レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

Summary

この作業では、活性エンハンサーがどのように特定され、実験的に検証されるかについての実験的なワークフローを提供します。

Abstract

胚発生は、多くの遺伝子の活性化と抑制を含む多段階プロセスです。ゲノム中のエンハンサーエレメントは、組織及び細胞分化の間の遺伝子発現の細胞型特異的調節に寄与することが知られています。したがって、それらの同定およびさらなる調査は、細胞の運命を決定する方法を理解するために重要です。遺伝子発現データ（ 例えば、マイクロアレイまたはRNA-seqの）およびクロマチン免疫沈降（ChIPの）ベースのゲノムワイドな研究（チップ配列）の結果の統合は、これらの調節領域の大規模な同定を可能にします。しかしながら、細胞型特異的エンハンサーの機能的検証は、in vitroおよびin vivo実験手順でさらに必要とします。ここでは、アクティブなエンハンサーを同定し、実験的に検証できる方法について説明します。このプロトコルは、ステップバイステップのワークフローを提供します：1）のChIP-seqのデータ解析による調節領域の同定、2）クローニングおよびEXPERimentalレポーターアッセイで同定されたゲノム配列の推定調節の可能性の検証、およびエンハンサーRNA転写物のレベルを測定することにより、in vivoでのエンハンサー活性の3）決意。提示されたプロトコルは、ラボでは、このワークフローを設定するために誰を助けるために十分に詳述されています。重要なことに、このプロトコルは容易に適応し、任意の細胞モデル系において使用することができます。

Introduction

発達中の組織全体で数千の遺伝子の発現を正確に制御する必要があります。遺伝子発現の調節は、主にエンハンサーによって達成されます。エンハンサーは、転写因子(TF)と結合し、離れた場所から標的遺伝子の転写を活性化するために作用する短いノンコーディングDNA要素です¹。エンハンサーは一般にシス作用性であり、転写開始部位(TSS)のすぐ上流に最も頻繁に見られますが、最近の研究では、エンハンサーが遺伝子の3'上、またはイントロンとエクソン²内でも、はるかに上流で見つかった例も記載されています。

脊椎動物のゲノムには何十万もの潜在的なエンハンサーがあります¹.クロマチン免疫沈降法(ChIP)に基づく最近の方法は、エンハンサー分析^3-9に使用できる全ゲノムのハイスループットデータを提供します。ChIP-seq実験で得られたデータは、細胞や組織特異的なエンハンサーを同定する可能性を大幅に高めますが、検出された結合部位が必ずしも直接的なDNA結合や機能エンハンサーを特定するわけではないことに留意することが重要です。したがって、新たに同定されたエンハンサーのさらなる機能解析が不可欠です。この研究では、推定上の活性エンハンサーの同定と検証の基本的な3ステップのプロセスを紹介します。これには、1)ChIP-seqデータのバイオインフォマティクス解析による転写因子結合部位の推定選択、2)レポーターコンストラクトにおけるこれらの調節配列のクローニングと検証、3)エンハンサーRNA(eRNA)の測定が含まれます。

胚性幹細胞(ES)のレチノイン酸(RA)への曝露は、多能性細胞の神経分化を促進するために頻繁に使用されます¹⁰。RAは、RARα、β、γ)やレチノイドX受容体(RXRα、β、γ)に結合することでその効果を発揮します。RARおよびRXRは、ヘテロ二量体の形で、RA応答要素と呼ばれるDNAモチーフに結合し、通常はAGGTCA配列の直接反復(ハーフサイトと呼ばれる)として配置され、転写を調節します。リガンド処理実験により、ES細胞^11,12におけるいくつかのレチノイン酸調節遺伝子の同定が可能になった。しかし、これらの遺伝子の多くのエンハンサー要素はまだ記載されていません。ここで説明するワークフローをエンハンサーの同定とバリデーションにどのように使用できるかを示すために、胚性幹細胞における2つのレチノイン酸依存性エンハンサーの選択と特性評価を段階的に示します。

