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方法論記事

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

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DOI:

10.3791/53995

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2016年9月20日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

この記事について

サマリー

このプロトコルは、効率的に新たに単離されたヒト絨毛細胞栄養芽層でのsiRNAのトランスフェクションマイクロポを使用して、これらの細胞におけるDNA-タンパク質複合体を同定するための方法が記載されています。トランスフェクトされた細胞は、ウェスタンブロットによりモニターすることができ、EMSAは、4日間の培養期間中に分析します。

要約

ヒトの一次絨毛細胞栄養芽細胞は、胎盤の機能や調節メカニズムを研究し、妊娠に関連する疾患を理解するための非常に有用な初代細胞の供給源です。このプロトコルでは、標準的なDNase/トリプシンプロトコルを通じて胎盤から新たに単離されたヒト一次絨毛性細胞栄養芽細胞を、低分子干渉RNA(siRNA)でマイクロポレーションします。このアプローチにより、リポフェクションベースの方法と比較して、siRNA トランスフェクションの効率が高かった。トランスフェクションした細胞は、その後、トランスフェクション後3〜4日以内に標準的なウェスタンブロットで分析できます。さらに、培養した初代絨毛細胞栄養細胞を用いて、1日目から4日目までの抽出物に対して、Electrophoretic Mobility Shift Assay(EMSA)分析を最適化し、実施しました。これらの培養初代細胞および記載されたプロトコルの使用は、合胞体栄養細胞様細胞層への絨毛性細胞栄養膜分化の過程における特定の遺伝子および転写因子の含意の評価を可能にする。しかし、培養で許容される期間が限られているため、安定した細胞集団の生成など、より多くの時間を必要とする方法を使用することはできません。したがって、この細胞集団の試験には、高度に最適化された遺伝子導入プロトコルが必要です。

概要

ヒト胎盤機能障害は、子癇前症や子宮内発育制限1のようないくつかの妊娠関連疾患の発症に関連しています。胎盤の重要な細胞成分は栄養膜であり、これは絨毛外または絨毛性細胞栄養芽細胞のいずれかに分類できます。融合すると、絨毛性細胞栄養芽細胞は、胎児と母体の交換とホルモン産生に重要な役割を果たす多核細胞構造である合胞体栄養膜層にさらに分化します2。ヒトの初代絨毛性細胞栄養細胞とそれらの分化した対応物は、重要な生物学的サンプルであり、研究者が細胞融合などの多くの胎盤関連プロセスを培養で研究することを可能にします。さらに、妊娠関連疾患に特有の適切な管理と予防療法の改善を促進するマーカーを特定するための多大な努力が進行中です。研究所は、胎盤絨毛のトリプシン消化に基づく標準的な単離手順を使用して、新鮮な胎盤から初代ヒト絨毛性細胞栄養芽細胞を日常的に分離しています3。培養された細胞栄養芽細胞は、培養4で増殖能力を失い、合胞体栄養様層で急速に分化するため、非常に効率的なトランスフェクション方法と最適化された分析アプローチが必要になります。これまでの研究では、これらの初代細胞栄養細胞のトランスフェクションの最適な条件が決定されています5。ここでは、この細胞型6で以前に試験されたsiRNAトランスフェクションの異なる方法を提示する。リポフェクションベースのアプローチと比較して、このマイクロポレーション法は、特定の遺伝子のサイレンシングの程度によって評価されるように、トランスフェクションを改善します。

プロモーターと遺伝子発現の研究も、胎盤の機能についてのより良い理解を提供します。初代絨毛性細胞栄養細胞を培養できる時間枠が短いため、使用がより困難になりますが、それでも、以前に発表された7つのように、標準プロトコルを使用したプロモーター分析に対処することができます。電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)は、in vitroで一般的に使用される方法の1つであり、DNA-タンパク質相互作用の迅速かつ容易なモニタリングを可能にします。これらの初代栄養膜からの核抽出物を使用して、シンシチン-2プロモーターの領域の特定の相互作用を試験しました。その結果、結合因子は、培養の異なる時点で、特異的かつ再現性のある方法で検出できることが明らかになりました。

>jove_content<このプロトコルで提示されたデータは、私たちのトランスフェクションアプローチとEMSAプロトコルが単離された一次絨毛性細胞栄養芽細胞に使用でき、正常または病理学的条件での絨毛性細胞栄養芽細胞の多様な機能を研究するために非常に役立つことを確認しています。

