線維芽細胞移動の調節にMRP4含有高分子複合体を研究するための方法

Summary

MRP4は、細胞遊走における最近明らかに役割を含む種々の環状ヌクレオチド依存性シグナル伝達事象を調節します。我々は、線維芽細胞の遊走の微調整調節に重要な役割を果たしているユニークなMRP4のインタラクトームの識別結果としてMRP4の下流の分子標的を解明するために、直接、しかし、多面的なアプローチについて説明します。

Abstract

多剤耐性タンパク質4（MRP4）膜トランスポーターのATP結合カセットファミリーのメンバーであり、環状ヌクレオチドの内因性の排出トランスポーターです。細胞内の環状ヌクレオチド濃度を調節することにより、MRP4は、細胞遊走を含む複数の環状ヌクレオチド依存性細胞事象を調節することができます。以前、我々は、MRP4の非存在下で、線維芽細胞は、細胞内の環状ヌクレオチドのより高いレベルを含有し、より迅速に移行することができることを実証しました。この知見の根底にあるメカニズムを理解するために、我々は直接まだ多面的なアプローチを採用しました。まず、質量分析に続いて免疫沈降法を用いて、MRP4過剰発現細胞系からMRP4の潜在的な相互作用タンパク質複合体を単離しました。 MRP4のインタラクトームに固有のタンパク質を同定した後、我々は、シグナル伝達との関連でこれらのタンパク質 - タンパク質相互作用の役割を探求するために工夫経路分析（IPA）を利用します。私たちは、経口解明しました細胞遊走のMRP4の効果の主要なメディエーターとして細胞移動におけるMRP4タンパク質複合体と同定されたF-アクチンのtential役割。この研究はまた渡り鳥の現象におけるキープレーヤーとしてのcAMPおよびcGMPの役割を強調しました。高含量顕微鏡を用いて、我々は、細胞遊走アッセイを行い、繊維芽細胞の遊走にMRP4の影響を完全にcAMP依存性キナーゼA（PKA）のアクチン細胞骨格又は阻害の破壊によって廃止されることを観察しました。リアルタイムでの移行のセルに変調をシグナリングを可視化するために、我々はPKA活性を測定するためのFRETベースのセンサーを利用し、見つかった、MRP4の移行の前縁近くでより多くの偏PKA活性の存在^{- / -}と比較して、線維芽細胞、MRP4 ^{+ / +}線維芽細胞。これにより、皮質のアクチン形成を増加し、移行のプロセスを増強しました。我々のアプローチは、MRP4の下流に作用するタンパク質の同定を可能にし、オーバーを提供してくれます線維芽細胞の遊走のMRP4依存性調節に関与する機構の眺め。

Introduction

細胞移動は、複雑な多段階プロセスです。研究は、移行細胞中に前縁及び後縁に分極されていることを示しています。細胞外マトリックスに付着することで、先端が前方に移動するための細胞体に必要なトラクションを提供します。最後に、エッジのリリースに末尾の後部アタッチメントとは、移行サイクル^1,2を完了します。

効率的な細胞移動のための細胞の分極は、細胞内シグナル伝達の空間的な分離によって調節されます。また、cAMPなどの細胞のセカンドメッセンジャー、微調整の方向性細胞遊走^3,4に必要なシグナル伝達事象の区画化を媒介します。リーディングエッジでcAMPおよびcAMP依存性キナーゼPKA活性の優先的な蓄積は、方向性細胞遊走^5,6において重要な役割を果たしています。このようなRas関連C3ボツリヌス毒素基質（RAC）と細胞分裂制御タンパク質42ホモログまたはCdc42の、PKなどの低分子量GTPaseをリン酸化することにより、Aは、立ち上がりエッジでアクチン関連タンパク質2/3（アープ2/3）を活性化し、葉状仮足^7-9の形成を誘導します。 PKAはまた、抗キャッピング剤をリン酸化し、血管拡張剤は、それによって、膜の伸縮^10,11の振動周期を調節し、リンタンパク質（VASP）を刺激しました。

