3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製インビボ

サマリー

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。

要約

歴史的に、ほとんどの細胞プロセスは2次元でしか研究されていません。 これらの研究は、一般的な細胞シグナル伝達メカニズムについて有益ですが、局所微小環境と細胞外マトリックス(ECM)の構造的および機械的特性から受け取る重要な細胞の手がかりを無視しています。生理学的ECM内で細胞がどのように相互作用するかを理解するためには、3次元アッセイの文脈で細胞を研究することが重要です。 細胞遊走、細胞分化、および細胞増殖は、3次元ECMの機械的特性の局所的な変化によって影響を受けることが示されているプロセスのほんの一部です。 ECMの中核となる線維成分であるコラーゲンIは、組織の単純な構造要素以上のものです。通常の条件下では、コラーゲンネットワークからの機械的な手がかりが形態形成を指示し、細胞構造を維持します。 腫瘍微小環境のような疾患微小環境では、コラーゲンネットワークはしばしば劇的に再構築され、組成の変化、沈着の促進、および線維組織の変化を示します。 乳がんでは、腫瘍境界に垂直に整列した線維の増加が患者の予後不良と相関しているため、線維の整列の程度が重要です¹。 整列したコラーゲンマトリックスは、持続的な移動を介して腫瘍細胞の播種を増加させます^2,3。 以下は、3次元の線維性コラーゲンハイドロゲル内に細胞を埋め込むための簡単なプロトコールです。 このプロトコールは、多くのプラットフォームに容易に適応でき、調整可能な3次元の生理学的微小環境における細胞移動、細胞分裂、およびその他の細胞プロセスを調査するために、整列コラーゲンマトリックスとランダムコラーゲンマトリックスの両方を再現性よく生成できます。

概要

多くの細胞プロセスは、2次元で広範囲に研究され、それによって基本的な細胞シグナル伝達メカニズムの集合的な知識を形成しています。しかし、これらの研究では、局所的な細胞微小環境と細胞外マトリックス(ECM)の構造的および機械的特性から得られる重要な細胞の手がかりが無視されています。生理学的状況下で細胞がどのように相互作用するかをよりよく理解するためには、3次元(3D)アッセイで細胞を研究することが重要です。 これらの3DアッセイのECMは、細胞由来のものでも、精製されたタンパク質から再構成したものでもかまいません。 ECMの出所にかかわらず、3Dマトリックスアッセイは、細胞が生理学的世界内でどのように移動し、相互作用するかを理解するために非常に貴重であることが証明されています。 例えば、3Dマトリックスで増殖した細胞は、周囲のECMの機械的性質に依存する明確な移動モードを示しますが、これは2D実験では観察されません^4-6。さらに、3Dで培養された細胞は、ガラスやプラスチックなどの硬い表面で成長した細胞よりも、ストレス繊維や焦点接着が少なく、目立たなくなっています⁷。

しかし、コンテクスト3Dアッセイの重要性は細胞移動に限定されません。 他のいくつかの細胞シグナル伝達イベントは、3Dアッセイを使用することによってのみ調査できます。 組織や細胞の分化時には、細胞外環境とECMの硬さが、形態形成イベントに影響を与えるシグナルを提供します。 例えば、乳腺上皮尿細管形成は、剛性の低い3Dマトリックスでのみ起こり、硬いマトリックスや2D基層では起こりません^8,9。 硬い3Dマトリックス内で培養すると、これらの同じ上皮細胞は、増殖が増加し、細胞膜の突出が変化したFAKおよびERKシグナル伝達によって駆動される異常な表現型を呈します¹⁰。他の多くのシグナル伝達経路や細胞プロセスが、局所的な細胞環境の硬さによって同様に影響を受けることが知られており、これらのシグナル伝達カスケードは、3D ECMの適切な局所的な機械的特性の文脈でシグナル伝達イベントと細胞表現型を調査することの重要性を強調しています。

