細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

Summary

ここに示されているのは、脱細胞化した心臓組織の細胞外マトリックスの超微細構造を視覚化する方法です。

Abstract

線維症は、病因に関係なく、あらゆる形態の心臓病の構成要素であり、心臓マトリックス生物学の分野では多くの進歩が見られましたが、マトリックスがどのように形成されるか、生理学的および病理学的リモデリングがどのように異なるか、そして最も重要なこととして、マトリックスダイナミクスがどのように治癒を促進し、線維症を阻害するかについては、まだ大きなギャップがあります。現在、心線維症を制御、予防、または逆転させるための治療選択肢はありません。その理由の一部は、心筋梗塞後に起こるような、死んだ心筋細胞や死にかけている心筋細胞にすぐに取って代わる心臓瘢痕形成の複雑さにあると思われます。細胞外マトリックス自体は、常在細胞を活性化し、浸潤した細胞を機能不全の病変に導くのを助けることにより、リモデリングに関与します。このマトリックスは、正常なマトリックスの代謝回転や線維性シグナル伝達に重要な母系細胞タンパク質の保管ロッカーのようなものでもあります。さらに、このマトリックスは、心臓組織において電気機械的な役割を果たすことが実証されています。線維症を評価するためのほとんどの手法は、本質的に定性的ではなく、2つのグループを比較するのに役立つ定量的な結果を提供しますが、基礎となるマトリックス構造に関連する情報は提供しません。ここで強調されているのは、心臓マトリックスの超微細構造を視覚化する手法です。脱細胞化した心臓組織の走査型電子顕微鏡法は、従来の定量的研究方法では見落とされがちな構造の顕著な違いを明らかにします。

Introduction

線維症は正常な心筋コラーゲンネットワークを破壊し、これは心筋細胞^1,2の正常な機構機能だけでなく、細胞間コミュニケーション、細胞内シグナル伝達、および細胞生存3にとって^{重要です。}線維症の発症は心機能の主要な決定要因であり、さまざまな病因から生じる心臓間質の線維化リモデリングは、左心室硬化の増加と拡張期機能障害につながります⁴。心筋線維症も不整脈を引き起こす可能性があり、線維性リモデリングの進行が一般的な現象であるか局所的な現象であるかにかかわらず、虚血性および非虚血性心筋症の患者の予後不良と非常に関連しています⁵。同様に、心筋線維症の欠如は、心室機能の回復と長期生存の強力な予測因子です⁶。

線維症の特徴は、過剰なコラーゲンの沈着であり、これは鋼鉄⁷の引張強度を持ち、複数のレベルで心筋細胞の機能に悪影響を与える可能性があります。過度にコラーゲン性マトリックスに起因する機械的な力は、心筋細胞の萎縮^8,9、受動的な組織こわばり¹⁰、強直性収縮誘発性心筋こわばり^11-13、および心筋細胞の残りの集団への酸素供給の減少につながる可能性があります。心筋細胞とmyoFbsのギャップ結合結合も心臓の電気的特性を損なう可能性があり、不整脈の発症リスクが高くなります^14-16。血管周囲線維症は、壁内冠状動脈および細動脈の血管運動反応性を変化させ¹⁷、酸素の供給を減少させる管腔狭窄に寄与し、したがって心筋細胞^17-22の生存を減少させる。虚血性損傷またはエネルギーの不均衡の最初の部位から発せられる病原性線維性および電気的リモデリングは、必然的に心不全に進行します。

心筋細胞の壊死は線維性反応を開始し、その後の有害な線維性リモデリングは病因に関係なく発生する可能性があります。心筋線維症を制御する方法を見つけることは、虚血性および特発性心筋症、高血圧性心疾患、肥大型心筋症、弁膜性心疾患、およびジストロフィノパチーの治療に臨床的に有益です^23-42。線維性疾患のプロセスがどのように始まるかにかかわらず、可溶性の線維化促進因子が間質性空間を横切り、最初の線維性瘢痕から離れた部位で間質性および外形性線維芽細胞の活性化を引き起こし、最終的に心不全につながるカスケード効果を生み出す可能性があります。最適なシナリオは、収縮期ポンプ不全、拡張期心不全、またはその他の末期の結果に進行する前に、心筋症の代償性肥大型段階で適用できる標的治療薬を使用して、線維原性プロセスを利用することです。最終的な目標は、線維化を逆転させ、死んだ心筋細胞を置き換え、心機能を完全に回復させることです。

