方法論記事

初期の飢餓応答でCoronin Aの機能を調査細胞性粘菌凝集アッセイによって

DOI：

10.3791/53972

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2016年6月18日

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1Biozentrum, University of Basel

この記事について

サマリー

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社会的なアメーバであるDictyostelium discoideumは、飢餓状態になると多細胞生物への発達移行を経験します。進化的に保存されたタンパク質であるコロニンAは、発生の開始に重要な役割を果たしています。アグリゲーションアッセイを主な手法として、初期開発におけるコロニンAの役割の解明を目指しています。

要約

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細胞性粘菌のアメーバは細菌を餌に、土壌中に発見されています。食料源が不足になると、それらは、単一の細胞が凝集中心1-4向かっ走化その間多開発プログラムを開始する因子を分泌します。このプロセスは、環状アデノシン一リン酸（cAMP）5のリリースに依存しています。 cAMPは、アデニル酸シクラーゼ、およびホスホジエステラーゼの協調作用によって電波で産生され、Gタンパク質共役受容体のcAMP 6,7に結合されています。広く使用されているアッセイは、水没条件8,9における細胞凝集の観察に基づいている下等真核生物細胞性粘菌の発達サイクルに関与するメカニズムを分析します。このプロトコルは、平衡塩溶液（BSS）10の中に沈め組織培養プレート中で飢餓によって発達サイクルのcoronin Aの役割の分析を記載します。 Coronin Aは広く保存された広報のメンバーであります活動11,12の多種多様に関与しているcoroninsの家族otein。coronin Aを欠く細胞性粘菌の細胞は、多細胞凝集体を形成することができない、そしてこの欠陥が上流の行為をcoroninことを示唆し、cAMPのパルスを供給することによって救出することができますcAMPは10をカスケード。これらの研究に記載された技術は、cAMPカスケードの上流細胞性粘菌の発達サイクルの初期段階中にタンパク質の機能を調べるための強力なツールを提供します。したがって、この凝集アッセイを利用して機能をcoroninのさらなる研究を可能にし、coronin生物学の我々の理解を進めることができます。

概要

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タンパク質のcoroninファミリは、高度真核生物を通じて保存されています。これらのタンパク質は、カルボキシ末端のコイルドコイルドメイン13,14（ 図1）に接続されたユニークな領域が続くアミノ末端トリプトファン、アスパラギン酸（WD）リピート含有領域が存在することを特徴とします。 Coroninsは、細胞骨格調節およびシグナル伝達12を含む、種々の細胞機能に関与しています。哺乳類では、最大6つの短いcoronin分子（coronin 1-6）と同様に7をcoronin「タンデム」は、12,15を共発現させることができます。 Coronin 1は、最​​も広く研究ファミリーのメンバーであり、病原体の破壊、T細胞の生存および神経伝達に関与することが示されました。どのように、正確に、coronin 1は、これらの活動は不明なままで行います。 coroninながら1は、CAを調節することが示さ2+およびcAMP依存性シグナル伝達だけでなく、F-アクチン細胞骨格の調節16-18、潜在的な共同ました哺乳類で最大7家族の-expressionは、それが困難なこれらのシステムにcoroninsの分子機能を研究するために潜在的な冗長性のために作られました。哺乳類の生物とは異なり、下等真核生物細胞性粘菌は明らかに非冗長機能15,19,20と2つだけcoronin家族（coroninのA、哺乳類coronin 1とcoronin Bのオルソログ、哺乳類coronin 7のオルソログ）を表します。この事実は、 細胞性粘菌に coroninsの機能を研究するための強力なモデルになります。

