このプロトコルは、効率的に新たに単離されたヒト絨毛細胞栄養芽層でのsiRNAのトランスフェクションマイクロポを使用して、これらの細胞におけるDNA-タンパク質複合体を同定するための方法が記載されています。トランスフェクトされた細胞は、ウェスタンブロットによりモニターすることができ、EMSAは、4日間の培養期間中に分析します。
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この記事について
サマリー
要約
ヒトの一次絨毛細胞栄養芽細胞は、胎盤の機能や調節メカニズムを研究し、妊娠に関連する疾患を理解するための非常に有用な初代細胞の供給源です。このプロトコルでは、標準的なDNase/トリプシンプロトコルを通じて胎盤から新たに単離されたヒト一次絨毛性細胞栄養芽細胞を、低分子干渉RNA(siRNA)でマイクロポレーションします。このアプローチにより、リポフェクションベースの方法と比較して、siRNA トランスフェクションの効率が高かった。トランスフェクションした細胞は、その後、トランスフェクション後3〜4日以内に標準的なウェスタンブロットで分析できます。さらに、培養した初代絨毛細胞栄養細胞を用いて、1日目から4日目までの抽出物に対して、Electrophoretic Mobility Shift Assay(EMSA)分析を最適化し、実施しました。これらの培養初代細胞および記載されたプロトコルの使用は、合胞体栄養細胞様細胞層への絨毛性細胞栄養膜分化の過程における特定の遺伝子および転写因子の含意の評価を可能にする。しかし、培養で許容される期間が限られているため、安定した細胞集団の生成など、より多くの時間を必要とする方法を使用することはできません。したがって、この細胞集団の試験には、高度に最適化された遺伝子導入プロトコルが必要です。
概要
ヒト胎盤機能障害は、子癇前症や子宮内発育制限1のようないくつかの妊娠関連疾患の発症に関連しています。胎盤の重要な細胞成分は栄養膜であり、これは絨毛外または絨毛性細胞栄養芽細胞のいずれかに分類できます。融合すると、絨毛性細胞栄養芽細胞は、胎児と母体の交換とホルモン産生に重要な役割を果たす多核細胞構造である合胞体栄養膜層にさらに分化します2。ヒトの初代絨毛性細胞栄養細胞とそれらの分化した対応物は、重要な生物学的サンプルであり、研究者が細胞融合などの多くの胎盤関連プロセスを培養で研究することを可能にします。さらに、妊娠関連疾患に特有の適切な管理と予防療法の改善を促進するマーカーを特定するための多大な努力が進行中です。研究所は、胎盤絨毛のトリプシン消化に基づく標準的な単離手順を使用して、新鮮な胎盤から初代ヒト絨毛性細胞栄養芽細胞を日常的に分離しています3。培養された細胞栄養芽細胞は、培養4で増殖能力を失い、合胞体栄養様層で急速に分化するため、非常に効率的なトランスフェクション方法と最適化された分析アプローチが必要になります。これまでの研究では、これらの初代細胞栄養細胞のトランスフェクションの最適な条件が決定されています5。ここでは、この細胞型6で以前に試験されたsiRNAトランスフェクションの異なる方法を提示する。リポフェクションベースのアプローチと比較して、このマイクロポレーション法は、特定の遺伝子のサイレ....
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プロトコル
UQAM倫理委員会は、センターHospitalier Universitaireモントリオール（モントリオール、カナダ）のサンリュック病院の倫理委員会のガイドラインに従っているこれらのプロトコルを、承認しました。参加者は、インフォームドコンセントフォームに署名しました。
1.ミディアム調製と原発絨毛細胞栄養層の分離
- 25mMのHEPES、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補充することによって、ヒト初代絨毛細胞栄養芽層のための培地を調製します。 50ミリリットルのアリコートでCの冷凍庫-20℃で滅菌した0.22μmのフィルターとストアを介して調製した培地をフィルタリングします。
- 標準的なプロトコル3次の新鮮な胎盤からの一次絨毛細胞栄養層を分離します。
- ペンチを使用して、絨毛組織を除去しないように注意しながら、静かに掻きすることによって、組織から胎児膜を除去します。カットメスやハサミを使用して、約3×3センチの立方体の残りの胎盤絨毛。徹底的に母体の血液を除去するために0.9％NaClを含む水で洗います。
- ペンチで各キューブを持ち、慎重に残りの船やハサミを使用して線維組織からの絨毛組織を除去します。
- およびデオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI）（;絨毛組織の15〜30 mgのために、（最終濃度1.2 mg / ml....
