開発インビトロアッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

Summary

ここでは、上皮間葉転換を経験した間葉系細胞の収縮機能を評価するためのゲル収縮アッセイの開発と応用について説明します。

Abstract

線維症は、間質性肺疾患などのさまざまな慢性進行性疾患の病因に関与することがよくあります。病理学的特徴は、疾患の重症度に関連する線維芽細胞性病巣の形成です。線維芽細胞病巣からなる間葉系細胞は、もともと常在する肺内線維芽細胞や骨髄由来の循環線維細胞など、いくつかの細胞源に由来することが提案されています。近年、上皮間葉転換(EMT)を受けた間葉系細胞も線維化の病因に寄与すると考えられてきた。さらに、EMTは成長因子βのトランスフォーミングによって誘導することができ、EMTは腫瘍壊死因子αのような炎症誘発性サイトカインによって増強することができます。ゲル収縮アッセイは、線維芽細胞の特徴的機能の1つであり、創傷修復や線維化に寄与する収縮性の評価に理想的なin vitroモデルです。ここでは、EMTを受けた間葉系細胞の収縮能力を評価するためのゲル収縮アッセイの開発が実証されています。

Introduction

線維症は、間質性肺疾患、心臓線維症、肝硬変、末期腎不全、全身性硬化症、および自己免疫疾患の¹のような種々の慢性進行性疾患の病因に関与しています。間質性肺炎のうち、特発性肺線維症（IPF）は慢性進行性疾患であり、予後不良を示しています。 IPFの病理学的特徴は予後と関連している活性化された線維芽細胞および筋線維芽細胞からなる線維芽細胞巣の開発です。このような肺の線維芽細胞の起源は、もともと常駐肺線維芽細胞及び骨髄から循環する線維細胞を含むいくつかの間葉系細胞に由来することが提案されています。最近、上皮間葉移行（EMT）は、間葉細胞²の形成に関連することが提案されている、および線維性疾患の病因に貢献します。

これは、と考えられているEMTは、腫瘍の浸潤および転移^3を含む胎児の発育、創傷治癒、および癌の進行の過程で重要な役割を果たしています。 EMTのプロセスに続いて、上皮細胞は、E-カドヘリンなどの上皮マーカーの損失により、間葉系細胞の能力を取得し、そのようなビメンチンのような間葉マーカー、およびα平滑筋アクチン^（SMA）4,5の発現による。以前の研究は、EMTプロセスは腎臓⁶および肺⁷における組織線維症の発症に関連しているという証拠を示しました。さらに、慢性炎症は、線維性疾患^8を促進^します 。さらに、腫瘍....

Protocol

1.準備と文化肺上皮細胞の

1. 10％ウシ胎児血清（FBS）、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養A549ヒト肺上皮細胞（付着細胞株）。
2. 取り外し、廃棄し、細胞培養培地を培養皿から5で1回洗浄 - リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlの。洗浄後、すぐにPBSを吸引。
3. 3分間CO _2を 2 mlのトリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（0.05％）を添加し、37℃でインキュベートし、5％。
4. 4分間室温でチューブは150×gで遠心分離、細胞培養培地を含む遠心管で剥離した細胞を収集します。
5. 細胞は、細胞培養培地2mlにペレット再懸濁し、細胞計数のためのサンプルを削除します。細胞生存率をチェックするためにトリパンブルー染色と血球計数器を用いて細胞数をカウントします。
6. 上のシードA549細胞0.5の密度で10cmのポリスチレンプレート-ゲル収縮アッセイ用培地10mlで1.0×10 ⁶細胞/皿。 0.5の密度で6ウェルのポリスチレンプレート上の細胞をシード- 1.0×10 ⁵細胞/ウェルとEMT確認のための培地2ml。 24時間37℃で細胞を、5％CO _2でインキュベートします。