Protocol

チップ-seqの分析に基づく1エンハンサーの選択

1. http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/からRXRのChIP-seqの生データFASTQファイル（mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz）をダウンロード
2. 我々の場合で（位置合わせのために必要なBWAインデックスファイルをダウンロードし、解凍します。 Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
   注：バイオインフォマティクス解析の手順の詳細についてはhttps://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scriptsにアクセスして、以下で使用するスクリプトをダウンロードします。
3. （：perform_alignment.shスクリプトを使用）MM10ゲノムに例のFASTQファイルを合わせます。これは.bamファイルとアライメントの統計でフォルダを作成します。整列RXRのChIP-seqのデータ（mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam）、および対応するインデックスファイル（.bai）は、ここで使用できます。
   http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
   注：BWAはRELAを整列ソフトウェアパッケージです例えば、マウスの参照ゲノム（ 例えば^、MM10）13のような配列データベースにtively短い配列（ 例えば、のChIP-seqの結果）、。
4. ピークの呼び出しおよびデノボモチーフ解析のためのスクリプト（callpeaks.sh）を実行します。入力として.bamファイルを使用してください。スクリプトは、ホーマーfindPeaks ¹⁴に基づいています。
   注：出力ファイルは、私たちにピークの合計数、モチーフの濃縮、背景の割合、およびなどのモチーフと標的配列についての情報を与えます。 （ 図1）。典型的には、いくつかのモチーフは、その重要性の順に記載されています。
5. （：remap_motif.shスクリプトを使用）1位にランクモチーフ（NRの半分 `AGGTCA`）をリマップ
   注：この結果、スクリプトは、チップのピークが関心の転写因子の標準的な結合部位を含むゲノム領域をカバーしているが表示されます.bedファイルを生成します。
6. （mm_ES_RXをダウンロードして、読み込み整列RXRのChIP-seqの結果を可視化推定されるRAR / RXR結合部位（ 図2と図3）を識別するための統合的ゲノミクスビューア^（IGV）15によってR_24h_ATRA.bam（も.baiをダウンロード））とAGGTCAモチーフの発生（mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed）。
   注：さまざまなのChIP-seqのデータの統合は、より正確に良い候補増強剤に^16,17を予測するのに役立ちます。最近の研究では、アクティブなエンハンサーは、通常、P300について濃縮し、H3K4me1とH3K27acと相関し、また^{、18から21を}お勧めします、それによりDNアーゼI過敏症を表示し、開いたクロマチン領域に配置されていることを明らかにしました。
7. 選択されたゲノム領域の400塩基対の配列と、それに続くプライマーの設計のためにこれらの配列を使用する- 200を得るために、IGV ¹⁵に「 関心領域の定義 」 を使用します。

2.レポーターアッセイ

注：ルシフェリン/ルシフェラーゼ系が使用されています転写調節のために非常に敏感なレポーターアッセイとして。エンハンサー活性に依存するルシフェラーゼ酵素を検出することができるbioluminescense、その結果ルシフェリンをオキシルシフェリンの酸化を触媒すること製造されます。最初のステップとして、同定された推定エンハンサー配列は、レポーターベクター（ 例えば、TK-ルシフェラーゼ^22、のpGL3またはNanoLuc）にサブクローニングする必要があります。