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プロトコル

UQAM倫理委員会は、センターHospitalier Universitaireモントリオール（モントリオール、カナダ）のサンリュック病院の倫理委員会のガイドラインに従っているこれらのプロトコルを、承認しました。参加者は、インフォームドコンセントフォームに署名しました。

1.ミディアム調製と原発絨毛細胞栄養層の分離

  1. 25mMのHEPES、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補充することによって、ヒト初代絨毛細胞栄養芽層のための培地を調製します。 50ミリリットルのアリコートでCの冷凍庫-20℃で滅菌した0.22μmのフィルターとストアを介して調製した培地をフィルタリングします。
  2. 標準的なプロトコル3次の新鮮な胎盤からの一次絨毛細胞栄養層を分離します。
    1. ペンチを使用して、絨毛組織を除去しないように注意しながら、静かに掻きすることによって、組織から胎児膜を除去します。カットメスやハサミを使用して、約3×3センチの立方体の残りの胎盤絨毛。徹底的に母体の血液を除去するために0.9％NaClを含む水で洗います。
      1. ペンチで各キューブを持ち、慎重に残りの船やハサミを使用して線維組織からの絨毛組織を除去します。
      2. およびデオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI）（;絨毛組織の15〜30 mgのために、（最終濃度1.2 mg / mlで9.6×10 5〜1.8×10 6 U）ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を含むトリプシンで4回ダイジェスト連続的に振とうしながら水浴中で37℃で30分間の最終濃度は200μg/ mlで）。
        注：、150ミリリットルに最初の消化のための総容量を使用し、残りの2つの消化のための第二の消化と75ミリリットルのための100ミリリットル。
    2. ブレーキなしで15分間、1250×gで分散した細胞と遠心分離を含む上清を収集します。上清を除去し、含む予め加温したDMEMの1ミリリットルで再懸濁細胞1％のペニシリン/ストレプトマイシン。
    3. ブレーキなしで507×gで23分間、70％のポリビニルピロリドン被覆シリカ勾配（勾配を調製するための表1を参照）、遠心分離-不連続5％の上に分散した細胞をレイヤ。吸引により1.033から1.017の間に密度層を取り外し、新しいピペットを用いて勾配で40％と50％の間の層を収集します。 1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有する予め温めたDMEM 10mlで広範囲に細胞を洗浄します。
      注：収集画分は、栄養膜を保有1.048と1.062の間の密度に相当します。
    4. 血球計数器を用いて細胞を数えます。簡単に言えば、細胞を混合し、新しいマイクロチューブに10μlを添加します。トリパンブルーの10μlを添加して、再び穏やかに混合します。細胞懸濁液を策定し、血球計数器室を埋めます。 10Xの目的で細胞をカウントします。
    5. それぞれ、セクション1.3および2で使用するために別々のチューブに1×10 6〜4.5×10 6個の細胞を配置LY。他の実験のため4日間の最大のためにCO 2を 37℃/ウェルで添加したDMEM培地と文化の中で1.5×10 6細胞の密度で、残りの細胞をシードし、5％。
  3. 孤立した一次絨毛細胞栄養芽層の純度の評価
    1. 300×gでマイクロ遠心チューブ内の新たに単離した細胞栄養層のスピン1×10 6。上清を捨て、予め温めたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の1ミリリットルを追加します。 300×gで遠心分離細胞および吸引によってPBSを削除します。
    2. 細胞に冷メタノールの1ミリリットルを加え、20分間-20℃でインキュベートします。 5分間、300×gで遠心分離し、細胞および吸引によりメタノールを除去。
      注意：メタノールの処理中にキャニスターマスク、保護メガネ、ゴム手袋を使用してください。
    3. 、細胞を再水和するために、室温でPBSの1ミリリットルを追加300×gで遠心分離し、吸引によってPBSを削除します。
    4. FBS（1：50 [V / V]希釈）とのFcRを含むPBSで細胞をインキュベート非特異的結合を除去するために室温で45分間試薬（1:10）ブロッキング。
    5. 5分間、300×gで室温500μlのPBS、遠心細胞で二回洗浄し、吸引によってPBSを削除します。 100μlの室温PBSで細胞を再懸濁し。
    6. で室温にて45分間、0.2％BSAを含有するPBSまたは対照アイソタイプが一致した非特異的抗体：マウスモノクローナルフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を有する細胞を、抗ヒトサイトケラチン7抗体クローンLP5K（200 1）抱合インキュベート暗い。 PBSで細胞を洗浄します。
    7. フローサイトメトリー3により細胞を分析します。さらなる実験のために、フローサイトメトリーによって96％CK-7陽性細胞の最小値を実証する細胞調製物を、使用します。