コラーゲンIは、ECMの最も豊富な成分であり、細胞微小環境の多くの機械的特性に関与しているため、in vitro研究に使用するのに特に関連性のあるタンパク質です。 もともとは単なる構造タンパク質と考えられていましたが、現在ではその役割がはるかに複雑であることがわかっています。 コラーゲン繊維の組成、構造、配向、密度、および剛性はすべて、シグナル伝達情報の集中的な環境を提供します⁵。 慢性炎症や腫瘍形成などの特定の疾患の進行中に、コラーゲンネットワークは劇的に再構築されます^2,11。 より具体的には乳がんでは、コラーゲン沈着と組織硬化の増加が伴い、腫瘍の進行に寄与する可能性があります。これらの初期の腫瘍では、硬化したコラーゲンネットワークは緊張してより整列しているように見え、ほとんどの繊維が成長中の腫瘍をカプセル化しています²。 腫瘍が進行するにつれて、コラーゲンは再編成され続け、線維ネットワークの領域は腫瘍境界^2,12に対して垂直に配向するようになります。垂直アライメントは、これらの患者が無病進行と全生存期間が不良な予後バイオマーカーとして機能します¹。この相関関係の1つの説明は、悪い結果は、整列したコラーゲンネットワーク³での持続的な細胞移動による腫瘍細胞の播種の増加の結果であるということです。

腫瘍の進行で観察されるアライメントと組織化に対して細胞がどのように特異的に反応するかを理解するためには、実験のためにランダムおよびアライメントされた3Dコラーゲンマトリックスを生成する必要があります。線維ネットワーク内でアライメントを誘導するには、3つの基本的な方法論があります。 第1の技術は、2点間のコラーゲンが収縮または引き伸ばされて整列を生成するひずみ誘導装置を利用する。 力軸に平行な繊維はぴんと張られ、軸に垂直な繊維は圧縮されて座屈します。 ひずみ誘発技術は、通常、優れたアライメントを提供するが、このアプローチでは、多くのプラットフォーム^3,13に容易に適応できないかさばる機器が必要である。あるいは、細胞誘導株は、その後コラーゲン¹³を収縮して整列させる細胞の局在プラグを配置することによって作り出すことができる。 この方法には、多くのパラメータが変更される可能性があるため、変数であるという問題があります。 第2の方法は、磁気ビーズと重合中の磁場を利用してコラーゲンの整列を誘導する^13,14。 この方法からは、洗練されていない機器でも良好な結果を得ることができますが、ポリマーを磁化するために抗体または他の方法を使用する必要があります。 そのため、使用料がやや高額になる可能性があり、コラーゲンゲルの剛性は、ネットワーク内の接続性の増加によって変化する可能性があります。 さらに、このプロセスで使用される磁気ビーズは自家蛍光であることが多く、イメージング実験では問題となります。最後に、アライメントは、PDMSマイクロ流体チャネル^3、15、16によって生成することができる。 この方法では、小さなマイクロ流体チャネルを介して重合コラーゲンを流すことにより、コラーゲンの整列が達成されます。 これらのマイクロ流体チャネルは、さまざまな設計で作成でき、多くのプラットフォームに簡単に適応できます。 さらに、サイズが小さいため、コラーゲンやその他の試薬が非常に少量使用されるため、非常に経済的です。

ここで提供されるのは、3次元の線維性コラーゲンハイドロゲル内に細胞を埋め込むための簡単なプロトコルです。さらに、PDMSマイクロ流体チャネルを使用してコラーゲンマトリックスの組織化および整列を制御する、より高度な技術も提供される。このプロトコルは、多くのプラットフォームに容易に適応でき、3次元の生理学的微小環境における細胞移動、細胞分裂、およびその他の細胞プロセスを調査するために、整列したコラーゲンマトリックスとランダムコラーゲンマトリックスの両方を再現性よく生成できます。

