頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

サマリー

腫瘍の再発と治療に対する抵抗性における癌幹様細胞の役割を理解することは、過去10年間で大きな関心事となっています。この記事では、頭頸部扁平上皮がん細胞株(HNSCC)からのがん幹様細胞の亜集団の単離と特性評価について説明します。

要約

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）の進行の理解の進歩にもかかわらず、5年生存率は、局所的再発および遠隔転移に低いままです。この再発を説明するための1つの仮説は、固有の化学療法および放射線抵抗性を提示するがん幹細胞様細胞（CSCは）の存在です。新たな治療戦略を開発するためには、標的治療の有効性を検証する実験モデルを有し、したがって、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要です。この目的のために、我々は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって実行二つの連続するセルソーティングの組み合わせに依存しているヒトHNSCC細胞株からのCSCを単離するためのプロトコルを提示します。第1は、ヘキスト33342などの重要なDNA色素は細胞が目にソートし、ATP結合カセット（ABC）トランスポータータンパク質を過剰発現するため、除外し、他の人の間でするのCSCのプロパティに基づいていますこの方法は、「サイドポピュレーション」（SP）として識別されています。 SP細胞は親細胞の（<5％）低いパーセンテージを表すように、成長期には、第二の細胞選別の前にそれらの数を増加させるために必要です。次のステップは、他の二つのHNSCC幹細胞の特性は、細胞表面マーカーCD44（ ^高 CD44）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現（ALDH ^高い ）の高発現レベル、すなわち有する細胞の選択を可能にします。単一のマーカーの使用は、CSCを単離するための多数の制限および落とし穴を有するため、SP、CD44およびALDHマーカーの組み合わせは、生細胞を必要とするさらなる分析および機能的アッセイのためのCSCを単離するための有用なツールを提供します。 CSCの幹のような特性は、最終的にtumorispheresの形成とβカテニンの発現によりin vitroで検証しました。

概要

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）は、世界的に一般的な悪性腫瘍であり、現在の治療法の進歩にもかかわらず、進行した疾患を有する患者は予後不良です。患者の全体の5年生存率は、手術、化学療法、放射線療法及び標的 - 療法を含む治療法の組み合わせにもかかわらず、約30％です。最近の研究では、抗がん治療¹次がん幹細胞様細胞（CSCは）の生存に局所再発および遠隔転移を属性。乳房、脳、前立腺、肺、結腸、膵臓、肝臓および皮膚^2-含む種々の固形腫瘍における幹細胞の特性（未分化状態、自己再生および分化能力、およびテロメラーゼ活性）を提示する細胞の存在を支持する証拠が蓄積されています^10。しかし、CSCをの起源は^11,12不明のままです。これらは、正常な幹細胞^3,13またはdedifferenの悪性転換から生じ得ますCSCのような機能^14,15を獲得^する腫瘍細胞のtiation。したがって、CSCをに関連する独特の経路を理解することは耐性HNSCCの早期診断と治療への洞察を提供します。

それのCSCはまた、腫瘍細胞のバルク^16〜19と比較し、低酸素ニッチ²⁰内に局在する腫瘍の再発を生じ、標準的な化学療法および放射線療法を回避耐性の表現型を有することが提案されています。多くの要因は、静止の傾向としてのCSCのこれらの抵抗、強化DNA修復、アップレギュレートされ、細胞周期制御機構、及びフリーラジカルスカベンジャー^21を説明するために提案されています。また、いくつかの発癌分子経路は、具体的にCSCを¹⁷で活性化されてもよいです。さらにターゲット・治療のためのCSCの知識を向上させるために、我々は、中の幹細胞関連マーカーの不均一性のために、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要癌²²の様々なタイプ。