マトリックスの重要性は広く理解されていますが、マトリックスを研究する方法は主に主要な構造成分、特にコラーゲンの定量的測定、および異なるマトリックスおよび母細胞タンパク質の相対的なレベルに限られています。このプロトコルは、心臓マトリックスの質的な違いを評価するのに役立つ、めったに使用されない手法を強調しています。この技術は最近、心臓病のさまざまな病因(ヒト外植片)からの心臓マトリックスの基本的な違いを比較対照するために使用され、ニューレグリン-1βのグリア成長因子(GGF)アイソフォームで治療された梗塞後ブタの心臓を未^{治療の動物}と比較して調べ、mdxからの心臓組織のマトリックスの違いを調査するために使用されていますマウス(デュシェンヌ型筋ジストロフィーの一般的に使用される動物モデル)をさまざまな年齢で、野生型の対照と比較しました。この^技術は、1979年にコールフィールド博士とボルグ博士によって初めて導入されましたが、それ以来、この強力な技術を採用した研究はほとんどありません^45-47、ここでわずかな変更を加えて再導入しました。この方法論は、単にマトリックス成分含有量や線維症のレベルを測定するだけでは見落とされがちな細胞外マトリックスの超微細構造に関する定性的な情報を提供するため、貴重な研究ツールです。

Protocol

倫理文：動物取扱プロトコルはヴァンダービルト施設内動物管理使用委員会（IACUCによって承認されたが数M / 117分の10（豚）とM / 219分の10（マウス）プロトコルとAAALACインターナショナルの基準に従って行いました。バンクヒト心筋組織の使用法は、ヴァンダービルト大学医療センターIRB（プロトコル番号100887）によって承認されました。

1.サンプルの収集と保管

1. 0.1Mリン酸緩衝液（PB）溶液中の新鮮な4％グルタルアルデヒドを行います。
   注意：グルタルアルデヒドは毒性があり、ヒュームフード内で手袋や作業を着用してください。
   1. 千ミリリットルのdH ₂ Oに21.8グラム_の Na ₂ HPO ₄および6.4グラムののNaH ₂ PO _4。 量子サティス （適量）を使用して、PB、pH7.4の0.2Mの原液を作ります
   2. PBストック溶液の2.5ミリリットルと2.1ミリリットルのdH ₂ Oに50％グルタルアルデヒドの400μLを追加
2. 2 cより（も大きくチャンクを浸していません4％グルタルアルデヒド溶液中に組織のM ^2）。注：より小さな断片も使用することができるが、簡単にプロトコルの後工程を容易にするために、眼によって視覚化されるのに十分なサイズ（無5mm未満^2）であるべきです。
3. 4℃で無期限に保存した後、1時間室温でインキュベートします。

心臓組織の脱細胞化2。

1. 10gのNaOHペレット/ 100mlでのdH ₂ Oを用いて新鮮な10％NaOH水溶液を加えます
   注意：NaOHのソリューションは、腐食性であり、アルカリ火傷を引き起こす可能性があり、手袋を着用してください。
2. dH ₂ Oに組織をすすぎます
3. （オフホワイトや白に赤茶色から組織変化まで）10日 - 6のために室温で10％NaOH溶液中でインキュベートします。
4. 組織が ​​透明になるまで_の dH ₂ Oですすいでください。
5. 室温で4時間、1％タンニン酸で組織を浸し。 4ミリリットルのdH ₂ Oあたり1ミリリットル5％原液を使用して
   注意：タンニン酸強い刺激で、手袋を着用してください。
6. 一晩のdH ₂ Oですすいでください。

3.オスミウム酸染色法と（安全のためのドラフトチャンバー内）心臓組織の脱水

1. 21.4グラムのカコジル酸ナトリウム、10.0グラムの塩化カルシウムと450ミリリットルのdH ₂ Oを使用してカコジル酸ナトリウム緩衝液の0.2Mの原液を作りますpHを7.4に調整するために必要な混合物は、その後、塩酸を加える。Qsを500 mlまでのdH ₂ Oで
   注意：ナトリウムカコジル酸および塩酸がヒュームフードに手袋や作業を着用し、有毒です。
2. 50ミリリットルのdH ₂ O中に1グラム四酸化オスミウム結晶を溶解することにより、安全性のためのヒュームフード内で四酸化オスミウムの2％水性原液を作ります
   注意：四酸化オスミウムが厳しい吸入の危険性です。粘膜や眼球の蒸気固定が可能であり、それゆえにのみ手袋とドラフト内で取り扱います。スプラッシュガードをお勧めします。
3. dHで1：（原液1を混ぜ、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で組織をすすぎます 2 O））。
4. 3バッファリンス、合計二回前の手順を繰り返します。
5. 回転子に1時間：（1株カコジル酸ナトリウムおよび株式四酸化オスミウム1を混ぜる）、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の1％四酸化オスミウムで組織を浸し。
6. 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で回転体上で5分間、3回組織をすすぎます。
7. ローテーター上で15分ごとに、エタノールの増加濃度（30％、50％、75％、85％、95％、および最終的に100％）を用いて組織をすすぎます。

SEM 4.断面表面の準備

1. また、100％のエタノールを含む浅いペトリ皿に100％エタノール中に組織を移します。
2. 両側の平坦部が互いに接触していると、切刃が試料上等辺三角形の二辺を形成するように交差するように2つの非常に鋭利なカミソリ刃を保持します。これを達成するために、試料の右端側つのブレードを配置するために左手を使用してカットが左方向。同時に、これまでのサンプルとスライス右方向の左側の2番目のブレードを配置するために右手を使用しています。このように、ブレードは、単一の滑らかなカットを作るために、反対方向から互いに対してスライドさせることになります。
3. 好ましくは、試料を損傷することなく、可能な限り大きな表面積を露出し、最小限の歪みや引き裂く力で試料の非常にきれいにカットを作るためにお互いに対してフラットブレード側面をスライドさせます。
4. SEMでの検査のために可能な限りクリーンな断面の表面を露出するために、各試験片について、この手順を繰り返します。

