方法論記事

頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

DOI：

10.3791/53958

⸱

2016年5月11日

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCBL1, UMR/CNRS 5822, Laboratoire de Radiobiologie Cellulaire Moléculaire, Université de Lyon, 2Hospices-Civils-de-Lyon, Centre Hospitalier Lyon-Sud

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腫瘍の再発と治療に対する抵抗性における癌幹様細胞の役割を理解することは、過去10年間で大きな関心事となっています。この記事では、頭頸部扁平上皮がん細胞株(HNSCC)からのがん幹様細胞の亜集団の単離と特性評価について説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）の進行の理解の進歩にもかかわらず、5年生存率は、局所的再発および遠隔転移に低いままです。この再発を説明するための1つの仮説は、固有の化学療法および放射線抵抗性を提示するがん幹細胞様細胞（CSCは）の存在です。新たな治療戦略を開発するためには、標的治療の有効性を検証する実験モデルを有し、したがって、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要です。この目的のために、我々は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって実行二つの連続するセルソーティングの組み合わせに依存しているヒトHNSCC細胞株からのCSCを単離するためのプロトコルを提示します。第1は、ヘキスト33342などの重要なDNA色素は細胞が目にソートし、ATP結合カセット（ABC）トランスポータータンパク質を過剰発現するため、除外し、他の人の間でするのCSCのプロパティに基づいていますこの方法は、「サイドポピュレーション」（SP）として識別されています。 SP細胞は親細胞の（<5％）低いパーセンテージを表すように、成長期には、第二の細胞選別の前にそれらの数を増加させるために必要です。次のステップは、他の二つのHNSCC幹細胞の特性は、細胞表面マーカーCD44（ 高 CD44）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現（ALDH 高い ）の高発現レベル、すなわち有する細胞の選択を可能にします。単一のマーカーの使用は、CSCを単離するための多数の制限および落とし穴を有するため、SP、CD44およびALDHマーカーの組み合わせは、生細胞を必要とするさらなる分析および機能的アッセイのためのCSCを単離するための有用なツールを提供します。 CSCの幹のような特性は、最終的にtumorispheresの形成とβカテニンの発現によりin vitroで検証しました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）は、世界的に一般的な悪性腫瘍であり、現在の治療法の進歩にもかかわらず、進行した疾患を有する患者は予後不良です。患者の全体の5年生存率は、手術、化学療法、放射線療法及び標的 - 療法を含む治療法の組み合わせにもかかわらず、約30％です。最近の研究では、抗がん治療1次がん幹細胞様細胞（CSCは）の生存に局所再発および遠隔転移を属性。乳房、脳、前立腺、肺、結腸、膵臓、肝臓および皮膚2-含む種々の固形腫瘍における幹細胞の特性（未分化状態、自己再生および分化能力、およびテロメラーゼ活性）を提示する細胞の存在を支持する証拠が蓄積されています10。しかし、CSCをの起源は11,12不明のままです。これらは、正常な幹細胞3,13またはdedifferenの悪性転換から生じ得ますCSCのような機能14,15を獲得する腫瘍細胞のtiation。したがって、CSCをに関連する独特の経路を理解することは耐性HNSCCの早期診断と治療への洞察を提供します。

それのCSCはまた、腫瘍細胞のバルク16〜19と比較し、低酸素ニッチ20内に局在する腫瘍の再発を生じ、標準的な化学療法および放射線療法を回避耐性の表現型を有することが提案されています。多くの要因は、静止の傾向としてのCSCの....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物の手順は、動物のケアのローカルガイドラインに従って行いました。本研究の全ての詳細はCECCAPP、フランスの倫理委員会によって承認されました。

