MyoDは、多くの完全に分化した非筋肉細胞株の筋原性分化転換を誘導する強力な能力を持つ筋原性転写因子です。この分化転換に関与するエピジェネティックなメカニズムは、ほとんどわかっていません。ここでは、MyoDパートナーを網羅的に特性評価するためのダブルアフィニティー精製法とそれに続く質量分析法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
骨格筋分化は、筋芽細胞への多能性中胚葉前駆細胞のコミットメントから始まります。これらの細胞はまだ増殖する能力を持っているか、彼らは筋線維を形成するために、さらに成熟さ多核筋管に分化するとヒューズができます。骨格筋分化は、様々な転写因子の協調作用によって編成され、特に筋肉調節因子またはMRFは（のMyoD、ミオゲニン、Myf5の、およびMRF4）のメンバーは、また、筋原性のbHLH転写因子ファミリーと呼ばれます。これらの要因は、骨格筋形成を達成するために精巧な転写制御ネットワーク内のクロマチンリモデリング複合体と協力しています。この中で、MyoDのは、筋分化を誘発におけるマスター筋原性転写因子であると考えられます。この概念は、骨格筋細胞への非筋細胞に変換するのMyoDの能力によって強化されます。ここでは、MyoDのを識別するために使用される方法を説明します骨格筋分化に関与するさまざまな要因を解明するために、徹底的な方法でタンパク質パートナー。長期的な目的は、骨格筋遺伝子の制御、 すなわち 。、MyoDの標的に関与するエピジェネティックなメカニズムを理解することです。 MyoDのパートナーは骨格筋分化の間に、関連するパートナーの役割の検証に続いて、質量分析（MS）特性評価、に結合された異種システムからタンデムアフィニティー精製（TAP-タグ）を使用して識別されます。筋再生における先天性筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、横紋筋肉腫および欠陥：筋原性因子、またはそれらの異常調節の異常な形態は、筋障害の数と関連しています。このように、筋原性の要因は、両方の病気自体を引き起こすメカニズムおよび疾患の治療を改善することができ、回生機構に関しては、筋疾患における潜在的な治療標的のプールを提供しています。したがって、詳細なunderstan筋原性の要因によって制御分子間相互作用や遺伝的プログラムの鼎は、効率的な治療法の合理的な設計のために不可欠です。
概要
真核生物の多細胞生物は、異なる器官及び組織で構成されています。それぞれの機能的な組織は、各分化段階で決定される特定の遺伝子パターンの発現を有します。細胞分化は、特定の遺伝子の活性化、一般的にそれらの発現の維持、遺伝子、細胞増殖に関与するものなどの組のサイレンシングを含みます。骨格筋分化、または筋形成、すなわち筋芽細胞に中胚葉幹細胞の決意から始まり、従って、多段階のプロセスであり、最初の単核、その後多核、筋管へのこれらの筋芽細胞の分化をもたらします。このように、筋芽細胞はまだ増殖することが可能である細胞を、「決定」されているが、それらは、骨格筋系統にコミットしている、したがって、胚発生中または成体の筋再生のいずれかで、骨格筋細胞にのみ分化することができます。骨格筋端末の処理が異なりますentiationは、E2F標的遺伝子1のような増殖関連遺伝子の明確なサイレンシングを導く筋芽細胞前駆細胞の細胞周期から永久出口から始まる特定の遺伝的プログラムによって調整されます。実際、最終分化のプロセスの間に、筋芽細胞の増殖停止は、骨格筋特異的遺伝子の発現と筋管2への筋芽細胞の融合の前に重要なステップです。このようなプログラムは、衛星細胞と呼ばれる成体筋幹細胞は、骨格筋損傷後の再生処理中に分化することが可能になります。
哺乳動物の筋形成は、筋原性塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスの家族に決定的に依存している（のbHLH）転写があるMyoD、Myf5....
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プロトコル
HeLa細胞-S3核塩抽出可能とクロマチン結合画分の調製
- 細胞のコレクション
- 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン（成長を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中のHeLa-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HA（コントロール細胞株）を成長さ湿ったインキュベーター内で37℃で培地）および5％CO 2。
注：空のベクター（ヒーラ-S3フラグ-HA）で形質導入したHeLa-S3細胞を安定に発現するフラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3細胞を、記載されたプロトコルを使用して確立することができたのいずれか：19,20、または著者によって提供さ。 - 各細胞株（HeLa細胞-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HA細胞）の10完全にコンフルエント150ミリメートル皿に細胞を増幅します。
- 5 Lスピナーに（非接着亜集団が含まれている）、上清を収集します。
- 部屋のTEMで1分間細胞をトリプシン処理、150ミリメートル皿当たり10mlのPBSで付着亜集団を洗いますperature（0.05％トリプシン-EDTA溶液を、15cmのディッシュ2 ml）で。
- 150ミリメートル皿当たり培地4mlを加え、50ミリリットルチューブに細胞を収集します。
- （5 Lスピナ....