膜結合型排出トランスポーター³によって輸送アデニル酸シクラーゼによってI）の合成、ホスホジエステラーゼによってii）の劣化、及びiii）：細胞では、cAMPレベルは、3つの主要なプロセスによって規制されています。多剤耐性タンパク質4（MRP4）、膜輸送体のATP結合カセット（ABC）ファミリーのメンバー、環状ヌクレオチドの内因性の排出トランスポーターとして機能します。したがって、MRP4は^{11-13シグナル} 、細胞内cAMPレベルおよびcAMP依存性細胞を調節することができます。 ^{- / -}線維芽細胞は、環状ヌクレオチドの比較的高いレベルを含有し、より速いCを移行我々は以前MRP4であることを示しましたMRP4 ^{+ / +}線維芽細胞¹⁴にompared。我々はまた、線維芽細胞の遊走上の環状ヌクレオチドの二相性の効果を報告しました。以前の研究に基づいており、MRP4がという我々の発見^{- / -}線維芽細胞は、移行の過程でより多くの偏光のcAMPが含まれている、我々は、線維芽細胞の遊走のこのMRP4媒介性調節は、cAMPのが依存しているという仮説を立てました。下流側の機構を理解するために、我々は直接まだ多面的なアプローチを取りました。

関連するとMRP4との相互作用中のタンパク質を同定するために、我々は以上のMRP4を発現するHEK293細胞からMRP4含有高分子複合体を免疫沈降させました。質量分析を使用して、我々は、複数のMRP4相互作用タンパク質を同定し、創意工夫パスウェイ解析（IPA）を使用して、それらの相互接続性を分析しました。 IPAは、（構造的および機能の両方）タンパク質 - タンパク質相互作用を分析し、特定の生理学的および病理学における彼らの貢献を探求するための有用なツールであります文学と実験的証拠^15,16に基づいてイベント。 IPAは、F-アクチンは、cAMPおよびcGMPのは、分子^{17シグナル}伝達の鍵となる細胞遊走の文脈におけるMRP4の主要な下流標的であることを示しました。これらのデータはさらに、高含有量顕微鏡により確認しました。高コンテンツ顕微鏡は、より便利で正確かつ高スループットの方法¹⁸に、このような細胞遊走などの細胞挙動をキャプチャし、分析することができます。高コンテンツ顕微鏡データは、線維芽細胞の遊走にMRP4の影響を完全にPKA ¹⁷のアクチン細胞骨格または阻害の破壊時に廃止されていることを実証しました。

さらに、我々は、リアルタイムでの細胞の移行にPKA動態をモニ​​ターするためにPKAセンサーベースの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用います。 FRETベースのキナーゼセンサーは通常、CFPとYFPの蛍光団^19-21によって隣接特異的リン酸化基質ペプチドで構成されています。 pmAKAR3が向上し、私れますmbraneはフォークヘッド関連ドメイン1（FHA1）とPKA基質配列LRRATLVD ^5,22が含ま^れているFRETベースのPKAセンサーをターゲットに。 PKA触媒サブユニットの増加によりpmAKAR3のリン酸化は、CFPとYFP ¹⁹との間の信号をFRET。センサーへの脂質修飾ドメインの挿入は、特に、膜区画²³において、PKA動態を監視するための原形質膜に標的化します。

pmAKAR3を使用して、我々は実証そのMRP4の移行の前縁^{- / -}今度はセルの前縁¹⁷での皮質アクチン形成を増加MRP4 ^{+ / +}線維芽細胞、より多くの偏PKA活性を示した線維芽細胞。一緒に、これらのイベントは、MRP4の不在下でより良い携帯偏光と速い方向性細胞遊走をもたらしました。当社の特定と直接的なアプローチは、MRP4のための鍵下流標的を同定し、重要なを提供していますが、として線維芽細胞の遊走のMRP4依存性調節のためのまだ未踏のメカニズム。

