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DOI:

10.3791/53974

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2016年6月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

この記事について

サマリー

ここでは、上皮間葉転換を経験した間葉系細胞の収縮機能を評価するためのゲル収縮アッセイの開発と応用について説明します。

要約

線維症は、間質性肺疾患などのさまざまな慢性進行性疾患の病因に関与することがよくあります。病理学的特徴は、疾患の重症度に関連する線維芽細胞性病巣の形成です。線維芽細胞病巣からなる間葉系細胞は、もともと常在する肺内線維芽細胞や骨髄由来の循環線維細胞など、いくつかの細胞源に由来することが提案されています。近年、上皮間葉転換(EMT)を受けた間葉系細胞も線維化の病因に寄与すると考えられてきた。さらに、EMTは成長因子βのトランスフォーミングによって誘導することができ、EMTは腫瘍壊死因子αのような炎症誘発性サイトカインによって増強することができます。ゲル収縮アッセイは、線維芽細胞の特徴的機能の1つであり、創傷修復や線維化に寄与する収縮性の評価に理想的なin vitroモデルです。ここでは、EMTを受けた間葉系細胞の収縮能力を評価するためのゲル収縮アッセイの開発が実証されています。

概要

線維症は、間質性肺疾患、心臓線維症、肝硬変、末期腎不全、全身性硬化症、および自己免疫疾患の1のような種々の慢性進行性疾患の病因に関与しています。間質性肺炎のうち、特発性肺線維症（IPF）は慢性進行性疾患であり、予後不良を示しています。 IPFの病理学的特徴は予後と関連している活性化された線維芽細胞および筋線維芽細胞からなる線維芽細胞巣の開発です。このような肺の線維芽細胞の起源は、もともと常駐肺線維芽細胞及び骨髄から循環する線維細胞を含むいくつかの間葉系細胞に由来することが提案されています。最近、上皮間葉移行（EMT）は、間葉細胞2の形成に関連することが提案されている、および線維性疾患の病因に貢献します。

これは、と考えられているEMTは、腫瘍の浸潤および転移3を含む胎児の発育、創傷治癒、および癌の進行の過程で重要な役割を果たしています。 EMTのプロセスに続いて、上皮細胞は、E-カドヘリンなどの上皮マーカーの損失により、間葉系細胞の能力を取得し、そのようなビメンチンのような間葉マーカー、およびα平滑筋アクチン（SMA）4,5の発現による。以前の研究は、EMTプロセスは腎臓6および肺7における組織線維症の発症に関連しているという証拠を示しました。さらに、慢性炎症は、線維性疾患8を促進します 。さらに、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー14（TNFSF14、LIGHT）などの炎症性サイトカイン、腫瘍壊死因子（TNF）-α、インターロイキン1βは、EMT 9-12を増強することが示されています。

コラーゲンゲル収縮アッセイ線維芽細胞は、I型に埋め込まれたコラーゲンベースの細胞収縮アッセイコラーゲンゲル三次元、収縮性を評価するためのインビトロモデルにおける理想的です。収縮は、線維芽細胞の特徴的な機能の一つであり、正常な創傷修復および線維症13に貢献しています。このアッセイでは、線維芽細胞の付着は、いくつかの条件の下で機械的張力を生成することになっている私はインテグリン依存性のメカニズムを介して型コラーゲン、その結果、組織の収縮につながると考えられています。

ここで、ゲル収縮アッセイの開発は、EMTを受けた細胞における収縮機能の獲得を評価するように適合されることが報告されています。このレポートには、この修正されたアッセイは、EMTを経た間葉細胞で収縮性を評価するのに適していることを示しています。