- 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン（成長を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中のHeLa-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HA（コントロール細胞株）を成長さ湿ったインキュベーター内で37℃で培地）および5％CO 2。
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結果
MyoDの活性の調節を理解するために、我々は、質量分析（MS）、続いてのMyoDの二重タグ付けされた形の免疫精製に基づいて、生化学的精製を用いてのMyoD複合体の網羅的特徴付けを行いました。フラグ-HAタグ付きのMyoDとフラグ-HA-のMyoDの二アフィニティー精製を行うことにより、MyoDの複合体を精製するための十分な材料を得るためにフラグ-HA許可を発現する対照細胞株を発現するHeLa-S3細胞株の使用。
私たちは、その後、さらに塩抽出（核塩抽出性、SE）に核画分を分画し、ヌクレオソーム（ヌクレオソームに富む、NE）の画分について濃縮、細胞質および核画分に細胞抽出物を分画しました。これらの分離した核画分（ 図1、表1および2）からのTAPタグの精製は、比較的低いABを持つパートナーを解明許可しました一つの特定の核内コンパートメントに局在undance。さらに、このような戦略.......
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ディスカッション
提示された方法は、転写因子、のMyoDのパートナーの網羅的同定を可能にします。これは、MyoDの誘導性の分化、すなわちのHeLa-S3細胞に耐性異種システムでのMyoDパートナーを明らかにしました。したがって、定義により、識別されたのMyoDのパートナーは、遍在的に発現されています。これらは一般的かつ配列特異的な転写因子、クロマチン修飾酵素、RNA処理タンパク質キナーゼ（ 表1および2）が挙げられます。 HeLa-S3細胞はMyoDの誘導性のトランス分化に耐性があるので、MyoDの活性は、主に抑圧され、識別されたパートナーは、MyoDのコリプレッサーである可能性が高いです。これは、MyoDのトランス能力8を阻害することが知られているのIdタンパク質（ 表1および表 2、図2）の存在によって強調されています。重要なことは、このような抑圧的な状態は、筋芽細胞増殖にMyoDの状況に対応しています。確かに、我々はCBFβ、のMyoDとそのMyoDの相互作用.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
Ait-Si-Ali研究室での作業は、Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon)の支援を受けました。国立がん研究所(INCa);Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC);Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC);CNRSの;パリ・ディドロ大学と「私は誰ですか?」Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071は、助成金 #ANR-11-IDEX-0005-01の下でANRが運営する「Investments for the Future」プログラムを通じてフランス政府から資金提供を受けています。EBはINCaの助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <ストロング>細胞株 | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| <ストロング>機器 | |||
| スピナー | コーニング | 778531 | |
| ホモジナイザー: ダウンスホモジナイザー | ウィートン | 432-1273および432-1271 | |
| スピナー用攪拌装置ベル | コ | 778531 | |
| ソニケー | ターDiagenodeUCD200 | ||
| 血球計算盤 | マリエンフェルドスーペリア | 640610 | |
| 低結合チューブ | Sorenson | 27210 | |
| 空のスピンカラム | Bio-Rad | 7326204 | |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12% gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4x loading buffer | ライフテクノロジー | NP0007 | |
| 10倍還元剤 | ライフテクノロジー | NP0004 | |
| 銀染色キット | ライフテクノロジー | ズ A8592 | |
| 遠心フィルターユニット、10K | ミリポア | UFC501024 | |
| プロテイン G アガロース ビーズ | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| プロテイン A/G 樹脂 | Thermo Scientific | 53132 | |
| フラッグ樹脂(抗フラッグ M2-アガロースアフィニティーゲル) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA 樹脂(モノクローナル抗 HA アガロース) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| フラッグフリーペプチド (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | カスタム合成 | 50 mM で最大 4 mg/ml を再懸濁Tris-HCl、pH 7.8 |
| HAフリーペプチド(YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | カスタム合成 | 50 mM Tris-HCl、pH 7.8 |
| ビシンコニン酸ベースのタンパク質アッセイキット:BCAキット | Thermo Scientific | 23225 | |
| プロテアーゼ阻害剤 | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| ルミノールベースの強化化学発光(ECL)HRP基質 | 生命技術 | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| 剪断されたサケ精子 DNA (サケ精巣由来のデオキシリボ核酸ナトリウム塩) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| スペルミン四塩酸塩 | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| スペルミジン | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS ランニングバッファー | ライフテクノロジー | NP0001 | |
| DMEM (高グルコース) | Sigma-Aldrich | D0822 | 予温 at 37 °C使用前に |
| トリプシンEDTA(0.05%フェノールレッド | テクノロジー25300-054 | ||
| GEヘルスケアライフサイエンス | PAA A15-102 | 血清の各ロットは、最初に細胞についてテストする必要があります。 | |
| ペニシリンとストレプトマイシン | ライフテクノロジー | 15140-122 | |
| トリパンブルー溶液、0.4% | ライフテクノロジー | ズ 15250-061 | |
| 水(滅菌ろ過) | シグマ・アルドリッチ | W3500 | |
| <ストロング>抗体 | |||
| HA ラット(12CA5) | ロシュ | ・11583816001 | |
| ・フラッグ | シグマ・アルドリッチ | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | ウェスタンブロッティングに使用 |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | 免疫沈降およびウェスタンブロッティングに使用 |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG マウス | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| ヤギ反ラット -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| ヤギ反ウサギ -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| ヤギ抗マウス-HRP | シグマ-アルドリッチ | A4416 |
参考文献
- Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
- Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regul....
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