Protocol

1.創意工夫パスウェイ解析

1. アップロードタンパク質 - インタラクトームデータセット
   1. 彼らのユニークな遺伝子識別子（質量分析データで得られたとして、好ましくは、遺伝子記号および遺伝子識別番号）とのスプレッドシートで目的のタンパク質/遺伝子を挿入します。
   2. 遺伝子識別番号と観測値の1列（ 例えば 、倍数変化またはp値）のためのスプレッドシートの1列を割り当てます。列見出しを表示するには、「列ヘッダーが含まれている」オプションを選択します。
   3. アップロードデータセット]タブをクリックし、上記のスプレッドシートを選択することにより、IPAにデータセットをアップロードします。柔軟なフォーマット]タブを選択し、遺伝子識別子の適切なカテゴリを選択します。
      注：データセットの柔軟なフォーマットは、アップロードのフォーマット仕様を克服します。
   4. データセットが表示されたら、IDと観測列を選択します。質量-SPによるタンパク質の全て（MRP4のインタラクトームを識別されることを確認してくださいectrometry）データセットの概要]タブで確認することによりマッピングされています。データセットは、今所望の分析のために準備ができています。
2. データ分析
   注：この研究のために使用したIPAの機能の部分的な用途が記載されています。
   1. 一意の識別子としてそれらの遺伝子名でMRP4のインタラクトームをアップロードした後、新しいをクリックして、IPAソフトウェアの左上のメニューで、コアの分析を選択します。
   2. 実験の種類に応じた強度のために発現カットオフ値を設定します（100の強度値は、分析のために推奨されます）。
   3. 対照および実験条件が関与しているとの比較分析を実行する必要がある場合は、データセットファイルの一部として含まれている場合、データセットを準備しているときに、発現の倍数変化を計算する（1.5倍の変化のカットオフ値は、通常、分析のために推奨されます）。
      注：コア解析の終了後、分析の複数のセクションを得ることができます。最初のタブは、番目の概要を示していますeは、総分析し、他の人の間でトップカノニカル経路、上流調節因子、分子や細胞機能、およびネットワークを示唆しています。すべての信頼レベル（p値）に基づいて計算し、p値の昇順に並べ。
   4. 絵重複クロストーキングを示す（オープン経路オプションを使用して）主要な標準的な経路のような大きな分子ネットワークを開き、シグナル伝達経路に影響を与えました。
      すぎなかっp値に基づいて関与している標準的な経路のリストを見た（p <0.05を有意であると考えられます）。
      注：カノニカル経路の有意値は、右尾のフィッシャーの直接確率検定によって計算されます。意義だけでは偶然によって標準経路を持つデータセットからの分子の会合の確率を示します。
   5. 各経路に関与するタンパク質のリストの間で入力タンパク質（質量分析によって識別されるようMRP4のインタラクトーム）を確認してください。
      注：このOPTIOを使用してnは、それは、細胞のアクチン細胞骨格のシグナリングネットワークは、入力されたタンパク質は、それに合う主要な影響を受ける経路および方法（ 図1）であることが観察されました。このアプローチは、分子ネットワークが密接に関連しており、試験タンパク質によって影響を受けるかを識別するのに役立ちます。
   6. 潜在的にフォーカス分子の数に基づいて、特定のタンパク質のネットワークにリンクされているトップ疾患や機能を識別するための分析で、ネットワーク]タブを使用します。
      文学の知識と実験的証拠を介して、スコア値は、ネットワークなどの一部として決定される既知のタンパク質に基づいて付与され、携帯アセンブリおよび組織のネットワークとデータセットから識別され、ネットワークの一部となっている分子を集中：注意。今後、ネットワークは、フォーカス分子の数に基づいて、最初に濾過されます。