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プロトコル

1.準備と文化肺上皮細胞の

  1. 10％ウシ胎児血清（FBS）、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養A549ヒト肺上皮細胞（付着細胞株）。
  2. 取り外し、廃棄し、細胞培養培地を培養皿から5で1回洗浄 - リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlの。洗浄後、すぐにPBSを吸引。
  3. 3分間CO 2を 2 mlのトリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（0.05％）を添加し、37℃でインキュベートし、5％。
  4. 4分間室温でチューブは150×gで遠心分離、細胞培養培地を含む遠心管で剥離した細胞を収集します。
  5. 細胞は、細胞培養培地2mlにペレット再懸濁し、細胞計数のためのサンプルを削除します。細胞生存率をチェックするためにトリパンブルー染色と血球計数器を用いて細胞数をカウントします。
  6. 上のシードA549細胞0.5の密度で10cmのポリスチレンプレート-ゲル収縮アッセイ用培地10mlで1.0×10 6細胞/皿。 0.5の密度で6ウェルのポリスチレンプレート上の細胞をシード- 1.0×10 5細胞/ウェルとEMT確認のための培地2ml。 24時間37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。

2. EMT手順

  1. ステップ1.6に播種ゲル収縮アッセイ用プレートにTGF-β1（5μg/ mlの）を10μlおよびTNF-αを10μl（10μg/ ml）を追加します。ステップ1.6に播種EMT確認用のプレートにTGF-β1（5μg/ mlの）2μlのとTNF-αの2μlの（10μg/ ml）を追加します。 37℃でインキュベートし、48時間、5％CO 2。

PCRとウエスタンブロッティングによるEMT手順の3.確認

  1. 位相差顕微鏡を用いて処理した細胞の（石畳-等からのスピンドル形状に）形態の変化を確認してください。
    注：ノームをアルA549細胞は、上皮細胞の特徴である敷石状や三角形の外観を持っていますが、TGF-β1及びTNF-αで刺激した後、細胞が長く表示され、スピンドルはそれが間葉系細胞14,15に似ている形。
  2. このようなE-カドヘリンなどの上皮マーカー、およびそのようなN-カドヘリン、ビメンチン、およびPCRまたはウェスタンブロット法を用いて、α平滑筋アクチンなどの間葉系マーカーの発現を評価します。
    1. RNA抽出キット16を用いて細胞から全RNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従って逆転写酵素17を用いてcDNAを合成します。
    2. リアルタイムPCRシステム18と製造業者の説明書に従って単量体シアニン色素PCRキットを用いてmRNAレベルの発現を測定します。 GAPDHに特異的なプライマー（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ACTA2（α-アクチン-2）、CDH1（E-カドヘリン-1、E-カドヘリン）、及びVIM（ビメンチン）を表1に示します。 栄。
    3. 溶解する溶解緩衝液（ 表2）1％プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液を用いて細胞。タンパク質アッセイキット19,20を使用して、すべてのサンプルのタンパク質濃度を測定し、ポリアクリルアミドゲルへのタンパク質の同じ量を適用します。
      1. SDSゲル電気泳動し、PVDF膜21へのタンパク質のセミドライトランスファーを行います。 2時間 - 1のためのブロッキング緩衝液中で一次抗体で膜をインキュベートします。インキュベーション後、洗浄緩衝液で2回、膜を洗浄し、二次抗体を有する膜で1時間インキュベートします。
        注：これらの研究において使用される抗体および希釈液のためのマテリアル/機器の表を参照してください。ブロッキング緩衝液の構成要素については、 表2を参照してください。
      2. 二回洗浄緩衝液で膜を洗浄します。冷たいCCDカメラ11,23を用いてウェスタンブロッティング検出キット22を有する膜の写真を撮ります。