HNSCCにおいて、幹様腫瘍開始細胞が^、そのような薬物排出トランスポーターの発現²³と異なるCSCバイオマーカー（CD44 ^高 、CD24 ^低 CD133 ^高 、のc-Met ^+表現型^10,24を発現^する細胞を選別することにより、一次患者の腫瘍から単離されています^25、またはALDH ^高活性^26）またはCSC特性を有するsquamospheresを形成するために、主要な患者の腫瘍を栽培。それにもかかわらず、squamospheresの数は、このように、さらなる特徴付けのための小さなサンプルサイズが^27を研究^して与え、2継代後に劇的に減少します。したがって、十分に確立された細胞株から出発インビトロアッセイのCSCの知識を向上させるために実験を設計するための簡単なソリューションです。

この記事の目的は、マルチパラメトリックフローサイトメトリー分析aを用いHNSCC細胞株からのCSCを単離するための方法を提案することですNDセルソーティング。 ALDH活性を含むいくつかのCSCの特性との相関におけるCD44の発現は、サイドポピュレーション（SP）の表現型、スフェロイド形成能と腫瘍形成を分離したCSCのこのサブ集団を特徴付けるために使用されます。 CD44、細胞表面糖タンパク質は、細胞接着および遊走に関与しています。 CD44は、高度に頭頸部癌モデル^29-31を含め、CSCを²⁸多くの固形腫瘍で発現されます。 CD44 ^low細胞が¹⁰できないのに対し、さらに、CD44 ^高細胞は、in vivo異種の腫瘍を発生させることができます。 SPアッセイは、CSC膜内で過剰発現トランスポータータンパク質のATP結合カセット（ABC）ファミリーを介しヘキスト色素^22を流出する細胞の差電位に基づいています。このアッセイでは、対照試料中のベラパミルなどのABCトランスポーター阻害剤の使用を含みます。アルデヒド脱水素酵素（ALDH）は、RETにレチノールの変換に関与する細胞内酵素であります初期の幹細胞の分化^25,26の間inoic酸。高いALDH活性ショーHNSCC ²⁶における幹様細胞の挙動およびALDH ^高い細胞の非常に少ない数を示す細胞は、 インビボ ^26,32 に腫瘍を生成することができます。

これらのマーカーとプロパティの組み合わせが正常にベルトラン間tのアルで使用されていた。 インビトロ及び光子と炭素イオン照射¹⁹にこれらのCSCの生体内で抵抗を研究します。それらの結果は、様々な細胞マーカーおよび特性の組み合わせは、単一のマーカーのアプローチよりHNSCCのCSC集団に関する有用な研究のために、より選択的であることを示しました。