2.高含量顕微鏡

1. 細胞の調製
   注：すべての細胞培養作業は、水平流動細胞培養フード下で行いました。
   1. 創傷治癒アッセイのための96ウェルマイクロプレートを使用してください。
   2. （PBS中で再構成）を1％フィブロネクチン溶液でコートマイクロプレートを、2時間、37℃で、標準的なCO ₂インキュベーター内でプレートを保持します。
   3. ^{/ - -} MRP4を削除し、インキュベーターから25 cm 2の細胞培養フラスコ中で増殖させMRP4 ^{+ / +}マウス胚性線維芽細胞（MEFに）、PBSで1回洗浄し、4倍のトリプシン-EDTA溶液1mlを用いて5分間、細胞をトリプシン処理。
   4. 完全培地で細胞を洗浄（DMEM、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有する）、完全培地5mlに再懸濁。
   5. ウェルからフィブロネクチンソリューションを吸引。血球計数器を用いて細胞を計数し、各ウェルに（細胞数、細胞の種類に基づいて最適化する必要がある）30,000細胞を播種します。
   6. 標準で100％コンフルエンスまで細胞を増殖させます24時間、37℃でCO ₂インキュベーター。
2. 傷の作成
   1. すべてのウェルが溶液で満たされていることを確認します。創傷製造工具の損傷を防止するためにPBSで、未使用のウェルを満たす（ 例えば 、WoundMaker）。
   2. 100％の細胞集密度を確認した後、金属ベース板上に巻か製造ツールの内側96ウェルプレートに配置し、96ウェルピンブロックを押し下げ。
   3. 任意の外れ細胞を除去し、完全培地100μlを追加するために、PBSで細胞を3回洗浄します。
   4. 試験化合物を追加 - H-89（50μM; 1：DMSO中の50mMのストックを使用して完全なメディア1,000希釈）またはラトランキュリンB（1μM; 1：DMSO中で1 mMのストックを使用して完全なメディア1,000希釈）この段階で。
   5. 37℃でリーダーの内部アッセイプレートを配置し、実験期間にわたって移行を監視します。
3. モニタリング細胞遊走
   注：細胞遊走は、顕微鏡およびソフトウェアPRを用いてモニターしました。高コンテンツ顕微鏡システムでovided。傷が自動的に顕微鏡で監視し、ソフトウェアによって登録されることを保証する96ウェルマイクロプレートを使用します。
   1. スケジュールスキャン]タブを使用して、遊走アッセイのためのアッセイプレートを時間ごとにスキャンするようにソフトウェアを設定します。少なくとも15分のイメージングの前に平衡化を可能にするために、読者の内側アッセイプレートを配置した後、開始時刻を選択します。
   2. トレイを選択して、容器の種類（96ウェルマイクロプレート）と、実験の種類（スクラッチ傷）を選択します。
   3. 10倍対物レンズを選択し、位相コントラスト撮像パラメータを選択します。編集スキャンパターンオプションを使用してスキャンする必要がある井戸を選択します。
   4. [プロパティ]タブを選択し、プレートマップを設定することにより、治療グループと任意の複製を指定します。スキャンは、実験条件に基づいて、いつでも停止することができます。
4. データ分析
   1. スキャンが完了した後、アッセイプレート用の容器ビュー]タブを選択します。 G解析ジョブユーティリティへoおよび新しい分析ジョブを起動する]を選択します。
   2. ジョブの種類としてスクラッチ傷を設定し、分析（24時間の時点を0時点）の時間範囲を選択します。
   3. よく上のシングルクリックによる分析のために選択される井戸を選択して、分析を開始するために「OK」をクリックします。解析が完了すると、グラフィカルにグラフオプションへの輸出を使用して、各時点で各ウェルについて相対的創傷密度（RWD）のデータを視覚化します。
   4. 各ウェルビュー画像]タブを使用して、異なる時点に対応する位相コントラスト画像のセットを表示します。プレートのマップをクリックすることで、特定の十分を選択し、時間範囲]タブから特定の時点を選択して、ビューの画像]タブをクリックします。