プロトコル

1.中和、希釈および3D調査と細胞収縮アッセイのためのコラーゲンソリューションの重合

1. 滅菌組織培養フード中で氷上で、コラーゲン（1：1）を中和2×PBS、pH7.4中の滅菌、氷冷100mMのHEPESで、15ミリリットルコニカルチューブ内を。溶液が均一でないと、混合渦巻きが見えなくなるまで、プラスチックピペットを用いて完全に混合します。混合プロセスの間に気泡を導入しないように注意してください。氷の上で簡単に保管してください。
2. 細胞培地を用いて適切な濃度（ など RPMI、DMEM、など）に中和されたコラーゲンを希釈します。
   1. Nが必要な中和コラーゲンの量であり、（S / 2）/所望のコラーゲン濃度を構成するために必要な中和されたコラーゲンの量を計算式N =（Dの*のV）を使用するには、Dは、所望のコラーゲン濃度で、Vは所望の最終コラーゲン濃度の量、及びSをt彼は株式コラーゲン濃度を開始します。
   2. 細胞と細胞培地溶液を添加することによってボリュームに中和したコラーゲンの量を起動します。完全に混合し、キャストする準備ができるまで氷上で保存します。
      1. 例：1ミリリットルゲルボリューム（6ウェルプレートまたは50ミリメートルのガラスボトムディッシュでゲルキャスト用の典型的な量）中の2mg / mlのゲルについて、最初の所望の最終体積で所望の濃度（2mg / ml）を掛けます（1 ml）を。この数（2 mg）を取り、ボトルに記載されているストック濃度（9.49 mg / mlで）の半分で割り。この場合には、中和​​されたコラーゲンを0.42 mlの培地/細胞混合物0.58 mlを希釈します。
3. ピペットは、非組織培養のいずれかに、氷冷コラーゲン/細胞/培地の混合物を、6ウェルプレートまたは50ミリメートルのガラスボトムディッシュを処理しました。溶液を均等に広げるためにピペットチップを使用してください。
   注：collagの外の細胞の付着又は成長を最小化するために、非組織培養処理したプレートを使用することが重要ですゲルエン。
4. 15分 - 約10のために室温で重合することを可能にします。ゲルは、重合時に不透明有効にしてください。
5. 重合を完了するために60分 - それが不透明になった後、追加の45を37℃にプレート又は皿を移動します。
6. 45後 - メディアの3ミリリットルとウェルまたは皿の周囲P200のピペットチップを実行することにより、ウェルの側面からゲルをリリース - 60分、2を追加します。渦巻料理は優しくゲルを解放します。コラーゲンゲルは、メディアに浮遊する必要があります。

2.ウェスタンブロッティング、細胞形態形成やジェルGontractilityアッセイ

1. タンパク質レベル、ECMの剛性に関連する形態や細胞の収縮性を評価するために、コラーゲンゲルを注ぐことにより開始し、1.1に従って - 10日間のアッセイ - 1.6、7用の細胞を播種。成長率や密集度に応じて経験的に各細胞株の播種量を決定します。 100,000細胞/ゲル - 10日間のアッセイについては、播種密度20,000の範囲であり得ます。
2. 測定する細胞収縮性は、24時間毎定規またはカメラを使用するか、または適切な時間間隔でゲルの直径を測定します。
   注：細胞株の形態学的特徴の特性は、ゲルに播種するために加え、顕微鏡から収集し、対応する画像は、腺房様構造、上皮尿細管、細胞突起、及びlameliapodiaとして、調べることができます。
3. ウォズニアックに記載されているように^17、ギャラガーら ら 、タンパク質レベルを評価するRIPA緩衝液でゲルを溶解し、目的のタンパク質のウエスタンブロット分析のために処理した^。18。
   1. 重要：細胞株との間の収縮性の比較で、 らルイで概説したようにゲルから抽出することができる総DNAへの収縮性を正常化^19、または西洋によって変化しない、ハウスキーピングタンパク質（ヒストン、GAPDH など ）。ブロット分析、ウォズニアックらに記載されているように^17、ギャラガーら ^。18。血球計数器を用いてゲル内の細胞を計数した場合、請負ゲルなど総ゲル面積に細胞数を正規化することを確認した細胞を集中します。
4. メディアの1ミリリットルを除去し、新鮮な培地の1ミリリットルでそれを置き換えることにより4日 - フィードゲルごとに3。測定は新鮮な培地/血清の添加とした後、ゲルを供給するようにしてください収縮にスパイクが発生します。