4。 EMTを評価するためのゲル収縮アッセイ

  1. 細胞培養容器からの馴化培地を吸引し、5でよく洗う - 死んだ細胞を除去するためにPBSの10ミリリットル。洗浄後、すぐにPBSを吸引。
  2. 3分間CO 2を 0.05％トリプシン/ EDTAの2ミリリットルを加え、37℃でインキュベートし、5％。
  3. DMEMを150×gで4分間室温でトリプシンインヒビター（1mg / mlの）、遠心管をを補っ含む遠心チューブに剥離した細胞を収集します。
  4. 蒸留水で1型コラーゲンゲルを混合し、DMEMを濃縮4×1.75 mg / mlでのコラーゲン濃度を達成するためにボリュームを調整するために、1×DMEM濃度。このステップの間に氷の上でのゲル媒体を保つようにしてください。
    注：タイプ1コラーゲンゲル（3 mg / mlで）のほか3.5ミリリットルを混ぜ、ゲル培地の6ミリリットルを作成するには、4×1.5mlのDMEMを濃縮し、蒸留水1ミリリットル。
  5. 500μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、細胞計数のためのサンプルを削除します。カウントトリパンブルー染色を用いて血球計数器を用いて細胞の数は、細胞生存率をチェックします。
  6. よく3.0×10 5細胞/（6.0×10 5細胞/ ml）の細胞密度を達成するために、ボリュームを調整し、穏やかに、しかしすぐにゲル化することなく、ピペットでそれを混合するためにゲル媒体を追加します。
  7. きちんとした円筒状の形を作るために迅速かつ慎重に、24ウェル、無処理プレートの各ウェルに混合物の0.5ミリリットルを分注します。任意の気泡がゲル（ 図1A）を汚染することを可能にしないように注意してください。
    注：細胞を含むゲル培地は、粘性であり、容易に十分にゲル化し、フォームの三日月形することができます。
  8. 37℃の細胞インキュベーターで15分間プレートをインキュベートし、5％CO 2および95％湿度で完全にゲル化します。
  9. 1方向の周囲を描画する方法で滅菌スパチュラを移動することによって破壊することなく、プレートからゲルを外します。スパチュラを用いて、優しくを60mm組織培養皿にゲルを移しますTGF-β1を含むまたは含まないDMEM / 1％FBS（5ng / ml）およびTNF-α（10ng / mLの）の5 mlを含みます。
  10. ゆっくりゲルは媒体上に浮いていることを確認するために料理を振ります。 37℃、5％CO 2および95％湿度で、細胞インキュベーター中でインキュベートします。

ゲルサイズの5測定

  1. 画像解析システムを用いて、0、24、48、及び72時間後のコラーゲンゲルの大きさを測定します。
    1. ゲルドキュメンテーションシステム（ 図2A）をオンにし、遮光キャビネットに皿を置きます。そして、キャビネット内の皿の蓋を取ります。
    2. 関連するゲル解​​析ソフトウェアを開きます。キャビネット内のゲルの画像を表示するには、メニューバーにある「画像取得ボタン」をクリックしてください。そして、ゲル（ 図2B）の写真を撮るために、メニューバーの「取得」をクリックします。
    3. メニューバー（ 図2C）で「検出ボタン」をクリックして、測定領域（黄色の円の私を調整マウスをドラッグすることによりn個図2C）。次に、メニューバーの「自動検出ボタン」をクリックします（ 図2Dでボタンを参照してください）。ソフトウェアは自動的にヒートマップ（ 図2D）を示すゲルを検出します。
    4. 画像処理によりゲルの輪郭線を抽出し、アウトライン（ 図2E）で囲まれた領域を計算するために「OK」をクリックします。領域が計算された後、計算された領域は、別個のポップアップウィンドウに表示されています。
      注：ゲルは、撮像中に重なる場合は、滅菌ピペットチップを用いて穏やかにゲルを移動します。

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結果

EMTの間に、上皮細胞は、E-カドヘリンなどの上皮マーカーを失い、そのようなビメンチンおよびα平滑筋アクチン4,5などの間葉系マーカーの発現を得ることができます。 TGF-β1及びTNF-αとのA549ヒト肺上皮細胞のインキュベーションは、EMTを誘導します。通常のA549細胞の出現は、上皮細胞（ 図3A）の特徴である形状や三角形のような石畳ですが、TGF-β1及びTNF-αで刺激した後、外観は間葉に似ている長い紡錘形に変更しました細胞（ 図3B）。

上皮および間葉系マーカーの発現は、細胞がEMTを受けたことを確認するために評価しました。相対的mRNA発現は、ΔΔCT法を用いて計算しました。個々のデータは、ハウスキーピングgであるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に対して正規化しましたエン。 TGF-β1と48時間TNF-αで処理された...