1. プライマーの設計
   1. （：http://bioinfo.ut.ee/primer3/ここから入手可能^）23プライマー3によって推定されるエンハンサー領域の400bpの- 200の増幅のための設計PCRプライマー
   2. プライマー3（ステップ1.7を参照）に推定結合部位を含むIGVからゲノム配列をコピーし、貼り付けます。プライマー3で300 bpの - 250に設定し、製品のサイズ範囲。
   3. インシリコ PCRツール^{（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）24} で UCSCゲノムブラウザのを使用して、PCRプライマーを検証
      注：後の工程でこのプロトコルは、のHindIIIを使用していますIおよびBamHI制限は、クローニングのための酵素。 インシリコ PCRツールは（ 例えば、http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）AAGCTTまたはGGATCC制限部位が含まれていますUCSCによって予測されるようにPCR増幅した配列かどうかを確認してください。
   4. 商用ベンダーから必要なプライマーを入手します。
2. ゲノムDNAからのエンハンサー配列のPCR増幅
   1. 初代細胞（ 例えば、初代胚線維芽細胞）からテンプレートのゲノムDNAを精製します。 gDNAの単離のための市販のキットを使用し、製造元の指示に従ってください。
      注：のgDNAの高品質が成功したPCR増幅のために不可欠です。 PCRは、gDNAをより容易でない場合は、適切なBACクローンを使用することができます。
   2. gDNAのngの100を含む50μlのPCR反応を準備し、5μlの10×緩衝液、3μlの_硫酸マグネシウム（25 mM）の、5μlのdNTPを（各2mM）、1.5μlの早送りプライマー（10μM）、1.5μlの改訂プライマー（10μM） 、1μlのDNAポリメラーゼ
      注：PCR反応のための低エラーレートと高忠実度DNAポリメラーゼを使用してください。
   3. PCRサイクル設定（2分95℃、（20秒95℃、10秒を58から65°C、18秒70°C）のx25繰り返し、2分70°C、永遠に4°C）。プライマーのを考慮した設定アニール温度は、Tm値を予測しました。
   4. 商業PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、製造元の指示に従ってください。
   5. 上記で使用されるプライマーを用いてPCRを繰り返し、それらの5 '末端（ 例えば、早送り：5'-ATAT AAGCTTの xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3'のオーバーハングを追加することによって、クローニングのための制限部位を導入する（HindIIIで）、REV：5'- TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '（BamHIで））。
   6. 非特異的なPCR産物を確認するためにアガロースゲル上でPCR産物の5μLを実行します。
      注：複数のバンドが検出された場合、全体のPCR産物を実行し、商業ゲル抽出キットを用いて適切なバンドを精製します。
3. 制限
   注：HindIII及びBamHIで消化されるべきであるTKプロモーター²²精製したPCR産物およびベクター（ 例えば、TK-リュック）の上流に挿入クローニングするために。
   1. 1μgの精製PCR産物、1μlのをHindIII（20 U /μl）を、1μlのをBamHI（20 U /μl）を5μlの10×緩衝液を含む50μlの反応混合物を準備します。
   2. 5μgのベクター（TKリュック、または代替レポーターベクター）、5μlのをHindIII（20 U /μl）を、5μlのをBamHI（20 U /μl）を、5μlの感熱アルカリホスファターゼ（1 U /μl）を含む250μlの反応液を調製そして、25μlの10×バッファー。
      注：ベクトルのAP処理が大幅に単一消化ベクターのセルフライゲーションので、バックグラウンドを減少させます。
   3. 次に商用PCR精製キットを用いて消化したPCR産物およびベクターを精製し、37℃で4時間、反応混合物をインキュベートします。
4. Ligation個
   1. 2μlの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液、10 ngのTK-Lucベクター、50ngのインサート（消化したPCR産物）、1μlのT4 DNAリガーゼ（400 U /μl）を、およびヌクレアーゼフリー水を含むPCRチューブ内ライゲーション反応をセットアップします20μlのまで。
      注：反応は、インサートを含まないネガティブコントロールを準備します。
   2. 静かにピペッティングすることによって反応をミックスダウン、ミニ遠心機を使用して簡単にPCRチューブをスピンダウンした後、室温で10分間インキュベートします。
   3. 熱は氷の上でリラックスし、50μlのコンピテント細胞（ 例えば、DH5α）への形質転換のために、製品の5μLを使用し、その後65℃で10分間不活性化します。
   4. 市販のキットを用いて、細菌を形質転換コロニーをピックアップし、プラスミドDNAを単離するための標準的な熱ショック手順を使用します。次のステップの前に配列決定することにより全ての構築物を検証します。
5. ES細胞のトランスフェクション
   1. 48ウェルプレートを使用してください。 200μlの0.1％のゼラチンsolutを追加します。細胞播種の前にイオン/ウェルの30分。
