miRNAを用いた乳がん組織におけるmiRNA発現の臨床病理学的解析<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

サマリー

ここでは、miRNA in situハイブリダイゼーションを使用して乳がん患者サンプルのmiRNA発現を検出するためのプロトコルを紹介します。

要約

この記事では、ジゴキシゲニン標識LNA(Locked Nucleic Acid)プローブを用いたin situハイブリダイゼーションを使用した乳がん組織におけるmiRNA検出の詳細なプロトコールについて説明します。このプローブは、抗DIGアルカリホスファターゼ抗体によって認識され、後に蛍光シグナルを生成するアルカリホスファターゼ基質を使用して開発されました。ここでは、miRNA in situハイブリダイゼーション(MISH)技術を利用して、乳がん患者の組織におけるmiR-489の発現を解析しました。この手法は、個々の組織サンプルにおける目的のmiRNAの局在を検出できます。この手法は、腫瘍組織における目的のmiRNAの発現を隣接する正常組織における発現と比較し、このmiRNAの発現に関与する特異的構造を特定するために使用できます。この手法は、がんの発生における特定のmiRNAの役割など、特定の臨床上の疑問に答えるのに非常に役立ちます。私たちの結果は、乳腺上皮細胞が隣接する腫瘍細胞よりも有意に高いレベルのmiR-489を発現することを示しています。

概要

乳がんは世界中の女性人口に影響を与える最も一般的な悪性腫瘍の一つです。乳癌の130万以上の例は世界的に毎年^1,2報告されています。腫瘍細胞は、伝統的に、生物学的に均一で高い増殖性とみなされてきたが、乳癌は遺伝的および臨床的に不均一であることが明らかになってきています。流行している抗がん剤に対する耐性は、癌の進行と距離転移³のその促進を通じ、大多数の患者の死亡率につながる、先進的な乳癌の特徴です。

マイクロRNA（miRNA）はmRNAの翻訳を遮断またはmRNA分解^4を媒介することにより遺伝子発現を調節する約22ヌクレオチド長の小RNA分子のクラスです。 2,000人以上の異なるmiRNAは、これまでヒト疾患⁵にリンクされている人間、で同定されています。研究の増加アレイは、肝炎Eは、miRNAが癌遺伝子及び腫瘍抑制因子として機能することができ、多くの場合、腫瘍⁶の異常調節されていることを実証しました。 miRNAは強く腫瘍細胞の運動性、浸潤および転移⁷のものと一緒に、細胞周期の進行、老化、アポトーシスおよびオートファジーの主要な調節因子を制御することにより、一次腫瘍形成のすべてに影響を与えます。

異常なmiRNA発現はまた、ステージ、分化、予後およびアジュバント療法⁸に対する応答として臨床的意義と関連しています。具体的には、のmiR-146の発現が、 ​​肺癌患者⁹における予後不良と相関して増加しました。別の研究では、miRNA-let7bの失われた式は、悪性の表現型にリンクされていると、結果的に、低い生存率⁶されていることを実証しました。 miRNAを発現する細胞と構造の種類を理解することは、miRNAの発現に影響を​​与える細胞の変化、それを通して力学を理解することの重要な部分であり、組織は^10を表現型。間質細胞で分泌されることがわかっ特定のmiRNAは、上皮細胞によって取り込まれ、具体的にその標的に作用しています。同じ静脈では、のmiR-212およびmiR-132は、間質から分泌され、乳腺発達¹¹時の乳管伸長に必要な上皮-間質相互作用を調節しています。この論文の全体的な目的は、in situハイブリダイゼーションにおける miRNAを介して乳癌組織におけるmiRNAの発現を検出するための詳細なプロトコルを説明することです。我々は、乳癌患者サンプル中のmiRNA-489の発現のレベルをアッセイするために、すべての条件を最適化しました。この目的のために、我々は、DIGがロックされた核酸（LNA）、我々の実験でプローブを標識しました。そのヌクレオチドのいくつかは、それは、2 '酸素原子と4'は、ハイブリダイゼーション後の「適所にロックされた」ままになるようにヌクレオチドを​​固定リボース骨格の炭素原子を連結するメチレン架橋であり、LNA修飾を有していました。結果として、それははるかに困難ですハイブリダイズした複合体は^、12,13を変性するために。