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ディスカッション

本研究で開発されたプロトコルは、2つのステップを含みます。最初のステップは、第二段階は、ゲル収縮アッセイがあるが、EMTを誘導するために行われます。それは、細胞がEMTを受けたことを確認することが重要であるので、ステップ2は、形態学的および遺伝子発現の変化に優れた補数を提供します。以前の研究は、A549細胞のEMTは、TGF-β1のみ24によって誘導されたことを示しました。我々は以前に10を報告しているようしかし、TNF-α処理は、EMTおよび間葉細胞マーカーの獲得を強化します。 TGF-β媒介EMTのメカニズムはSMAD依存25であると考えられています。 TNFαは、ゲル収縮の向上につながるTGF-β1によって誘導されるEMTを強化します。 TGF-β1によって誘導されるEMTの増強のためのTNFαのメカニズムはSMAD2リンカー領域の唯一のリン酸化ではないことが報告されているだけでなく、規制26 MAPKシグナル。そこで、本研究で開発したプロトコルはstimul含まTGF-β1及びTNF-αの両方によってエーション。

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開示事項

著者らは、開示する利害の競合がありません。

謝辞

技術的な助けをくださった小山正博士に感謝します。本研究は、日本学術振興会科研費 Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172;厚生労働省からの呼吸不全研究グループへの助成金。アレルギー疾患と免疫学の研究助成。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMシグマaldrich11965-092A549中
型FBSGIBCO10437
成長因子-&β;1、人間、組換え和光研究所の化学物質209-16544
換えヒトTNF - アルファ;R&D systems210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAbCell Signaling Technology#31951:3,000 希釈
Vimentin (D21H3) Rabbit mAbCell Signaling Technology#57411:3,000
希釈 Anti-α-Tubulin antibodysigma aldrichT90261:10,000 希釈
モノクローナル Anti-Actin, &α;-Smooth Muscle antibody sigma aldrichA52281:10,000 希釈
抗N-カドヘリン抗体BD Transduction Laboratories#6109201:1,000 希釈
抗マウス IgG, HRP結合全腹筋羊 (二次抗体)GE ヘルスケアNA931-100UL1:20,000 希釈抗
ウサギ IgG, HRP結合全腹筋ロバ (二次抗体)GE ヘルスケアNA934-100UL1:20,000希釈
ブロッキング試薬GE HealthcareRPN4182% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lidcorning#353046
100 mm Cell culture dishTPP#93100
DMEM, powderlife technologies12100-046For 4×DMEM
1型コラーゲンゲル新田ゼラチンセルマトリックス I-A
24ウェル細胞培養プレートAGC テクノグラス1820-024
ゲルドキュメンテーションシステム ATTOAE-6911FXNゲルイメージャー
ゲル解析ソフトATTODensitograph, ver. 3.00AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%) フェノールレッドライフテクノロジー25300054
24ウェルプレート 未処理イワキ1820-024
トリパンブルーソリューション 0.4%ライフテクノロジー15250-061
RNA抽出キットQiagen74106
逆転写酵素のライフテクノロジー18080044
リアルタイムPCRシステムStratageneMx-3000P
SYBRグリーンPCRキットQiagen204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)life technologies78429
PVDFメンブレンATTO2392390
Protein assay kitbio-rad5000006JA 
ポリアクリルアミドゲルATTO2331810
ウエスタンブロッティング検出試薬GE ヘルスケアRPN2232
コールドCCDカメラATTOEz-Capture MG/ST
トリプシン阻害剤sigma aldrichT9003-100MG
ポリオキシエチレン (20)ソルビタンモノラウレート和光研究所 化学薬品163-11512
ポリオキシエチレン (9) オクチフェニルエーテル和光研究所 化学品141-08321
変換組ズ ズ

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