コラーゲン繊維の位置合わせのためのPDMSマイクロチャンネルの3世代

注：整列コラーゲンマトリックスを生成するには、PDMSマイクロチャネル（ 図 2A）のための金型は、ソフトリソグラフィー^15を介して作られたSU-8シリコンマスターが必要です。

1. PDMSチャネルを作成するには、クラフトスティックで使い捨てカップに徹底的にPDMSを混ぜます。 6インチのシリコンマスターのために、硬化剤を2 gのエラストマーベース20gを混合します。
2. 脱ガスの減圧下で真空チャンバ内で使い捨てカップを配置することによってPDMS液550ミリメートルHgの。 1.5時間 - 1のための脱ガス。
3. PDMSを脱ガス発生が、注ぐためのシリコーンマスターを準備します。シリコーンマスターに続いて、ホットプレート上に透明フィルムのクリーンシートを配置することによって準備します。マイクロチャネルモールドは上向きいることを確認してください。
   注：PDMS鋳造および硬化中に、シリコーンマスタは透明フィルムの2枚のシートの間に挟まれます。
4. 1の後 - 1.5時間、真空チャンバーから脱気PDMSを削除して、ゆっくりとシリコーンマスターの上に注ぎます。
   重要：気泡を避けてください。マスターの中心に注ぐと、重力が均等にそれを広めることができるように続けます。
   注：PDMS降下がマスターの端にすべての方法を拡張する必要はありません。
5. PDMSをマスター上に注がれた後、シリコンマスターとPDMSの上に透明フィルムの第二シートを適用します。慎重に気泡を回避するために、PDMS /シリコンマスターの上に第二の透明シートを転がり落ちます。急がないで。 PDMSは今均等にoを分散させる必要がありますマスター版。
6. 静か1/8 "アクリル板に続いて透明性の上にゴムシートを配置。
7. アクリル板の上に3 10ポンドの重みを追加します。当初は、重みは「フロート」になります。彼らはさらに進む前に解決して安定化することを可能にします。
8. 4時間、70℃および硬化PDMSにホットプレートの温度を設定します。乱す前にさらに1時間の最小値のために冷却してください。
9. 慎重にウエハから透明フィルムのトップシートを剥離し、鉗子でチャンネルを削除します。
10. 使用する準備ができるまで無塵の皿に保管してください。

使用4.プレッピングPDMSマイクロチャンネル

1. 逆さまに新しい、きれいな透明フィルムの上に置いてチャンネル。鋭いピンセットで円運動を使用して清掃し、すべてのポート（ 図2b）。 PDMSの任意のフラグメントを削除します。
2. タッククロスとしてガムテープの一部を使って、クリーンチャンネル。ベンチ（粘着面を上）の表面にテープを適用し、その後、チャネルOを設定n個のトップ。良好な接触を確実にするために鉗子の丸い端を有するチャネルを押し下げます。削除して、目に見える破片が除去されるまで両側に繰り返します。
3. 洗浄転送は、70％EtOHで50ミリリットルコニカルにPDMSチャネルを準備さ。 30秒間最大速度でボルテックス。エタノールを捨て、新鮮な70％EtOHで置き換えます。使用する直前まで70％エタノールで保管してください。
4. 組織培養フード内で無菌技術を使用して、清潔で無菌カバーガラスやガラスボトムディッシュにPDMSチャネルを転送します。エタノールが蒸発するまで、チャネル側のアップとUV御馳走を置きます。
5. チャンネルはカバーガラスに向かって下向きにされるように乾燥したら、PDMSを反転。良好なシールを作るためにガラス上にPDMSチャネルを押し下げます。中央のポート（ポートB、 図2b）を閉じる/カバーするために滅菌PDMSのパッチを追加します。先に進む前には、完全に乾燥できるようにします。
6. プレコート滅菌水で10 / mlのコラーゲンとチャネルの内部。コー​​トに、channの上に100μlの液滴を配置エル、真空とを通して描きます。 37℃で1時間後、冷蔵庫へのコラーゲンコーティング溶液で満たされた転送チャネル。 30分 - 約15のためのチル。
7. 吸引器またはピペットでコラーゲンコーティング溶液を除去し、コラーゲンの準備を始めます。