- ペンチを使用して、絨毛組織を除去しないように注意しながら、静かに掻きすることによって、組織から胎児膜を除去します。カットメスやハサミを使用して、約3×3センチの立方体の残りの胎盤絨毛。徹底的に母体の血液を除去するために0.9％NaClを含む水で洗います。
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結果
満期妊娠からの新鮮な胎盤は、プロトコルのセクションで説明した実験のセットを行うために、ヒト初代絨毛細胞栄養層を分離するために使用されました。それらの単離に続いて、我々は最初のサイトケラチン7マーカー（ 図1）の使用を介して細胞栄養層の純度を分析しました。細胞調製物は、このように、モノクローナル抗サイトケラチン7抗体を用いて染色した。 図1は、標準的なフローサイトメトリーによって分析し、一次絨毛細胞栄養芽層の精製以下の典型的な実験の結果を表します。密度勾配のステップに続いて、（この場合、99％）> 97％の細胞が陽性にそれによって、この細胞型の浄化効率の非常に高い程度を示す、標準的な実験においてサイトケラチン7について染色されます。
それらの単離後、ヒト初代細胞栄養芽層を直接TRAのために使用することができますnsfection。二つの異なるプロトコルは、 すなわち、
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ディスカッション
ヒト胎盤機能と開発に関する研究が大幅に様々な胎盤細胞集団の分離を最適化することを目的としたプロトコルによって改善されました。最もよく研究さ胎盤細胞集団の一つは研究が大幅に効率的で信頼性の高い分離を可能にする最適化されたプロトコルから恩恵を受けている、絨毛細胞栄養芽層のまま。これはさらに、そのようなトランスフェクションおよびプロモーターの研究などの実験の数を可能にしました。前述のプロトコル3を使用して、一次絨毛細胞栄養芽層の純粋な集団を得ることができます。 CK-7細胞栄養層で発現される中間フィラメントタンパク質です。このタンパク質に対するモノクローナル抗体は、胎盤10からのそれらの単離後に、この栄養膜集団の純度を決定するために使用されます。調製物は、細胞の96％は、CK-7陽性である場合、純粋であると定義されます。細胞は、その後、トランスフェクションのために直接使用することができます。トランスフェクションプロトコル関与する脂質ベースのアプローチは広く初代細胞11,12に核酸を転送するために使用されます。しかし、いくつかの細胞内脂質製剤の毒性は不利となります。微小穿孔は.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品は、カナダの国立科学と工学研究評議会（NSERC）（＃298527）（BB）からの助成金によってサポートされていました。 CTは、制度FAREの奨学金によってサポートされていました。 AVはNSERC・グラハム・ベル博士によってサポートされていました奨学金。 BBは、ヒトRetrovirology（ティア2）にカナダの研究の椅子を開催しました。テキストの改訂で助けをベアトリクスBeisnerに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| HBSSなし Ca2+、Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without | Hepes Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | シグマ | #A2411 | |
| CaCl<サブ>2 | シグマ | #C4901 | |
| MgSO<サブ>4.7H<サブ>2O | Sigma | #M | |
| ウシ胎児血清 | Gibco | #16170-078 | |
| パーコール | Sigma | #P-1644 | 密度勾配 |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life テクノロジー | #AM16708 | |
| スクランブル siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| トリプシン、タイプ I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection 試薬 | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| 抗ウサギIgG、HRP結合抗体 | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4ポリヌクレオチドキナーゼ | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | ||
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| 過硫酸アンモニウム | Σ | ||
| 抗ヒトサイトケラチン-7抗体クローンLP5K、FITC標識 | ミリポア | CBL194F | 希釈1:200 |
| FcRブロッキング試薬 | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | 希釈 1:10 |
| フローサイトメーター BD アキュリシステム | ベクトン・ディキンソン | ||
| マイクロポレーター MP-100 装置 | デジタルバイオ | ||
| 再懸濁バッファーR (ネオントランスフェクションシステム100 &マイクロ;l キット) | MPK10096 | ライフテクノロジー | |
| ミリポア | IPVH00010 | メタノールによる活性化 | |
| 抗ヒトGAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| Horseradi Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| Horseradish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER 核・細胞質抽出試薬 | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 カラム | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| 化学発光および蛍光イメージングデバイス | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% ネイティブ ゲル | 自家製 | ||
| PBS | 自家製 | 1x | |
| パーソナル分子イメージャー (PMI) システム | BioRad |
参考文献
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta....
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再版と許可