プロトコル

すべての動物の手順は、動物のケアのローカルガイドラインに従って行いました。本研究の全ての詳細はCECCAPP、フランスの倫理委員会によって承認されました。

ヘキスト染料流出アッセイによるサイドポピュレーション（SP）の1選定

1. ヘキスト33342染料を用いて50万個の細胞を染色します。
   1. 1「ヘキスト」と表示されたチューブと「ヘキストとベラパミル」と表示された1：2 15ミリリットルに円錐形の底部を有する滅菌チューブを準備します。滅菌水で5 mMのベラパミル塩酸塩溶液10mlを準備します。幹細胞の培養培地（CM）を調製します。
      1. 、CSC（CM-CSC）のためのCM​​を調製以下を組み合わせる：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）：F12（1：3、v：v）によって精製したウシ胎児血清（FCS）を、5％、ヒドロコルチゾンの0.04 mg / Lでペニシリン、ストレプトマイシンを0.1g / L、および20μgの上皮成長因子（EGFR）の/ Lの、100 U / mlです。
   2. 層流フードの下で、細胞をトリプシン処理。秒で洗浄し、メディアを削除terileリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と75 cm 2のフラスコのためにトリプシンEDTA 1mlの（は0.5g / L）を添加します。 37℃で3分間インキュベート。親細胞株のために使用される培養培地を添加することによって反応を停止させます。細胞カウンターを用いて細胞数をカウントします。
      1. 親細胞株（CM-P）のためのCM​​を調製するために、10％FCS、0.4ミリグラム/ヒドロコルチゾンのL、ペニシリン100 U / mlで、0.1グラム/ Lのストレプトマイシン）を含むDMEMを補います。
   3. CM-Pで10 ⁷細胞/ mlを得るために、ステップ1.1.2で得られた細胞懸濁液を希釈します。チューブ内のチューブに100μlの（10 ⁶細胞）を入れ、「ヘキストとベラパミル」と4ミリリットル（4×10 ⁷細胞） "ヘキスト」：準備2チューブ中の細胞懸濁液を分割します。
   4. サンプル「ヘキストおよびベラパミル」では、5 mMのベラパミル塩酸塩溶液（最終濃度：0.5 mM）の10μlのを追加し、穏やかに混合します。 1グラム/ Lのヘキストの5μlの溶液（：0.1グラム/ Lの最終濃度）を追加します。サンプル＆＃で34;ヘキスト」、10 ⁶個^の細胞（200μlの合計）あたり1グラム/ Lのヘキスト溶液5μlを追加するには、今後、アルミ箔を使用して直接光暴露から保護したサンプルを保ちます。
   5. 1時間30分間37℃の水浴ですべてのチューブをインキュベートします。沈降から細胞を防止するために、穏やかに15分ごとに混ぜます。
   6. 4℃で5分間、250×gで遠心分離管。上清を除去し、1×PBS 2mLで各ペレットを再懸濁します。
   7. 4℃で5分間、250×gで遠心分離管。上清を取り除きます。 PBS緩衝液で希釈した5 mg / LのPI 4ml中のPBS緩衝液と「ヘキスト「ペレットで希釈して5 mg / Lのヨウ化プロピジウム（PI）の500μLで再懸濁「ヘキストおよびベラパミル「ペレット。