3.蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）

1. 細胞の調製
   1. （セクション2.1で説明したように）でそれらを保つため、1％のフィブロネクチン溶液100μlでコート35ミリメートルのガラス底の皿2時間37℃で、標準的なCO ₂インキュベーター。
   2. プレートと完全培地中でHEK293細胞（10,000細胞/プレート）の種子同数からフィブロネクチンソリューションを吸引。
   3. 24時間、37℃で、標準的なCO ₂インキュベーター内でフィブロネクチンコーティングされたガラス底皿に60から70パーセントコンフルエンスまで細胞を増殖させます。
2. トランスフェクション
   1. 製造業者の指示に従って商業トランスフェクション試薬を使用して、すべての一過性トランスフェクションを行います。
   2. 小分けした各35mm皿のための2つの別個の1.5ミリリットル滅菌遠心チューブに完全培地250μlの。
   3. 別のチューブにトランスフェクション試薬の（2.5 DNA濃度を倍）1管および5μlのDNA（pmAKAR3またはpmAKAR3-TA）2μgのを追加します。
   4. 室温で20分間チューブをインキュベートした後、トランスフェクション試薬を含有するチューブに希釈したDNAを移します。
   5. 完全に混合し、37℃でインキュベートさらに30分間℃です。
   6. 細胞から培地を吸引除去し、PBSで一度洗っ。細胞に10％FBSを含有する抗生物質を含まないDMEM F-12培地1ml加えます。
   7. 、各プレート中の細胞にメディアとのDNA-脂質複合体の507μl加え穏やかに混合し、48時間、37℃でCO ₂インキュベーター内で保管してください。 2μgのDNA（1μgの/μlのストック）と各プレートで10,000〜50,000細胞のための5μlの脂質を使用してください。
3. 生細胞イメージング
   1. トランスフェクションの48時間後、増殖培地を除去し、ハンクス平衡塩溶液（HBSS、37℃で予め温めて2倍の細胞を洗浄 °C）。カスタムメイドの37°Cの内部にFRETイメージングのために反転広視野顕微鏡システム上で洗浄した細胞に1.9ミリリットルのHBSSの最終容量を追加し、それらをマウントするには、チャンバを維持しました。
      注：このシステムでは、励起光を50％の光transmiss中性濃度フィルタを用いて減衰300Wのキセノンランプによって提供されますイオン。
   2. 60Xの対物レンズを使用してください。手動細胞に焦点を当て、顕微鏡を使用してビューの最適なフィールドを設定します。ソフトウェアに焦点を当て、「F」オプションを使用して、コンピュータ画面上のビューの選択したフィールドをアクティブにします。 FRET測定を実行するため、適切なフィルターセットCFPとFRETのための30分の535 nmのための25分の430 nmの励起フィルター、二重のダイクロイックビームスプリッタ、および2つの発光フィルタ（30分の470 nmのと設定（CFP / YFPフィルター）を選択手動で。
   3. 最初のオープンフッ素タブをクリックし、続いてチャネルオプションCFP / YFP / FRETにチェックすることにより、蛍光を可視化します。カメラ]タブで強化ツールを使用して、信号強度を向上させます。
   4. 信号強度の飽和を回避pmAKAR3またはpmAKAR3-TAを発現しているセルを選択。 FRET測定を開始するために、キャプチャウィンドウを使用します。
   5. タイムラプスオプションとセットアップ30秒間隔で30分間の時間スキャンを選択します。 FRETオプションをチェックし、100ミリ秒の露光時間を設定します。画像ラベルANを入力してくださいDを押して測定を開始するために開始します。
   6. 5時間点とベースラインの確立した後、プレートを乱すことなく細胞にフォルスコリンの25μM（HBSS100μlで希釈し、エタノール中10μMの株式の5μLを、）追加し、合計30分間細胞を監視します。
4. データ分析
   注：データ分析のために使用するレシオメトリック計算モジュールを。
   1. 画像ウィンドウの左側の選択ツールをクリックし、ドロップダウンメニューから塗りつぶした長方形を選択します。無細胞領域の画像フィールド上の四角形をドラッグし、右のバックグラウンド減算の目的のための背景として設定するためにそれをクリックしてください。
   2. マスクに移動し、オプション「新しいマスクを作成」を使用します。選択ツールに移動し、手動測定のためにそれを選択するために、細胞の周りにマスクを描画するためにドロップダウンメニューからペンを選択します。条件ごとに少なくとも4-6セルを選択します。
   3. マスク]タブを選択し、マスクの統計を行います。
   4. 「全体のマスク」をチェックし、クロスチャネルオプションを選択し、ドナー正規化されたFRET（N-FRET）（FRET / CFP）を展開します。 N-FRET値は、原形質膜におけるPKA活性を表します。
   5. ルックアップテーブルとスケールバーをアノテーションを使用して、タイムスタンプを追加します。