   2. 板胚性幹（ES）細胞をトランスフェクションの前日。 /ウェル250μlのES培地でウェルあたり3×10 ⁴細胞の密度で、フィーダーを含まないES細胞とプレートを使用してください。
   3. 。プラスミドミックスを準備ミックス （各ミックスは、未処理の4,4は、レチノイン酸処理した8ウェルについて計算される）1：1250 ngのTK-Lucの空（ネガティブコントロール）、950 ngのβガラクトシダーゼコーディングベクトル（のβGal）、 ミックス2 ：1250 ngのTK-LucのHOXA1エンハンサー（ポジティブコントロール）、のβGalngの950、 ミックス3：1250 NGのTK-LucのPRMT8エンハンサー（関心領域）、950 ngののβGal。
      注記：ES細胞は、所望の転写因子を発現する（RAR / RXR）。ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ測定中に、後に基準値を決定するためにトランスフェクトしていない井戸を残します。
   4. 106μlに（8ウェルについて十分な）総容量をミックス各プラスミドにトランスフェクション品質低血清培地を追加します。
   5. 4.5μlのES品質トランスフェクションを追加します。イオン試薬は、次に上下に15回ピペッティングすることによって慎重に混ぜます。 RTで10分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。
   6. 、ウェルあたりの細胞にトランスフェクション混合物の13μl加え、ピペッティングにより完全に混和します。バックリガンド処理前のインキュベーター（37°C）O / Nへの細胞を配置します。
   7. 細胞からの吸引により慎重にメディアを取り出して、250μlを添加する新鮮な培地/ウェル0.01含む - 車両として最終濃度またはDMSOなど1μMの全トランスレチノイン酸（RA）を。 48時間 - 24細胞をインキュベートします。
      注：レチノイン酸は光に敏感です。
6. 細胞溶解物の調製
   1. 希薄5倍の溶解緩衝液（1.25ミリリットル0.5 MトリスpH値= 7.8、H ₂ Oで1ミリリットルの1Mジチオスレイトール（DTT）（）、10ミリリットルの0.1M EDTAをpH = 8.0、50ミリリットルの無菌グリセロール、5ミリリットルのTriton X-100、 100ミリリットルまで水）は、滅菌水を使用して1倍20μlの1 M DTT / 10ミリリットルを追加し、使用前に室温に平衡化します。アッセイの日に48ウェルプレート用の10ミリリットルを準備します。
   2. 細胞からの吸引により慎重にメディアを取り出します。 1×PBSで細胞を1回すすいでください。細胞に200μlの1×溶解緩衝液/ウェルに直接追加します。
   3. RTで2時間（化学溶解）振とうします。 -80°C（機械的溶解）でプレート上の細胞溶解物をフリーズします。溶解物を数日間-80℃で保存することができます。
   4. 溶解物を解凍します。完全に解凍した後、電子マルチチャンネルピペットを用いて96ウェルプレートに細胞溶解物を移します。 βガラクトシダーゼアッセイおよびルシフェラーゼ測定用の白色板に細胞溶解物の40μlのための96ウェル透明プレートに移し、細胞溶解物の80μlのを。任意の気泡を形成することは避けてください。
7. βガラクトシダーゼアッセイ
   注：ベータガラクトシダーゼまたは代替第二のレポーターは、非特異的な実験のばらつきを考慮するために、内部コントロールとして使用されるべきです。
   1. βガラクトシダーゼ基質緩衝液を準備します：80.0グラムのNa ₂ HPO _{4•7H 2} O、3.8グラムののNaH ₂ PO _{4•H 2} O、30.0グラムのKCl、1.0グラムのMgSO _{4•7H 2} O、滅菌水で千ミリリットルに構成しています。 pHを7.4に調整します。滅菌（0.2ミクロン）を濾過し、4℃で保存
   2. 4ミリグラムONPGで1ミリリットルβガラクトシダーゼ基質緩衝液を混合（o-ニトロフェニルβ-D-ガラクトシダーゼ）。使用直前に緩衝液1mlあたり2メルカプトエタノール（βME）の3.5μlを添加します。 80μlの細胞溶解液に100μlのβガラクトシダーゼ基質緩衝液を追加します。
   3. かすかな黄色が開発されるまで、37℃で反応をインキュベートします。プレートリーダーおよびエクスポートデータにOD 420 nmの吸光度を読みます。
      注：時間は、通常、もう30分より、トランスフェクション効率に依存して変化しません。
8. ルシフェラーゼアッセイ
   1. 、50ミリリットルポリプロピレンチューブに追加し、15.1ミリグラムD-ルシフェリン塩、82.7 mgのATP塩、185 mgの硫酸マグネシウム_{4•7H 2} O：50ミリリットルルシフェリン基質試薬を準備しますその後、1.5ミリリットルの1M HEPESバッファー、48.5ミリリットルATP遊離水、渦を追加するすべての化合物が完全に溶解していることを確認します。 -80℃で10ミリリットルのアリコート - 5を保管してください。
   2. 開始する前に室温に温まる5ミリリットルルシフェリン基質試薬。細胞溶解物の40μLを含む白色プレートの各ウェルにピペットで100μlの基質試薬および発光カウンター機を用いて、すぐの信号を測定します。
   3. 三重トランスフェクションでは、少なくとも3つの独立した実験からのアクティビティを取得します。
   4. 測定された各値から非トランスフェクトされた細胞について測定した平均値を減算することにより、最初の各ウェルのベース正規化されたルシフェラーゼ活性とベース正規化されたβガラクトシダーゼ値を計算します。その後、ルシフェラーゼ/βガラクトシダーゼ活性の比率を計算します。