プロトコル

この研究は、全南大学校和順病院、サウスカロライナ大学の治験審査委員会によって承認されました。乳がんと一致した隣接する正常な乳房組織で構成されるTMAサンプルは全南大学校和順病院、韓国バイオバンクネットワークのメンバーのバイオバンクから提供されました。

1.溶液の調製

1. DNアーゼおよびRNaseフリー水1リットルを準備します。ジエチル（DEPC）処理水を使用して、すべての化学溶液を作ります。 DEPCの500μlの水1Lを治療し、室温で3時間インキュベートします。 DEPCを不活性化するために水をオートクレーブ。
   注意：それは発癌物質知られているので、DEPCを吸入しないでください。
2. DEPC処理水を使用して、10×PBSから1×PBSを準備します。
3. 、20×SSC（塩化ナトリウムの175.3グラムと800ミリリットルの水でクエン酸ナトリウムの88.2グラムを溶解を準備HClを14 N溶液数滴でpHを7.0に調整し、ワットで1Lにボリュームを調整ER）、4％パラホルムアルデヒド、95％エタノール、80％エタノールDEPC処理水を用いました。
4. 8トリmlのDEPC処理水590ミリリットル中のHClの1.05ミリリットルを加え、アセチル化のための無水酢酸1.5ミリリットルを追加します。
5. バッファ中の50μg/μlのプロテ​​イナーゼK（50 mMトリス - 塩酸、pHが8.0をDEPCで処理水を）を準備します。
6. ホルムアミド500μlの、20×SSCを250μl、50×デンハルト溶液100μl、T-RNAの12.5μlを、ニシン精子DNA2.5μlの、RVCの30μlの、ブロッキング試薬及び50μlに0.02グラムで構成されるハイブリダイゼーション緩衝液を準備しますDEPC水の。新鮮な準備をします。

2.乳房組織切片

1. ミクロトームで5μmのホルマリン固定パラフィン包埋切片をカットし、スライド^14を充電するためのセクションを適用します。
   注：ここで使用される乳房組織は、韓国バイオバンクネットワークから先に調製しました。

3.組織標本

1. あちこちパラフィンを削除します10分間新鮮なキシレンでコプリンジャーの2倍に各々のスライドを浸漬することにより、組織をMとのddH ₂ Oにエタノール（100％、95％及び80％）の濃度を減少させるで5分間のインキュベーションによって組織切片を再水和ドラフト内で、この手順を実行します。
2. 5分間のDEPC処理水で組織を浸します。この時点で、疎水性バリアペンで組織切片の周りに境界線を作ります。
3. PBSで洗浄した15分間、4％PFAで組織を修正しました。
4. PBSで洗浄し、続いて10分間、0.3％トリトンX-100 / PBSで組織を浸します。
5. 37℃で15分間の50μg/μlのプロテ​​イナーゼK溶液で試料をインキュベートします。その後PBSで洗浄し、続いて室温で5分間、トリエタノールアミンおよび無水酢酸で組織切片をインキュベートします。いいえPBS洗浄は、プロテイナーゼK処理およびトリエタノールアミン/無水酢酸処理の間に必要とされません。

4.ハイブリダイゼーション

1. 徹底的にincu組織を洗います室温で2〜3時間のためのハイブリダイゼーション緩衝液を用いBATE組織切片。典型的には、120μlのハイブリダイゼーション緩衝液は、組織切片をカバーするのに十分です。
2. 希釈5'-DIGは、120μlのハイブリダイゼーション溶液中の午後3時の最終濃度にLNAプローブを標識しました。ストック濃度は、通常、40 ngの/μlであるように、120μlのハイブリダイゼーション緩衝液に株式の3μlを添加し、95℃で5分間混合物をインキュベートします。
3. 加湿チャンバー内で54°C（Tm）がでプローブ一晩で組織切片をインキュベートします。典型的には、120μlの1部をカバーするのに十分です。 2湿ったペーパータオルを使用して湿度を作成します。室の理想的なサイズは8インチ×10インチです。
4. 注意：Tmは異なるmiRNAのために異なる場合があります。 54°Cは、miR-489のための言及です。