マイクロチャンネルにおける使用のため5.コラーゲンの準備

1. 2×PBS、pH7.4中の氷冷100mMのHEPESで：氷上で、コラーゲン（1 1）を中和します。均一になるまで完全に混合（詳細については、1.1節を参照してください）​​。
2. 細胞培地を用いて適切な濃度に中和されたコラーゲンを希釈する（詳細については、1.2節を参照してください）​​。氷上で15分間インキュベートします。
3. 同時に、寒さは氷の上のチャネルを搭載しています。
   注：目標は4℃以下でのチャネル処理のためのすべてのコンポーネントを持つことです。コラーゲンの核形成温度及び時間は、重合プロセスに重要なパラメータであり、そして必要に応じて、さらなる最適化のための出発点であってもよいです。
4. COUNこの時に適切な播種密度で血球計および再懸濁を有するT細胞。 3百万個の細胞/ mlの - 計算を容易にするために、1に再懸濁します。 （詳細については、また、2.1節を参照してください）​​。
5. 細胞がカウントされ、15分が経過したら、注ぐコラーゲンに進みます。

6.注ぐ同盟とランダムコラーゲンマイクロチャンネル

1. チャネルを介してコラーゲンを描画する前に、調整し、インライン真空レギュレータと真空圧力を設定します。真空圧は、誘導し、アライメントの程度を決定するコラーゲンの流量を制御するための力を提供します。
   1. ランダムまたは非整列行列の場合、10ミリメートルHgの以下の真空圧と広いチャネル（3ミリメートル幅×身長200μm）を使用します。
   2. 整列行列に対して、60ミリメートルHgの以上の真空圧力で狭チャネル（1ミリメートル幅×200μmの背の高い）を使用します。
2. 氷からマウントされたチャネルを削除し、層流hのクリーン、消毒表面上に置きますOOD。
3. （ 図2b）、ポートAに中和されたコラーゲン150μlの-すぐに働くと120をロードします。
4. ポートc（ 図2b）を介して真空ラインに取り付けられた25ミリリットルピペットを配置することによって、チャネルを介してコラーゲンを描画します。単一、均一な動きで通ってコラーゲンを描画します。重要：ランダムまたはアラインされていない行列の場合、チャネルにわたってゆっくりとコラーゲンを描く（約0.5から1秒当たりミリメートル）、およびそれが最後に到達すると停止します。整列行列に対して、より迅速に渡ってコラーゲンを描くが、気泡を避けるように注意してください。
5. 慎重P200ピペットマンやアスピレーターでポート領域から過剰なコラーゲンを削除します。
6. AとCのすべてのポートが今カバーされるべきである両方のポートを介して滅菌PDMSパッチを配置します。
7. 2後 - 3分、中央PDMSパッチ（ポートB）を除去し、2を追加 - 中央ポートに - （1万細胞5）細胞の3μLを。 15分 - 部分的に別の10室温で（不透明ターン）重合させました。
8. 10後- 15分、さらに15、37℃への転送 - 重合を終了する30分。 PDMSのカバーを外し、必要に応じて完全にチャネルと文化のセルをカバーするためにメディアを追加。細胞は、古いメディアのミリリットルを除去し、新しいメディアのミリリットルでそれを置き換えることによって供給することができます。