エンハンサーRNAの3キャラクタリゼーション

注：エンハンサー活性のより直接的な指標は、最近のゲノムワットから浮上していますエンハンサーから転写され、およびエンハンサーの^{RNA（eRNAs）16,25,26（} 図4）と呼ばれるntの50から2000までの範囲の大きさの多くの短い非コードRNAを、識別されたIDE研究。エルナ誘導は非常に隣接するエクソンをコードする遺伝子の誘導と相関します。したがって、信号依存エンハンサー活性は、RT-qPCRにより種々の条件の間のエルナ産生を比較することにより、in vivoで定量化することができます。

1. RT-qPCRによりエルナ検出用プライマーの設計のためのガイドライン
   1. 2キロバイト離れた注釈付きの転写開始部位から - 少なくとも1.5であるエルナ測定のためのゲノム領域を選択します。
      注：重要なのは、遺伝子内エンハンサー全体のmRNA転写の高レベルはセンス方向でエルナの正確な定量化を防ぐため、遺伝子内エンハンサーでのアンチセンスeRNAsは、検出可能であり、遺伝子外エンハンサーでeRNAsにレベルが類似しています。
   2. 一般的なルールとして、地域200を使用 - 1,000 bpのあちこちセンスまたはアンチセンス鎖（ 図4、 図6）のプライマー設計のための目的の転写因子結合部位の中心をmです。
      注：GRO-seqの、DNアーゼ-seqの、H3K4me1、H3K4me3とまたはH3K27acのChIP-seqのデータは、それがより正確なプライマー設計に使用することができ、所望の細胞型および条件から市販されている場合。 eRNAsはH3K4me1とME3の高いレベルを特徴と推定されるエンハンサー領域から転写されます。 eRNAsの発現は、積極的に活性化されたエンハンサーヒストンマークH3K27acの濃縮と相関します。
   3. プライマー3によってeRNAsの蛍光染料ベースのRT-qPCRの測定のための設計PCRプライマー^{（http://bioinfo.ut.ee/primer3/）23}に従って、プライマー設計のためのアンチセンス配列（センス鎖の相補体を反転）を生成します。 http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html。プライマー設計のためのセンスまたはアンチセンス配列の300bpの - 200を挿入します。
2. エルナ転写の測定
   1. 製造業者の推奨に従って商業酸性フェノール/クロロホルムベースの抽出試薬で処理した細胞から全RNAを分離します。
   2. 前逆転写反​​応でそれらを使用して単離されたRNAを治療するためのDNアーゼIを使用してください。逆転写の前に、製造業者の推奨に従ってDNアーゼを不活性化します。
   3. DNアーゼI処理した後、RNA濃度を測定し、RT反応1,000 ngのを使用します。高品質の逆転写酵素を使用してください。
      注：eRNAs多数のポリアデニル化されないかもしれないように、逆転写は、ランダムプライマーの使用を必要とします。
   4. 検出は、逆の標準的な手順を用いて、RT-qPCRによりエルナを転写しました。正規化のための非治療に依存してmRNAを測定する（ 例えば、36B4、PPIA、GAPDH、ACTB）。