5.ジェンウォッシュ

1. 7分間の5倍のSSCで組織を洗浄（ハイブリダイゼーション工程の後に、RNaseを含まない条件がもはや必須ではありません）。
2. 組織切片のウィットを洗います二回57℃で7分間の時間1×SSC。
3. 57℃で7分間、0.2×のSSCで組織切片を洗浄します。
4. 室温で7分間、0.2×のSSCで組織切片を洗浄します。
5. 10分間、PBS中の組織切片をインキュベートします。

6.ブロッキング

1. バッファは、PBSの18メートルで、BSAのTween-20を3μlの10μlのを2ミリリットルのFBSを追加ブロッキングようにするには（湿潤チャンバー内で1時間室温でブロッキング緩衝液で組織切片をインキュベートします。Storeは4でブロッキング緩衝液 °C）。

7.一次抗体インキュベーション開発

1. ブロッキング緩衝液中に300抗DIG-AP抗体と4℃で一晩抗体を用いた組織切片をインキュベート：1に希釈します。
2. 5分ごと（開発キットにより提供バッファ）のために、洗浄緩衝液で3回のセクションを洗ってください。
3. CY-3蛍光光を生成するアルカリホスファターゼのための市販のキットを用いて組織切片を開発します。
<李>は5分間の洗浄バッファーでセクションを洗ってください。洗浄緩衝液で5分間洗浄した5分間2.5 ngの/μlのヘキスト染料を100μlとステインセクション。
4. 製造業者のプロトコルに従ってバッファを搭載してセクションをマウントします。組織切片あたり15μLを使用して、組織拭くと、過剰なマウントソリューションを拭いてください。漏れを防止するために、明確なマニキュアでスライドを密閉します。
5. トータルの倍率は100倍である10倍レンズを使用したセクションの蛍光顕微鏡を観察します。

結果

ヒト乳癌組織のmiRNA-489の発現を決定しました。乳腺管上皮細胞は、隣接する二人の患者における腫瘍組織（ 図1Aおよび1B）よりも有意に高かったmiRNA-489レベルを発現することが見出されました。これは明らかなmiRNA-489の発現がmiRNA-489の腫瘍抑制活性を示唆し、腫瘍組織では失われていることを示しています。さらに、これらの結果を確認するために、同じ患者からの腫瘍組織と隣接する正常組織を比較しました。 図2Aおよび図2Bに観察されたように、正常組織は、その隣接する腫瘍組織よりも多くのmiRNA-489を発現することが見出されました。画像内の10μmのスケールバーを示しています。画像は、10倍レンズを使用して撮影しました。

ディスカッション

この研究の目的は、in situハイブリダイゼーションのmiRNAを用いた乳癌組織におけるmiRNA発現のレベルを決定することでした。なお、この実験では、全ての条件が乳癌組織のために最適化されたことに注意しなければなりません。さらなる最適化は、他の組織タイプのために必要になることがあります。全ての溶液は、DEPC水で行う必要があり、使用されるすべての容器はDEPC処理水ですすぎ、続いてオートクレーブ処理されるべきです。わずかなのRNaseの混入は、実験の最終的な結果を妨害することができます。 miRNAが非常に短い配列であるので、標的とのより良いハイブリダイゼーションを容易にするために、LNAプローブを使用することが必要です。また、組織固定、治療後にRNaseフリープロテイナーゼKが絶対に必要であるとそれ以外のタンパク質は、内因性のmiRNAとのプローブのハイブリダイゼーションを妨害する可能性があります。また、プローブを用いて組織切片をインキュベートする前に、後者が95にゆでする必要があります いずれかを展開するためにCを°二次構造。

一晩イ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ELF-97	ライフテクノロジー	E6604
50x デンハルト	ライフテクノロジー
t-RNA	Roche	109541	DEPC 水中で再構成
ニシン精子 DNA	Promega	D1815
ロシュ・ブロッキング	ロシュ	11096176001
RVC	フィッシャー	50-812-650	使用前に 16.1 RCF でスピンダウンし、上澄みを採取します
miR-489プローブ	Exiqon	38599-01
ヌクレアーゼフリーBSA	ロシュ
一次抗体-抗DIG	ロシュ
ジエチルピロカーボネート	シグマ	1609478

75001871145411093274910