細胞性粘菌でcoronin Aの役割を研究するために、我々は、10 coronin欠く野生型細胞または細胞のいずれかを用いて平衡塩類溶液（BSS）緩衝液を含む組織培養プレート中で飢餓によって発達サイクルを誘導しました。私たちはcoronin Aを欠く細胞が飢餓時に多細胞凝集体を形成することができなかったことがわかりました。この表現型の正確な定量的評価のためのこのプロトコールに記載の自動化生細胞イメージングは​​不可欠なツールです。 coronin欠く細胞における早期の飢餓応答の開始における欠陥は、cAMPカスケードの上流の行為をcoroninことを示唆し、cAMPのパルスを供給することによって救出することができます。開発の開始をシミュレートするためのcAMPパルスの外因性の適用は、過去8,9にいくつかの研究室で利用されてきました。しかしながら、この手順は、細胞密度及びタイミングに大きく依存することが知られています。したがって、ここで説明するプロトコルは、再現性の高い度合いを保証するために、これらの変動性を低減することを目的とします。まとめると、これらの研究に利用技術は、 細胞性粘菌の発達サイクルの初期段階でのタンパク質の機能を調査するために強力なツールを提供し、アップ識別だけでなく、機能をcoroninの下流エフェクター可能性を秘めています。

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プロトコル

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  1. タイムラプス顕微鏡による細胞性粘菌の早期の飢餓応答を観察します。
    1. 5グラムプロテオースペプトン、5グラムthiotone Eペプトン、10gのグルコース、5gの酵母エキス、0.35グラムHPO 4 2のNa：DH1.10細胞またはHL-5培地（1L用を含むエルレンマイヤーフラスコ中のコーラ欠損細胞成長* 7H 2 O、0.35グラムのKH 160回転の回転に振盪インキュベーターで22℃で2 PO 4、0.05グラムジヒドロ-硫酸塩、pHは6.6）。 0.01×10 6細胞/ mlおよび2×10 6細胞/ mlの密度で細胞を保管してください。
    2. 収穫対数期に成長しているDH1.10セル21または22℃でのHL-5培地で振とう培養で増殖させたコーラ欠損細胞DH1.10のバックグラウンドで生成された10、によって、細胞凝集を調べます。これを行うには、400×gで3分間、細胞（通常10〜50 ml）を、遠心分離の適切な量を取り、BSS（10mMの塩化ナトリウム、10mMのKClの中で細胞を2回洗浄、2.5 mMのCaCl 2を、pHは6.5）。
    3. 血球計数器を用いて細胞を数えます。続いて、（5、10、20、または40）の密度でプレートの細胞を24ウェルプレートに10 4細胞/ cm×2。彼らはBSSに22℃で1時間接着させます。
    4. 10前に説明したように、画像ごとに135秒を取って、タイムラプス顕微鏡により凝集を視覚化します。設定5Xの客観的かつ適切なソフトウェアによって自動化された電子増倍電荷結合素子カメラを搭載したライブセルイメージングを使用して（ 材料表を参照してください）。
  2. 飢餓時の細胞性粘菌細胞のcAMPのパルス化。
    1. 外部から細胞を採取することにより、DH1.10細胞21またはDH1.10 コーラ欠損細胞10の開発にcAMPのパルスを適用の効果を調べます。これを行うには、400×gで3分間、適切な細胞の量（通常10〜50ミリリットル）、遠心分離機を取り、BSSで二回洗います。
    2. COUNT血球計数器を用いて細胞やBSSで1×10 7細胞/ mlの密度に細胞を再懸濁します。パルスを印加する前に、2時間22℃で培養（160 rpm）を振ります。タイマー制御蠕動ポンプを使用したcAMPのパルスを追加します。 5時間かけて5秒パルスに50 nMでのcAMP（最終濃度）の15μlのあらゆる6.5分を提供するためにポンプをプログラムします。
    3. 血球計数器を用いて細胞を数えます。続いて、（5、10、20、または40）の密度で細胞をプレート24ウェルプレートに10 4細胞/ cm×2。 BSSで1時間接着させます。
    4. 5Xの対物レンズを使用して明視野顕微鏡による22℃で16時間後に凝集を視覚化します。
  3. 馴化培地への暴露による細胞性粘菌開発の誘導。
    1. 22に記載されているように 、新鮮な馴化培地を準備します。カルトを振ってから、対数期DH1.10細胞21またはDH1.10 コーラ欠損細胞10を収集400×gで3分間、ピペット、遠心分離器を用いて22℃でHL-5培地でURESとPBMで細胞を3回洗浄し（0.02 Mリン酸カリウム、10μMのCaCl 2、1mMのMgCl 2、pHは6.1）。
    2. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、mlの1×10 7細胞/の密度でPBMでこれらを再懸濁し、110回転数/ 22℃で20時間振とうします。
    3. 3分間400×gで遠心分離後、馴化培地を収集し、4℃で15分間8000×gで遠心分離することにより明らかにしました。
    4. 0.45μmフィルターを通してフィルター条件培地は、（ 材料表を参照）、PBMで3倍に希釈します。
    5. （5、10、20、または40）の密度で血球計およびプレートを用いて細胞をカウントし、24ウェルプレートに10 4細胞/ cm×2。彼らは22℃で1時間接着させます。
    6. 先に調製した馴化培地を用いた細胞の交換上清。
    7. 集約aを可視化5Xの対物レンズを使用して明視野顕微鏡によるFTER 16時間。