結果

3Dアッセイは、コラーゲンゲルの同じ剛性内で行うことができるが、ゲルの剛性を変化させることは、細胞がそれらの細胞の微小環境における機械的な変化に応答する方法を決定するために使用することができます。堅いコラーゲンハイドロゲルは、埋め込まれた細胞が局所的に周囲のコラーゲンを収縮することができないゲルとして定義されています。異なる細胞型の本質的な収縮が独特であるため、それが準拠しており、硬いとして感知されるコラーゲン濃度を確立するために、単純な収縮曲線で始めるのがベストです。

細胞数を一定に保持し、コラーゲンゲルの濃度を増加させることによって開始します。以前に^10,20示すように、ゲルの剛性は、濃度とともに指数関数的にスケールします。収縮アッセイの代表的な例は、図1に示されている。ここでは、50,000 4T1細胞をeitheに埋め込 ​​まれていますRAの2mg / mlまたは5日間3.5 mg /...

ディスカッション

3Dコラーゲンゲルは、細胞がどのように解釈するかを理解し、それらの局所微小環境に対応するため、当社のツールボックスに貴重な追加されています。この原稿は、3Dコラーゲンマトリックス内に細胞を埋め込むための非常に基本的なプロトコルを提供している、かつ再現ランダムまたは整列したコラーゲン繊維とマトリクスを生成します。両方のプロトコルは、異なるコラーゲンアイソフォーム、架橋剤、または他のマトリックスタンパク質は、潜在的に重合時に添加することができる適応プラットフォームとして働きます。遺伝子発現およびタンパク質産生のために異なる時間枠およびエンドポイントを評価するためのプラットフォームを変更することも容易です。イメージング、タンパク質やRNAのレベルを評価し、代謝プロファイルを読み込むには、すべてのこれらの3D技術と非常に互換性があります。

すべての技術とが重要であるとして、ゲルおよびアッセイの品質を評価することが重要です。良質のコラーゲンゲルの符号は、手動操作を扱うことができるものです。例えば、1 mlの[1mg / mlの簡単にピンセットで拾い、操作されるべき]コラーゲンゲルは、6ウェ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高濃度ラットテールコラーゲン	コーニング354249
SylGard184エラストマーキット	PDMSチャンネル用コーニング	NC9285739	エラストマー
HEPES	フィッシャーBP310		HEPES中和
バッファーKCl	フィ	ッシャーBP366	HEPES中和バッファー用
KH2PO4	Fisher	BP362	HEPES中和バッファー用
Na2HPO4	sub>Fisher	S374	HEPES中和バッファー用
NaCl	Fisher	BP358	HEPES中和バッファー
用 賦課金改良型ノイバウアー血球計算計	Fisher	15170-208	cell counting
6-well non-tissue culture plate	コーニング	351146
50 mm ガラス底皿	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art プラスチック真空デシケーター	Bel-Art	F4200-2021	PDMS 透明フィルム用脱気チャンバー
	3M	pp2950	PDMSチャンネルを注ぐためのプラスチックフィルム
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	PDMSマイクロチャンネルを硬化させるためのホットプレート
真空レギュレータ	プレシジョンメディカル	PM3100	コラーゲンマイクロチャンネル用真空レギュレーター
8インチ x 8インチ ゴムシート	アマゾン - ゴムカル	シリコーン - 60A	PDMSマイクロチャンネルを注ぐためのゴムシート
8インチ x 8インチ x 0.125インチ アクリルシート	アマゾン	プレキシガラスシート
10ポンドの重量	PDMSマイクロチャネルを注ぐための	Amazon	CAPバーベル
15 mlコニカルチューブ	フィッシャー	352097
50 mlコニカルチューブ	フィッシャー	352098
プラスチックピペット	ドットサイエンティフィック	229202B、229206B、および667225B	2 ml, 5 ml、および25 ml
70% EtOH	フィッシャー	NC9663244