   8. フローサイトメーター上のサンプルの取り込みのためのチューブに単一細胞を凝集物を除去し、収集するために70μmのセルストレーナーを介して試料溶液を転送します。サンプルを氷上に保ち、アルミ箔を使用して直接光の暴露から保護します。
2. 私細胞選別によってヘキスト色素を除くサイド人口のゾル化。
   1. 次のパラメータを使用してソーターフローサイトメトリーヘキスト負の細胞分離を実行します。UVレーザー（355 nm）で、ブルーヘキスト（BPを450/50）と赤ヘキストフィルタ（BPを610/20）とUVレーザーパス上の2の検出器、および2コレクター。
      1. まず、染色およびフローサイトメーターセットアップを流すための陽性対照として役立つサンプル「ヘキスト "を分析します。
      2. サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバル・ワークシート」ウィンドウで、「ドットプロット」をクリックします（第五右画像を上）とグローバルワークシート上のグラフを作成します。縦軸に、右クリックで、FSC-A（前方散乱）、横軸に、SSC-A（側方散乱）（ 図1A）を選択します。同様に、SCC-Hドットプロット対SSC-Wを作成します。この第2のドットプロットでは、P1領域を作成するには、「多角形ゲート」（第十四右の写真をトップ）（ 図^{1B）33 を}クリックします。
         注：P1領域がします単一細胞を包含し、ダブレットを判別します。
      3. オプション：P1にゲートをPI対FSC-Aを作成することにより、PI陽性細胞を除外します。このドットプロットでは、PI陽性の死細胞を排除するために、PI陰性集団（P2）を選​​択します。
      4. サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバル・ワークシート」ウィンドウで、「ドットプロット」をクリックして、グローバルワークシート上のグラフを作成します。縦軸に、右クリックで、青ヘキスト-Aを選択し、横軸に、赤ヘキスト-A。人口の上で右クリックすると、「ショーの人口」とP1を選択します。このドットプロットでは、細胞（ 図1C）の主な人口の左側のサイドアームとして表示され、負のヘキスト色素側人口（SP）細胞を選択するための領域（P2）を作成します。
   2. サンプル「ヘキスト」を分析し、10,000事象を収集します。 SP集団を表すゲートP2は、よく配置されていることを確認するために、サンプルを分析し、「ヘキストおよびベラパミル」（10,000イベント）SPの人口（ 図1D）の消失を観察しました。
   3. 1.1.1.1で作製したCM-CSCの1ミリリットルを含む15mlチューブでSPヘキスト染料陰性細胞を収集します。
   4. 5分間250×gで細胞選別、遠心分離細胞懸濁液の終わりに、上清を除去し、CM-CSCの1mlでペレットを再懸濁。細胞カウンターを用いて選別された細胞の数を計数し、培養フラスコへの細胞の適切な数を転送する（ 表1参照）。 CM-CSCを加え、37℃、5％CO ₂雰囲気中でインキュベートします。
   5. 5×10 ⁷細胞（ステップ3、「細胞培養法」を参照）の最小値があるまで2通路の最大のために、同じ条件下で培養中の細胞を維持します。