ヒト原発絨毛細胞栄養芽層の2 siRNAのトランスフェクション

  1. 微小穿孔器を用いて、ヒト一次絨毛細胞栄養層のトランスフェクション
    1. 含む6ウェルプレートを準備microporated細胞のインキュベーションのために添加したDMEM培地2ml。
    2. 一次細胞栄養芽層（1.2節を参照）の単離後、懸濁液中の細胞のアリコートを取り、血球計数器を用いて細胞数を決定します。
    3. 室温で5分間、300×gで遠心分離することによってマイクロチューブ、ペレット細胞に1.5×10 6個の細胞を転送します。 1ミリリットルダルベッコPBS（DPBS）マグネシウム（Mg 2+、 の Ca 2+ -free）で細胞を洗浄し、室温で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
    4. 上清を除去し、再懸濁緩衝液100μlの細胞を穏やかに再懸濁します。
      注：細胞生存率およびトランスフェクション効率を最大にするために、室温で15〜30分間よりも長く細胞懸濁液を維持避けます。
    5. 1.5ミリリットルマイクロチューブにsyncytinの-2のsiRNA（またはコントロールスクランブルsiRNA）の300 ngのを追加し、100μlのトランスフェクションピペットを用いて細胞-siRNAの混合物を吸引します。インサート駅へのピペット（材料のリストを参照）、30ミリ秒の1300 V単一パルスに細胞を供します。
    6. すぐに細胞の損傷を避けるために37℃で予熱した添加培地を含有する（ステップ2.1.1で調製した）を6ウェルプレートに細胞を移します。
    7. 繰り返して、残りのサンプルのための2.1.5と2.1.6を繰り返します。
    8. 静かに細胞の均一な分布を確実にするために30秒間プレートを揺らし。 24〜48時間、加湿CO 2インキュベーター中、37℃でプレートをインキュベートします。培地をトランスフェクション後24時間を更新します。
    9. ウェスタンブロット分析により、トランスフェクション効率を評価する（工程を3~6参照）。
  2. ヒト初代細胞栄養芽層でのsiRNAのリポフェクション
    1. 絨毛細胞栄養芽層の分離後、培地2mlに6ウェルプレートにウェル当たり1.5×10 6細胞の密度で細胞を播種し、18時間インキュベートします。
    2. syncytinの-2特異的siRNA（またはコントロールスクランブル300ngのを希釈siRNA）と抗生物質と無血清培地10μlの総体積で別々の1.5ミリリットルチューブ内脂質ベースのトランスフェクション試薬5μlの。 5分間インキュベートします。
    3. 希釈された試薬を混合し、トランスフェクション複合体を形成するために、室温でさらに20分間インキュベートします。 100μlの最終体積にミックスに抗生物質および無血清培地90μlのを追加します。
    4. 6ウェルプレート（ステップ2.2.1）から培地を除去します。 2新鮮な培地mlの各ウェルに100μlのトランスフェクションミックスを追加します。 24〜48時間、CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。培地をトランスフェクション後24時間を更新します。
    5. ウェスタンブロット分析により、トランスフェクション効率を評価する（工程を3~6参照）。