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結果

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ショーを開発の初期段階で欠陥をcoroninにおける欠損細胞（ 図2）。細胞をcoroninの不在下では細胞性粘菌の発達サイクル中の初期段階である多細胞凝集体を形成することができません。したがって、coronin Aは初期の飢餓応答および/またはcAMPシグナル伝達の際に役割を果たしていると思われます。実際、coronin Aの非存在下で、多細胞凝集体形成の欠如が減少したcAMPが10をシグナリングすることによって達成されます。しかし、外因性cAMPのパルスの印加は、完全野生型の表現型（ 図3）を復元します。これはcoronin、直接ではなくcAMPシグナル伝達、cAMPのカスケードの上流の機能（ 図5）に関与していることを含意します。 細胞性粘菌の細胞が飢え条件にさらされている場合、それらは初期の飢餓の分泌が22,23因子誘導します。最高のキャラの一つ早期の飢餓応答に関与cterized要因...

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ディスカッション

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coroninタンパク質は、真核生物クレードのほとんどの分類群で発見されています。coronin欠損細胞は初期発生時に集計中心を形成することができないので、 細胞性粘菌の coroninのA、哺乳類coronin 1のホモログは、早期の飢餓応答に関与していますサイクル10。定量的かつ正確に系統間で開発の遅れを評価することができるようにするには、自動化されたステージコントローラと顕微鏡、ライブセルイメージングセットアップは不可欠なツールです。

D. discoideumのは、そのライフサイクル1-4のいくつかの段階の間に本質的なシグナル伝達分子としてのcAMPを利用しています。 cAMPのが要求される時にチェックポイントの一つは、多細胞構造を形成する単一のセルからの遷移です。飢餓〜6時間後のcAMP波の開始は、細胞により感知され、集計センタ5に向かって移動する走化性信号を提供します。これらのcAMP波は飢えDをパルスすることによって実験的に模倣することができます...

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

謝辞

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私たちは、菌株と試薬を提供してくださったDictyostelium Stock Centerに感謝します。この研究は、スイス国立科学財団とバーゼル州からの助成金によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HL-5培地(1L用:プロテオースペプトン5g、チオトンEペプトン5g、グルコース10g、酵母抽出物5g、Na2HPO4*2H2O、0.35g KH2PO4、 0.05 g ジヒドロストレプトマイシン-硫酸塩、pH 6.6)
プロテオース ペプトンBD バイオサイエンス211693
チオトン E ペプトンBD バイオサイエンス211684
酵母抽出物BD バイオサイエンス212750
グルコースAppliChemA3666
Na2HPO4*2H2OFluka71643
KH2PO4AppliChemA1043
ジヒドロストレプトマイシン-硫酸塩Sigma-AldrichD1954000
PBM (0.02 M リン酸カリウム、10 μM CaCl2、およびl mM MgCl2、pH 6.1)自作
BSS(10 mM NaCl、10 mM KCl、2.5 mM CaCl2、pH 6.5)自作
0.45-μm Filtropure S フィルターSarstedt83.1826
Falcon 24-well 組織培養プレートFisher Scientific08-772-1H
Cellobserver 顕微鏡Zeissカスタムビルド
AxioVision ソフトウェアZeiss
IPC マイクロプロセッサ–制御ディスペンシングポンプISMATECISM 931
Axiovert 135M 顕微鏡Zeiss491237-0001-000
インキュベーションシェーカーInforst HT Minitron

参考文献

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