Results

EMTの間に、上皮細胞は、E-カドヘリンなどの上皮マーカーを失い、そのようなビメンチンおよびα平滑筋アクチン^4,5などの間葉系マーカーの発現を得ることができます。 TGF-β1及びTNF-αとのA549ヒト肺上皮細胞のインキュベーションは、EMTを誘導します。通常のA549細胞の出現は、上皮細胞（ 図3A）の特徴である形状や三角形のような石畳ですが、TGF-β1及びTNF-αで刺激した後、外観は間葉に似ている長い紡錘形に変更しました細胞（ 図3B）。

上皮および間葉系マーカーの発現は、細胞がEMTを受けたことを確認するために評価しました。相対的mRNA発現は、ΔΔCT法を用いて計算しました。個々のデータは、ハウスキーピングgであるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に対して正規化しましたエン。 TGF-β1と48時間TNF-αで処理された.......

Discussion

本研究で開発されたプロトコルは、2つのステップを含みます。最初のステップは、第二段階は、ゲル収縮アッセイがあるが、EMTを誘導するために行われます。それは、細胞がEMTを受けたことを確認することが重要であるので、ステップ2は、形態学的および遺伝子発現の変化に優れた補数を提供します。以前の研究は、A549細胞のEMTは、TGF-β1のみ²⁴によって誘導されたことを示しました。我々は以前に^10を報告しているようしかし、TNF-α処理は、EMTおよび間葉細胞マーカーの獲得を強化します。 TGF-β媒介EMTのメカニズムはSMAD依存²⁵であると考えられています。 TNFαは、ゲル収縮の向上につながるTGF-β1によって誘導されるEMTを強化します。 TGF-β1によって誘導されるEMTの増強のためのTNFαのメカニズムはSMAD2リンカー領域の唯一のリン酸化ではないことが報告されているだけでなく、規制²⁶ MAPKシグナル。そこで、本研究で開発したプロトコルはstimul含まTGF-β1及びTNF-αの両方によってエーション。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	シグマaldrich	11965-092	A549中
型FBS	GIBCO	10437
成長因子-&β;1、人間、組換え	和光研究所の化学物質	209-16544
換えヒトTNF - アルファ;	R&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 希釈
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000
希釈 Anti-α-Tubulin antibody	sigma aldrich	T9026	1:10,000 希釈
モノクローナル Anti-Actin, &α;-Smooth Muscle antibody	sigma aldrich	A5228	1:10,000 希釈
抗N-カドヘリン抗体	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 希釈
抗マウス IgG, HRP結合全腹筋羊 (二次抗体)	GE ヘルスケア	NA931-100UL	1:20,000 希釈抗
ウサギ IgG, HRP結合全腹筋ロバ (二次抗体)	GE ヘルスケア	NA934-100UL	1:20,000希釈
ブロッキング試薬	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	corning	#353046
100 mm Cell culture dish	TPP	#93100
DMEM, powder	life technologies	12100-046	For 4×DMEM
1型コラーゲンゲル	新田ゼラチン	セルマトリックス I-A
24ウェル細胞培養プレート	AGC テクノグラス	1820-024
ゲルドキュメンテーションシステム	ATTO	AE-6911FXN	ゲルイメージャー
ゲル解析ソフト	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%) フェノールレッド	ライフテクノロジー	25300054
24ウェルプレート 未処理	イワキ	1820-024
トリパンブルーソリューション 0.4%	ライフテクノロジー	15250-061
RNA抽出キット	Qiagen	74106
逆転写酵素	のライフテクノロジー	18080044
リアルタイムPCRシステム	Stratagene	Mx-3000P
SYBRグリーンPCRキット	Qiagen	204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDFメンブレン	ATTO	2392390
Protein assay kit	bio-rad	5000006JA
ポリアクリルアミドゲル	ATTO	2331810
ウエスタンブロッティング検出試薬	GE ヘルスケア	RPN2232
コールドCCDカメラ	ATTO	Ez-Capture MG/ST
トリプシン阻害剤	sigma aldrich	T9003-100MG
ポリオキシエチレン (20)ソルビタンモノラウレート	和光研究所 化学薬品	163-11512
ポリオキシエチレン (9) オクチフェニルエーテル	和光研究所 化学品	141-08321