サイド人口ソートにおけるCD44 ^高 / ALDH ^高サブ人口の2セレクション

1. ALDH検出キットおよびCとSP細胞の50万ドルを染色D44抗体。
   1. 「未着色」（管A）、「CD44-APC」（管B）、「IgG1の-APC」（チューブC）、「ALDH」（チューブd）は、「ALDHとDEAB：7 15ミリリットルを次のようにラベルされた滅菌チューブを準備します「（チューブe）は、「ALDHおよびCD44-APC」（チューブf）は、「ALDH、DEABおよびCD44-APC」（チューブグラム）。染色中に4℃で全てのチューブおよび試薬を保管してください。
   2. （キットに含まれる）は、バッファ1の4.5ミリリットルとCD44-APC（アロフィコシアニン）抗体（1：100希釈）の45μlの緩衝液Aを準備します。バッファ1の100μlのおよびIgG1-APC抗体の1μlの（1：100希釈）を用いて緩衝液Bを準備します。バッファ1の4ミリリットルとキットの試薬20μlの緩衝液Cを準備します。
   3. 10 ⁷細胞/ mlで、以前に選別された細胞（ステップ1.2.5）の細胞懸濁液を準備します。 、BおよびC、ならびに管Fに4ミリリットル（4×10 ⁷細胞）を試験管に100μLの細胞懸濁液（10 ⁶細胞）を加えます。現時点では、チューブのD、E及びグラムで細胞を入れないでください。
   4. 5分間250×gで細胞を含むチューブを遠心。上清を除去し、チューブにペレットを再懸濁し、バッファ1の100μl中b及びcチューブeおよびgのジエチルアミノ5μlの（DEAB）、ALDH阻害剤を追加します。
      1. 4ミリリットルの試薬Cと、すぐにF管で細胞を再懸濁し、チューブのD、E及びグラムに100μLを移します。 30分間37℃の水浴ですべてのチューブをインキュベートし、アルミ箔を用いた直接光の暴露から保護します。沈降から細胞を防ぐために15分後にボルテックスで穏やかに細胞懸濁液を混合します。
   5. この瞬間から、氷上のチューブを保持し、アルミ箔を用いた直接光の暴露から保護しました。遠心分離機4℃で5分間、250×gで全てのチューブ、上清を除去します。
   6. 4ミリリットルと他のチューブに緩衝液Bを100μlの緩衝A.再懸濁管cの100μlのとb及びグラムのチューブ、再懸濁チューブfは1インキュベート10分4℃で緩衝液100μlを追加します; C。
   7. 遠心分離機4℃で5分間、250×gで全てのチューブ、上清を除去します。 4℃で5分間、250×gで再びバッファ1（チューブfの4 ml）及び遠心分離機の1ミリリットルで一回すすいでください。上清を取り除きます。再懸濁4ミリリットルとバッファ1の1ミリリットル中の他のすべてのチューブ内チューブFペレットを。
   8. 凝集物を除去し、フローサイトメーター上のサンプルの取り込みのために適切なチューブ内の単一細胞を収集するために70μmのセルストレーナーを介して試料溶液を転送します。
2. 蛍光活性化細胞選別によってCD44 ^高 / ALDH ^高細胞集団の単離。
   1. ブルーレーザー（488 nm）の赤色レーザ（波長633nm）、FITCフィルター（530/30）と青色レーザ経路上の1検出器、1：次のパラメータを使用してフローサイトメトリーソーターのソートCD44 ^高 / ALDH ^高いセルを行いますAPCフィルタ（20分の660）と2コレクターの赤色レーザー経路上の検出器。
   2. サイトメーターソフトウェアを使用して、ドットPLO」をクリックしてくださいトン」（第五右上の画像）のセクション1.2.1.2に記載されているように細胞形態をチェックして、SSC-H対SSC-Wで単セルで構成される集団を選択するために、SSCドットプロット対FSC-Aを作成しますドットプロット。
   3. サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバル・ワークシート」ウィンドウで、「ドットプロット」をクリックして、グローバルワークシート上のグラフを作成します。縦軸に、右クリックで、二重染色された集団を選択するために、APC-Aと横軸、FITC-A上を選択します。 ALDH ^高い細胞（ 図2A）を選択するために、dおよびeチューブを使用してゲートを作成します。注：陽性細胞はDEAB（ 図2B）で処理されたチューブe。で消えます。
      1. 同じチャート上では、CD44 ^high細胞（ 図2Cおよび2D）を選択するために、チューブのb及びcを用いて第2のゲートを作成します。陽性細胞は、IgG1-APCを含むチューブに消えます。 fとgのチューブを分析し、CD44 ^高 / ALDHを<含まれる第3ゲートを作成SUP> high細胞（ 図2Eおよび2F）。
         注：陽性細胞のIgG1-APC（ 図2D）を含む管中に存在する場合、細胞およびAPC染色抗体との間の相互作用は特異的ではありません。
   4. CM-CSCの1ミリリットルを含む15ミリリットルチューブにCD44 ^高 / ALDH ^高細胞を収集します。 CM ¹⁹の1ミリリットルを含む15ミリリットルチューブにも^低 CD44 ^低 / ALDHを収集します。注：ステップ1.1.1.1で説明したようにCM-CSCを準備します。
   5. 、5分間250×gで細胞懸濁液を遠心上清を除去し、CM-CSCの1mlでペレットを再懸濁。選別された細胞の数をカウントします。