全細胞培養からの溶解物の調製

  1. メディアを取り出して、予め温めておいたDPBSを使用して（ステップ2.1.8および2.2.4から）を各ウェルを洗浄（、Mg 2+で の Ca 2+を含みません）。 DPBSを吸引し、0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の500μlを添加します。 CO 2インキュベーター中、37℃で1~3分間インキュベートします。増殖培地を含む血清500μlのを追加することにより、トリプシン処理を停止します。
    注意：使用して、適切なメディアボリュームフラスコ/皿の種類に応じて：10 7細胞/ 100ミリメートル皿/ 150cm 2のフラスコ当たり1ミリリットル。 5×10 6細胞/ 60 mmディッシュあたり0.5ミリリットル/ 75cm 2のフラスコ。
  2. 室温で2分間、300×gで遠心分離により細胞をペレット化を1.5 mlのマイクロ遠心チューブに細胞を移します。室温で2分間300×gでの遠心分離によってDPBSマグネシウム（Mg 2+、 の Ca 2+フリー）、ペレット細胞で細胞を洗浄。
  3. ペレットを乱さないように注意して上清を除去します。チューブを氷上に置きます。たての追加を含む（緩衝液の組成については表2を参照）50-200μlの氷冷ラジオ免疫沈降アッセイ（RIPA）緩衝液中にペレットを再懸濁1×最終濃度で、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を編。簡単に言えば、チューブをボルテックスし、30分間氷上で残します。
  4. 4℃で20分間、16,000×gでスピン。慎重にチューブを氷上に置きます。ピペットを用いて、氷上に維持し、新鮮な予備冷却マイクロ遠心チューブに上清を移します。ペレットを捨てます。

培養細胞からの核抽出物の4準備

  1. 各ウェル（ステップ1.2.5）の場合は、予め温めておいたDPBSマグネシウム（Mg 2+、 の Ca 2+を含まない）の1ミリリットルで二回培養細胞栄養を洗います。吸引しDPBS 0.25％トリプシン/ EDTAの500μlのを追加します。 CO 2インキュベーター中、37℃で1-3分間インキュベートし、血清を含有する増殖培地を500μlを添加することにより、トリプシン処理を停止します。
  2. 室温で2分間、300×gで遠心分離により細胞をペレット化を1.5 mlのマイクロ遠心チューブに細胞を移します。遠心分離によってDPBSマグネシウム（Mg 2+、 の Ca 2+フリー）、ペレット細胞と細胞を洗浄室温で2分間、300×gで。慎重にペレットを中断することなく、すべての上清を除去し、チューブを氷上に置きます。
  3. 製造元の指示に従って核タンパク質を抽出します。タンパク質定量アッセイ（ブラッドフォードまたはビシンコニン酸アッセイ（BCA））を用いて、各サンプルのタンパク質濃度を決定します。

5.サンプル調製と電気泳動

  1. タンパク質定量アッセイ使用して、各細胞抽出物のためのタンパク質濃度を決定（例えば、ブラッドフォード8またはBCA 9）。
  2. （抗体を還元および変性条件下で使用することができる場合）、製造業者の説明書に従って、全タンパク質の20〜30μgのに2倍のLaemmliサンプル緩衝液（ 表2）の等量を加えます。
  3. 5分間、100℃で細胞溶解物を沸騰。繰り返し凍結/融解サイクルを回避し、将来の使用のために-20℃で、残りの管を格納するための溶解物のアリコートを50〜100μlの。
  4. 試料を加熱している間に、バッファ（ 表2）を実行して1倍の1 Lを用意。
  5. 数秒間16,000×gでサンプルをスピンし、氷の上に置きます。
  6. 分子量マーカーと一緒に、12％SDS-PAGEゲル（ゲル状組成物については表2を参照）の各ウェルに等量のタンパク質をロードします。 100 Vで1〜2時間、ゲルを実行します。

6.ゲルから膜へのタンパク質の転送

  1. ポリフッ化ビニリデン（PVDF）1分間のメタノールを有する膜を活性化し、1×転写緩衝液/ 10％メタノール溶液ですすいでください。製造業者の指示に従って、タンパク質の大きさに応じて1時間に30分間移します。
    注：転写効率がブロッキング工程の前にポンソーレッド染色を用いて評価することができます。

7.抗体染色

  1. 室温で1時間または4℃で一晩5％のブロッキング溶液を使用するための膜をブロックします。
  2. 6または抗グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH; 0.4 / mlの、1：500）で5％のブロッキング溶液中で一晩;抗syncytinの-2抗体（5,000 1を4μg/ ml）で膜をインキュベート4°C（抗syncytinの-2）または室温で45分間。トリス緩衝食塩水Tween中で膜を3回洗浄（TBST;緩衝液の組成は表2を参照） を 5分間。
  3. 適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で膜をインキュベート共役抗ウサギまたは抗マウス抗体（1：10,000）5％1時間室温でTBSTでブロッキング緩衝液です。 5分間、膜をTBSTで3回洗浄した後、TBSですすいでください。化学発光ベースブロッティング基板を用いて信号を検出します。

