは、MyoDのコリプレッサーである可能性が高いです。これは、MyoDのトランス能力^8を阻害することが知られているのIdタンパク質（ 表1および表 2、図2）の存在によって強調されています。重要なことは、このような抑圧的な状態は、筋芽細胞増殖にMyoDの状況に対応しています。確かに、我々はCBFβ、のMyoDとそのMyoDの相互作用...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<ストロング>細胞株
HeLa-S3	ATCC	CCL-2.2
C2C12	ATCC	CRL-1772
<ストロング>機器
スピナー	コーニング	778531
ホモジナイザー: ダウンスホモジナイザー	ウィートン	432-1273および432-1271
スピナー用攪拌装置ベル	コ	778531
ソニケー	ターDiagenodeUCD200
血球計算盤	マリエンフェルドスーペリア	640610
低結合チューブ	Sorenson	27210
空のスピンカラム	Bio-Rad	7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel	Life technologies	NP0336BOX
4x loading buffer	ライフテクノロジー	NP0007
10倍還元剤	ライフテクノロジー	NP0004
銀染色キット	ライフテクノロジー	ズ A8592
遠心フィルターユニット、10K	ミリポア	UFC501024
プロテイン G アガロース ビーズ	Sigma-Aldrich	P4691
プロテイン A/G 樹脂	Thermo Scientific	53132
フラッグ樹脂(抗フラッグ M2-アガロースアフィニティーゲル)	Sigma-Aldrich	A2220
HA 樹脂(モノクローナル抗 HA アガロース)	Sigma-Aldrich	A2095
MNase	Sigma-Aldrich	N3755
フラッグフリーペプチド (DYKDDDDK)	Ansynth Service BV	カスタム合成	50 mM で最大 4 mg/ml を再懸濁Tris-HCl、pH 7.8
HAフリーペプチド(YPYDVPDYA)	Ansynth Service BV	カスタム合成	50 mM Tris-HCl、pH 7.8
ビシンコニン酸ベースのタンパク質アッセイキット:BCAキット	Thermo Scientific	23225
プロテアーゼ阻害剤	Sigma-Aldrich	S8830
ルミノールベースの強化化学発光(ECL)HRP基質	生命技術	34075
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
剪断されたサケ精子 DNA (サケ精巣由来のデオキシリボ核酸ナトリウム塩)	Sigma-Aldrich	D1626
スペルミン四塩酸塩	Sigma-Aldrich	S1141
スペルミジン	Sigma-Aldrich	S0266
グリセロール	Sigma-Aldrich	G5516
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
MOPS ランニングバッファー	ライフテクノロジー	NP0001
DMEM (高グルコース)	Sigma-Aldrich	D0822	予温  at 37 °C使用前に
トリプシンEDTA(0.05%フェノールレッド	テクノロジー25300-054
	GEヘルスケアライフサイエンス	PAA A15-102	血清の各ロットは、最初に細胞についてテストする必要があります。
ペニシリンとストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-122
トリパンブルー溶液、0.4%	ライフテクノロジー	ズ 15250-061
水(滅菌ろ過)	シグマ・アルドリッチ	W3500
<ストロング>抗体
HA ラット(12CA5)	ロシュ	・11583816001
・フラッグ	シグマ・アルドリッチ	A8592
MyoD	Santa Cruz	sc-32758	ウェスタンブロッティングに使用
MyoD	Santa Cruz	SC-760	免疫沈降およびウェスタンブロッティングに使用
CBFbeta	Santa Cruz	FL-182
HP1alpha	Euromedex	2HP2G9
HP1beta	Euromedex	1MOD1A9AS
HP1gamma	Euromedex	2MOD1GC
Suv39h1	Cell Signaling Technology	8729
BAF47	BD Biosciences	612111
Myf5	Santa Cruz	SC-302
Tubulin	Sigma-Aldrich	T9026
Actin	Sigma-Aldrich	A5441
IgG マウス	Santa Cruz	SC-2025
IgG Rabbit	Santa Cruz	SC-2027
ヤギ反ラット -HRP	Sigma-Aldrich	A9037
ヤギ反ウサギ -HRP	Sigma-Aldrich	A6154
ヤギ抗マウス-HRP	シグマ-アルドリッチ	A4416