3.細胞培養法

1. 上記のように細胞の二重選別した後、5％CO _2、37℃で、CM-CSCと適切な培養フラスコ（ 表1）に分類された細胞をプレート。 18-24時間後、細胞が付着しているかどうかを確認し、培地を変更します。拡大コロニーが50％コンフルエントより大きくなるまで、3日毎に培地を変更します。
2. 培養フラスコから細胞をトリプシン処理するためにEDTA（ 表1） -トリプシン0.5グラム/ Lの適切な量を使用してください。 37℃で細胞を3~5分間インキュベートします。トリプシンの作用を停止するためにCM-CSC（ 表1）の適切な量を追加します。
3. 得られた細胞の数をカウントし、CM-CSCと175 cm 2の培養フラスコ中で4×10 ⁵細胞をプレー。 37℃で培養し、5％CO _2。この濃度で、24時間の倍加時間を有する細胞は、7日間で70％コンフルエントになります。
4. 彼らは3継代を受けた前に、in vitroおよびin vivo実験のためのCSCを使用してください。

腫瘍の可能性とCSC特性4.確認

1. CD44 ^高 / ALDHの腫瘍の可能性を確認するために、腫瘍球形成^高い細胞。
   1. 3.2で説明したように、細胞をトリプシン処理します。 5分間、250×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に1×10 ⁶個^の細胞を追加します。上清を除去し、DMEM中でペレットを再懸濁：F12（3：1）rhEGFのメディアFCS無料、20 ng / mlで、ヘパリンおよび1×B27の4 mg / Lでを。 37℃で6ウェル低足場プレート培養フラスコ中で細胞をインキュベートし、5％CO _2。
      注意：使用DMEM：F12（3：1）細胞は、FCSなく成長しない場合、FCSの5％、rhEGFの20 ngの/ mlの、4ヘパリンのmg / Lでかつ1×B27を含む培地。
   2. （ 図3A）を播種後4〜10日から光学顕微鏡で腫瘍球形成を観察します。
      注：腫瘍球の直径以上35μmであるべきです。 CD44 ^高 / ALDH ^高細胞はCD44 ^低 / ALDHの^低に比べ数と大きさの点でより速く、より強化された腫瘍球形成を表示します。
2. in vivoで腫瘍形成能を評価した後NOD-SCIDマウスにおけるCD44 ^高 / ALDH ^高い細胞の皮下注射。
   1. 選別後の3つの異なる濃度でPBS中に再懸濁細胞（10 ⁴細胞/ mlで、10 ⁵細胞/ mlで、10 ⁶細胞/ ml）。 6マウスの右側腹部に皮下に10 ⁴細胞/ ml（10 ³細胞）の100μLを注入します。 10 ⁵細胞/ ml（10 ⁴細胞）、および10 ⁶細胞/ ml（10 ⁵個^の細胞）についても同様にします。
      注：10 ³個^の細胞を試験することができるよりも低い希釈。
   2. 左脇腹領域にCD44 ^低 / ALDH ^low細胞の同じ濃度を注入します。最大10週間モニター注射したマウスは、腫瘍の進行^19を参照^してくださいします。

結果

HNSCC細胞株からのCSCの単離は、理由親細胞株でのCSCの非常に低い割合の2つの連続した​​ソートを必要としました。最初のソートは、薬物排出トランスポーターによるヘキスト色素を排除するためのCSCの能力に基づいていました。このソート全細胞集団（ 図1）の1〜5％の獲得をもたらしました。ヘキスト染料負の細胞選別の間、SSCドットプロット（ 図1A）対FSC-Aを見て、サイズと選別された細胞の造粒をチェックしてください。その後、SSC-Hドットプロット対SSC-Wを使用して、人口のP1（ 図1B）を選択することにより、二重および細胞フラグメントを区別。このP1の人口で、ヘキストブルードットプロット対ヘキストレッド-Aを作成します。 「ヘキスト」と表示されたチューブで、SPは主細胞集団（ 図1C）から左側のサイドアームとして表示されます。彼らはarをすると、この人口は消えなければなりませんeはベラパミル（ 図1D）、ABC...

ディスカッション

このプロトコルは、他のHNSCC細胞系にも適用可能である特定の細胞株からのCSCの成功を単離するための信頼できる方法を記載しています。孤立した頭と首のCSCは、その後、免疫不全マウス¹⁹内移植によるvitroおよび機能的検証のさらなる分子特性に適しています。しかし、いくつかの変更は、サイドポピュレーションまたは親細胞株中に存在するCD44 ^高 / ALDH ^高い割合に応じて試験することができます。側集団の細胞の割合は、特定の細胞株における低すぎる場合、例えば、CD44 ^高 / ALDH ^高い選別を直接行うことができます。本研究で使用したマーカーは、細胞株に適切な他のマーカーで置き換えられてもよく、このようなCD133 ^高い34または^高 CD10 ³⁵として研究。

このプロトコルは、2セルソーティングに基づいています。 SP + CD44 + ALDHでソート三色はpossi...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
子牛胎児血清 ゴールド	GEヘルスケア	A15-151
ヒドロコルチゾン 水溶性	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
ペニシリン/ストレプトマイシン 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	溶液は、非常に不安定であるため、使用直前に調製する必要があります
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	腐食性、急性毒性(経口、経皮、吸入) カテゴリー4
ベラパミル塩酸塩	Sigma-Aldrich	V-4629	急性毒性(経口、経皮、吸入)カテゴリー3
ヨウ化プロピジウム	Sigma-Aldrich	P4170	急性毒性(経口、経皮、吸入)カテゴリー4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC、ヒト抗体	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC、ヒト抗体	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1コールター粒子	ベックマン・コールター	6605698
光学顕微鏡	オリンパス	CKX31
SQ20B細胞株	John Little'からの贈り物研究室	-
FaDu細胞株	ATCC	HTB-43
アンカレッジプレート	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDivaソフトウェア v8.0.1	BD Biosciences	-

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