一本鎖オリゴヌクレオチドの8放射性標識

  1. リン酸化反応
    1. マイクロチューブでは、1×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液と一緒に1 Uの前方オリゴヌクレオチド50ngのを追加します。T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび20μCiの（γ-32 P）ATPおよびヌクレアーゼフリー水で20μlのに反応容量を構成しています。
    2. 37℃で30分間インキュベートします。 0.5 M EDTAの5μLを加えて反応を停止します。ヌクレアーゼフリー水で50μlにボリュームを構成します。
  2. オリゴヌクレオチドから取り込まれていないヌクレオチドの除去
    1. 製造者の指示に従って、TE緩衝液（ 表2）で平衡化したG-25カラムを準備します。新鮮なDNアーゼフリー1.5ミリリットルのマイクロチューブ内の列を配置します。
    2. ゆっくりと樹脂床を乱さないように注意しながら、樹脂上で（ステップ8.1.2から）プローブの50μlを添加します。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中の精製サンプルを収集するために、350×gで2分間スピン。ヌクレアーゼフリー水36μlのG-25カラムを洗浄し、マイクロチューブにそれを収集するために、350×gで2分間スピン。
  3. 相補鎖オールとのハイブリダイゼーションigonucleotide
    1. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに放射性標識したプローブ（86μl）を転送し、アニーリング緩衝液（ 表2）の逆オリゴヌクレオチドおよび1倍の200 ngのを追加します。熱95℃で5分とは、冷却のために、室温で一晩おきます。
    2. 前方の未標識の50 ngのを追加することにより、非放射性の二本鎖オリゴヌクレオチドを​​調製し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにオリゴヌクレオチドおよびアニーリング緩衝液の1倍を逆転。ヌクレアーゼフリー水で100μlにボリュームを構成します。熱とステップ8.3.1で説明したように、室温で保管してください。

EMSAのための非変性ポリアクリルアミドゲルの9準備

  1. 1.5ミリメートルのスペースコーム（ゲル組成物については表2を参照）で4％ネイティブゲル（10×12センチ）を準備します。蒸留水を使用して、すべてのガラスプレートを清掃してください。
    注：プレートは、SDSのように、イオン性界面活性剤を全く含まないことが重要です。
  2. 直後のpプレート間における当社のアクリルアミド溶液は、重合が（約30分）を進行させます。
  3. 電気泳動装置を組み立て、0.5×TBEでタンクを埋めます。サンプルローディング前に150 Vで1時間に30分間ゲルを事前に実行します。

10. DNA結合反応

  1. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブでは、1×ゲルシフト結合緩衝液（ 表2）核抽出物（ステップ4.3）の10μgのを追加し、ヌクレアーゼフリー水で10μLへの最終的なボリュームを構成します。対照として、無核抽出物でチューブを準備します。競合反応のために、冷たい非特異的または特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド（ステップ8.3.2）の1μlを添加します。
  2. ステップ8.3.1から各反応物に放射性プローブ​​の1μLを加えます。 20分間室温で反応をインキュベートします。反応あたり10倍ゲルローディング緩衝液1μLを加え、セクション9で調製したゲル上の各サンプルをロードしてください。
  3. 15で2時間に1 1/2用ゲルを実行します。移行後0 V、蛍光体スクリーン下の露光カセット中のラップと位置でゲルとガラスを包みます。 24時間4℃でカセットを残します。
  4. 露光カセットから画面を削除し、スキャン用の蛍光撮像装置に挿入します。

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結果

満期妊娠からの新鮮な胎盤は、プロトコルのセクションで説明した実験のセットを行うために、ヒト初代絨毛細胞栄養層を分離するために使用されました。それらの単離に続いて、我々は最初のサイトケラチン7マーカー（ 図1）の使用を介して細胞栄養層の純度を分析しました。細胞調製物は、このように、モノクローナル抗サイトケラチン7抗体を用いて染色した。 図1は、標準的なフローサイトメトリーによって分析し、一次絨毛細胞栄養芽層の精製以下の典型的な実験の結果を表します。密度勾配のステップに続いて、（この場合、99％）> 97％の細胞が陽性にそれによって、この細胞型の浄化効率の非常に高い程度を示す、標準的な実験においてサイトケラチン7について染色されます。