Results

我々はゲノムワイドRA調節遺伝子は、その近接して受容体濃縮を持っている識別するために、汎特異的RXR抗体を使用します。レチノイン酸で処理されたES細胞から得られたRXRチップ、配列データのバイオインフォマティクス解析は、RXR部位を占領下で核内受容体半部位（AGGTCA）（ 図1）の濃縮が明らかになりました。バイオインフォマティクスのアルゴリズムを用いて、我々はRXRのChIP-seqのデータ（ 図2）に半分サイトのモチーフ検索結果をバックマッピングされました。この分析は、正確に標準的な核内受容体結合部位と重複したものをChIPのピークを識別するために私たちを助けてくれました。 IGVにおけるこれらの部 ​​位の視覚化はHOXA1、以前に特徴付けRAR / RXRターゲット（ 図2及び図3）に近接して、これらの転写因子の濃縮を示しました。我々はまた、新規RA標的遺伝子、すなわちPRMT8 ^27を同定^{しました...}

Discussion

近年、シーケンシング技術の進歩により、多くの細胞型や組織におけるエンハンサーの大規模な予測が可能になりました ^7-9。上記のワークフローにより、ChIP-seqデータに基づいて選択された候補エンハンサーの一次特性評価を実行できます。詳細な手順と注意事項は、ラボで定期的なエンハンサー検証を設定するのに役立ちます。

ルシフェラーゼレポーターアッセイの最も重要なステップは、トランスフェクション効率です。すべての実験でトランスフェクション効率を推定するために、GFPコンストラクトを含めることをお勧めします。新鮮で良質のプラスミドを持つことは非常に重要であり、トランスフェクションを大幅に改善することができます。提示されたプロトコルは、任意のセルラーモデルシステムに適合させることができます。組織特異的エンハンサーの特性評価には、適切な細胞型を使用することを強くお勧めします。したがって、ルシフェラーゼレポーターアッセイでは、実験用に選択された細胞が効率的にトランスフェクション可能である必要があります。あるいは、目的の転写因子が(過剰)発現している場合には、簡単にトランスフェ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		gDNA
DNeasy Blood &ティッシュキット	ゲノムDNA分離用	Qiagen	69504
QIAquick PCR精製キット	PCR製品精製	Qiagen	28106
ゲル抽出キット	より多くのPCR産物がある場合のゲル抽出用の	Qiagen	28706
HindIII	NEB	R3104L	制限酵素
BamHI	NEB	R3136L	制限酵素
FastAP	Thermo Scientific	EF0651	5'-および3'-リン酸基の放出
			ゲーション
QIAprepプラス	ミド単離用	Qiagen	27106
DMEM	Gibco	31966-021	ES培地
FBS	Hyclone	SH30070.03	ES培地
MEM 非必須アミノ酸		Sigma M7145	ES培地
ペニシリン-ストレプトマイシン	Sigma	P4333	ES培地
β メルカプトエタノール	Sigma	M6250	ESメディア
FuGENE HD	Promega	E2311	フェクション試薬
Opti-MEM®I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-062	for transfection
All-trans retinoic acid	Sigma	R2625	ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate	Greiner	655101	for Beta galactosidase assay
96-well white plate	Greiner	655075	for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt	s Goldbio.com	115144-35-9	ルシフェラーゼアッセイ
ATP 塩	Sigma	A7699-1G	ルシフェラーゼアッセイ
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	ルシフェラーゼアッセイ
HEPES	Sigma	H3375-25G	ルシフェラーゼアッセイ用
Na2HPO4 •7H2O	Sigma	431478-50G	ベータガラクトシダーゼアッセイ用
NaH2PO4 •H2O	Sigma	S9638-25G	ベータガラクトシダーゼアッセイ用
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	ベータガラクトシ
KCl	Sigma	P9541-500G	ベータガラクトシダーゼアッセイ
ONPG (o-ニトロフェニル-&β;-D-ガラクトシダーゼ)	Σ	N1127-1G	ベータガラクトシダーゼアッセイ
TRIzol®	Life Technologies	15596-026	RNA単離
大容量cDNA逆転写キット	Life Technologies	4368814	eRNAの逆転写
Rnaseフリー	Dnase Promega	M6101	Dnase treatment
SsoFast Eva Green	BioRad	750000105	RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™リアルタイムPCR解析システム	BioRad		qPCRマシン
BioTek Synergy 4マイクロプレートリーダー	BioTek		カウンター