ヘキスト染料流出アッセイによるサイドポピュレーション（SP）の1選定

  1. ヘキスト33342染料を用いて50万個の細胞を染色します。
    1. 1「ヘキスト」と表示されたチューブと「ヘキストとベラパミル」と表示された1：2 15ミリリットルに円錐形の底部を有する滅菌チューブを準備します。滅菌水で5 mMのベラパミル塩酸塩溶液10mlを準備します。幹細胞の培養培地（CM）を調製します。
      1. 、CSC（CM-CSC）のためのCM​​を調製以下を組み合わせる：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）：F12（1：3、v：v）によって精製したウシ胎児血清（FCS）を、5％、ヒドロコルチゾンの0.04 mg / Lでペニシリン、ストレプトマイシンを0.1g / L、および20μgの上皮成長因子（EGFR）の/ Lの、100 U / mlです。
    2. 層流フードの下で、細胞をトリプシン処理。秒で洗浄し、メディアを削除terileリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と75 cm 2のフラスコのためにトリプシンEDTA 1mlの（は0.5g / L）を添加します。 37℃で3分間インキュベート。親細胞株のために使用される培養培地を添加することによって反応を停止させます。細胞カウンターを用いて細胞数をカウント....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNSCC細胞株からのCSCの単離は、理由親細胞株でのCSCの非常に低い割合の2つの連続した​​ソートを必要としました。最初のソートは、薬物排出トランスポーターによるヘキスト色素を排除するためのCSCの能力に基づいていました。このソート全細胞集団（ 図1）の1〜5％の獲得をもたらしました。ヘキスト染料負の細胞選別の間、SSCドットプロット（ 図1A）対FSC-Aを見て、サイズと選別された細胞の造粒をチェックしてください。その後、SSC-Hドットプロット対SSC-Wを使用して、人口のP1（ 図1B）を選択することにより、二重および細胞フラグメントを区別。このP1の人口で、ヘキストブルードットプロット対ヘキストレッド-Aを作成します。 「ヘキスト」と表示されたチューブで、SPは主細胞集団（ 図1C）から左側のサイドアームとして表示されます。彼らはarをすると、この人口は消えなければなりませんeはベラパミル（ 図1D）、ABC.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、他のHNSCC細胞系にも適用可能である特定の細胞株からのCSCの成功を単離するための信頼できる方法を記載しています。孤立した頭と首のCSCは、その後、免疫不全マウス19内移植によるvitroおよび機能的検証のさらなる分子特性に適しています。しかし、いくつかの変更は、サイドポピュレーションまたは親細胞株中に存在するCD44 高 / ALDH 高い割合に応じて試験することができます。側集団の細胞の割合は、特定の細胞株における低すぎる場合、例えば、CD44 高 / ALDH 高い選別を直接行うことができます。本研究で使用したマーカーは、細胞株に適切な他のマーカーで置き換えられてもよく、このようなCD133 高い34または高 CD10 35として研究。

このプロトコルは、2セルソーティングに基づいています。 SP + CD44 + ALDHでソート三色はpossi.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8)のフローサイトメトリープラットフォームのThibault Andrieu氏とSebastien Dussurgey氏に感謝します。彼らの選別中のアドバイスと助けに感謝します。この研究は、ETOILEとLabex-PRIMES(ANR-11LABX-0063)の科学的枠組みの中で達成されました。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
子牛胎児血清 ゴールドGEヘルスケアA15-151
ヒドロコルチゾン 水溶性Sigma-AldrichH0396-100MG
ペニシリン/ストレプトマイシン 100xDominique DutscherL0022-100
DMEMGibco61965-026
F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-IGibco31765-027
EGFPromegaG5021溶液は、非常に不安定であるため、使用直前に調製する必要があります
HeparinStemcellTM Technologies7980
B-27 Supplement (50x), minus vitamin AGibco12587-010
Hoechst 33342Sigma-Aldrich14533腐食性、急性毒性(経口、経皮、吸入) カテゴリー4
ベラパミル塩酸塩Sigma-AldrichV-4629急性毒性(経口、経皮、吸入)カテゴリー3
ヨウ化プロピジウムSigma-AldrichP4170急性毒性(経口、経皮、吸入)カテゴリー4
ALDEFLUOR KitStem Cell1700
CD44-APC、ヒト抗体Miltenyi Biotech130-095-177
IgG1-APC、ヒト抗体Miltenyi Biotech130-093-189
Z1コールター粒子ベックマン・コールター6605698
光学顕微鏡オリンパス CKX31
SQ20B細胞株John Little'からの贈り物研究室-
FaDu細胞株ATCCHTB-43
アンカレッジプレートThermo Fischer Scientific145383
BD FACSDivaソフトウェア v8.0.1BD Biosciences-
低

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
  2. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Pr....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

CD44ALDHHoechst

関連記事