それらの単離後、ヒト初代細胞栄養芽層を直接TRAのために使用することができますnsfection。二つの異なるプロトコルは、 すなわち、

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ディスカッション

ヒト胎盤機能と開発に関する研究が大幅に様々な胎盤細胞集団の分離を最適化することを目的としたプロトコルによって改善されました。最もよく研​​究さ胎盤細胞集団の一つは研究が大幅に効率的で信頼性の高い分離を可能にする最適化されたプロトコルから恩恵を受けている、絨毛細胞栄養芽層のまま。これはさらに、そのようなトランスフェクションおよびプロモーターの研究などの実験の数を可能にしました。前述のプロトコル3を使用して、一次絨毛細胞栄養芽層の純粋な集団を得ることができます。 CK-7細胞栄養層で発現される中間フィラメントタンパク質です。このタンパク質に対するモノクローナル抗体は、胎盤10からのそれらの単離後に、この栄養膜集団の純度を決定するために使用されます。調製物は、細胞の96％は、CK-7陽性である場合、純粋であると定義されます。細胞は、その後、トランスフェクションのために直接使用することができます。トランスフェクションプロトコル関与する脂質ベースのアプローチは広く初代細胞11,12に核酸を転送するために使用されます。しかし、いくつかの細胞内脂質製剤の毒性は不利となります。微小穿孔は...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、カナダの国立科学と工学研究評議会（NSERC）（＃298527）（BB）からの助成金によってサポートされていました。 CTは、制度FAREの奨学金によってサポートされていました。 AVはNSERC・グラハム・ベル博士によってサポートされていました奨学金。 BBは、ヒトRetrovirology（ティア2）にカナダの研究の椅子を開催しました。テキストの改訂で助けをベアトリクスBeisnerに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HBSSなし Ca2+、Mg2+ Sigma#H2387
HBSS (10x)Sigma#14060-057
DMEM High Glucose withoutHepes Gibco#12100-061
Hepes (1 M)Gibco#15630-080
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x)Gibco#15640-055
Amphotericin B シグマ#A2411
CaCl<サブ>2シグマ#C4901
MgSO<サブ>4.7H<サブ>2O Sigma#M
ウシ胎児血清Gibco#16170-078 
パーコール Sigma#P-1644密度勾配
Syncytin-2 siRNAAmbion Life テクノロジー#AM16708
スクランブル siRNAQiagen# SI03650318
DNase ISigma-Aldrich#D5025
トリプシン、タイプ I Sigma#T8003
DharmaFECT Lipotransfection  試薬 GEhealthcare# T-2001-01
Trypsin/EDTALife technologies#25300-062
Protease Inhibitor CocktailRoche Diagnostic#11873580001
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific#23225
BSASigma#A7906
TWEEN 20Sigma#P9416 
抗ウサギIgG、HRP結合抗体 Cell Signaling#7074
BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD)Roche Diagnostic#11500708001
DPBS Life technologies#14287-080
T4ポリヌクレオチドキナーゼNEB#M0201S
ATP, [γ-32P]Perkin Elmer#BLU002A100UC
AcrylmideSigma 
TEMEDLife technologies#17919
過硫酸アンモニウムΣ 
抗ヒトサイトケラチン-7抗体クローンLP5K、FITC標識ミリポアCBL194F希釈1:200
FcRブロッキング試薬 Miltenyi Biotec130- 059-901希釈 1:10
フローサイトメーター BD アキュリシステムベクトン・ディキンソン
マイクロポレーター MP-100 装置 デジタルバイオ
再懸濁バッファーR (ネオントランスフェクションシステム100 &マイクロ;l キット)MPK10096ライフテクノロジー
 ミリポアIPVH00010 メタノールによる活性化
抗ヒトGAPDH抗体Santa Cruz Biotechnologysc-1371791:500
Horseradi Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibodyCell Signalling#70741:10,000
Horseradish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibodyCell Signalling#7076 1:10,000
NE-PER 核・細胞質抽出試薬Thermo Scientific#78833
G-25 カラム GE Healthcare#27-5325-01
化学発光および蛍光イメージングデバイスMontréal BiotechFusion FX5
4% ネイティブ ゲル自家製
PBS自家製1x
パーソナル分子イメージャー (PMI) システムBioRad
#A9099#A3678PVDF膜

参考文献

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