Results

線維芽細胞遊走に対するMRP4の影響を研究するために、我々は、高含量の顕微鏡^14を用い^た創傷治癒アッセイを使用します。正確な創傷から単離されたMEFのコンフルエントな単層上で行われたいずれかのMRP4 ^{- / -}またはMRP4 ^{+ / +}マウス、および画像は24時間を1時間間隔で採取しました。 MRP4 ^{+ / +} MEFを（ 図2）と比較したMEF ^{- / -}私たちは、MRP4のために、より高い移動速度を観察しました。 MRP4 ^{+ / +} MEFのは、傷をカバーするために、ほぼ20時間を要したのに対し、MEFを^{- / -}傷は完全にMRP4未満15時間...

Discussion

細胞遊走は、創傷治癒を含む多くの重要な生理学的イベントにおいて不可欠な役割を果たす複雑なプロセスです^1,2。異常な細胞遊走は、腫瘍転移や血管新生などの壊滅的な事象を引き起こす可能性があります^24,25。したがって、正常な身体機能を維持するには、細胞遊走の微調整された調節が必要です。

ハイコンテント顕微鏡¹⁸を使用して、MRP4欠損MEFは野生型線維芽細胞と比較してより速く移動することを実証しました¹⁴。従来のスクラッチ創傷アッセイとは対照的に、ここの顕微鏡検査は、自動化された便利で一貫性のあるハイスループットの方法で創傷治癒アッセイを実施します。このソフトウェアは、i) 創傷幅の変化、ii) 創傷領域内の細胞合流の変化、および iii) 相対創傷密度 (RWD) の 3 つの個別の指標に基づいて細胞遊走率を分析します。RWD は、創傷領域の外側の空間細胞密度と比較して、創傷領域内の空間細胞密度を測定する自己正規化された指標です。したがって、細胞増殖による細胞密度の変化の影響を受けず、従来のスクラ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen(カリフォルニア州カールスバッド)	11668-027
DMEM	Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)	11965-092
IncuCyte Zoom	Essen BioScience
96ウェル IncuCyte Image-Lock マイクロプレート	Essen BioScience	4493
Latrunculin B	Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)。	L5288	DMSO
H-89	Enzo Life Sciences(ニューヨーク州ファーミングデール	BML-EI196	DMSO
35 mmガラス底皿の在庫	(MatTek株式会社;マサチューセッツ州アッシュランド)	P35G-1.5-20-C
フィブロネクチン	シグマ-アルドリッチ(ミズーリ州セントルイス)。	F1141
Opti-MEM Reduced Serum Media	Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)	31985-088
FRET顕微鏡システム	オリンパス倒立顕微鏡(IX51)
CCDカメラ	浜松市、日本	ORCA285
SlideBook software 5.5	Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)
Ingenuity Pathway Analysis software	IPA, QIAGEN Redwood City,Forskolin
	Tocris (Ellisville, MO).	1099	100% EtOH
DMEM F-12の在庫	Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)	11330-057
HBSS	Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)	14025-134
Excel	Microsoft
PBS	Invitrogen(カリフォルニア州カールスバッド)	10010-023
トリプシン/EDTA溶液(TE)	Invitrogen(Carlsbad, CA)	R-001-100
ペニシリン-ストレプトマイシン	Invitrogen(カリフォルニア州カールスバッド)	15140-122