心臓組織の5臨界点乾燥（CPD）

1. 組織は常に100％エタノールに残っていることを確認して、臨界点乾燥機（CPD）のサンプルホルダーに組織を転送するためにへらやピンセットを使用してください。ホルダーをエタノールに浸漬し、転送は数秒を超えない空気に露出した組織で達成されていることをされていることを確認してください。
2. 私たち当たりのCPDを操作液体二酸化炭素とエタノールを置き換えるために3パージ・アンド・フィルサイクルを完了するために、小胞体のマニュアル。
3. サンプルの臨界点乾燥を達成し、CO ₂の制御されたガス抜きで大気圧に戻すことユーザーズマニュアル当たりのCPDを操作し_ます。

SEMのための心臓組織標本の6取付

1. アルミスタブの上面にカーボン接着剤タブを付着させることにより、各検体のためのSEMの試料スタブを準備します。
2. 実体顕微鏡の助けを借りて、慎重に関心の断面表面が（離れてタブから、目に見える）上に向けて接着剤タブに試料を付着し、サンプルのスタブ表面の平面に平行にできるだけ近いです。プローブまたは関心の表面に触れないでください。
3. ペイントアプリケーションのための理想的な、テーパー状のブラシを達成するために木製のアプリケータースティックを破ります。スタブへの密着性を向上させるために、ベースと試料の側面に銀やカーボン塗料を適用します。
4. 地面に目的物の表面からの電荷の経路を提供するために、関心の表面の端部に銀やカーボンペイントまでの非常に細い線を拡張します。
5. 地面にこのように金属スタブの炭素タブ表面から導電性経路を提供するために、炭素タブの周囲に銀やカーボン塗料の2または3小さな描点を適用し、。
6. 導電性塗料は2時間乾燥することができます。
7. 金 - パラジウム合金または金の - 比較的重いコーティング（40〜30nm程度の目標範囲）を適用するユーザのマニュアルあたりのスパッタコーターを操作します。約0.1ミリバールに試料室ポンプ。 40秒にタイマーを設定します。 8時位置（中程度のアルゴンガス流量）にオープンセットバルブ。 Startを押し30mAでスパッタコーティングを開始します。パープルグロー放電は、試料室に表示されるはずです。

ハートの組織標本の7 SEM検査

1. イメージングpを最小にするために比較的低加速電圧での走査型電子顕微鏡を行いますサンプル（充電）に乏しい電荷散逸に関連したroblems。推奨初期撮像条件である：加速電圧が5kV、10ミリメートル作動距離。
2. 経験豊富なオペレータの支援を受けて、採用は、z次元でかなりの長さのために延びた複数の焦点面における繊維、または繊維のフォーカスを必要とする撮影条件で被写界深度を拡張するために作動距離の増加しました。
   1. ここで使用される顕微鏡のためのユーザインタフェースへのアクセスで、右上の[ナビゲーション]タブを（ 材料の表を参照してください）。
   2. ステージ]メニューから[座標]タブにアクセスします。 、作動距離を増加させるZ座標のためのミリメートルで、より大きな値を入力するには、次に入力された作動距離に試料ステージを移動するタブに移動をクリックします。
3. 経験豊富なオペレータの支援を受けて、電子ビームに関心直交の表面を配置するために、試料の傾きや回転を採用しています。 10〜30 DEGRの追加の傾きEESこの位置からマトリクス構造の観察やドキュメントを改善することができます。
   1. フォーカスされた作動距離に注意して、ここで使用される顕微鏡のために、（ 材料の表を参照）ユーザーインターフェイスで、関心の調製された表面面の外周付近の標本を集中するために、その後、左または右にスライドをクリックし、マウスの右ボタンを押したまま。
   2. 表面の反対側の端部付近に移動し、フォーカスを繰り返すマニュアルユーザーインターフェースのジョイスティックで移動します。作動距離が第一の位置にほぼ等しくない場合には、傾斜試料を（7.2を参照）、Tにおける傾き値が座標入力ステージメニューの座標タブを使用して、両方の場所に近似合意を達成します。
   3. 試料を90度回転（フィールド座標Rに値を入力します）と、すべての位置はほぼ同じ作動距離に集束されるまで、プロセスを繰り返します。
      注：可変圧力SEMは、電荷散逸を改善するために使用することができます可能な場合は。高真空走査電子顕微鏡のための標準的な動作モードです。

Results

強調表示された技術は、ブタから未使用のヒト心臓移植ドナーからの心臓組織（ 図1）は 、移植レシピエントからの外植組織を、野生型およびジストロフィーマウスの心臓（ 図3）に、および心筋梗塞後の心臓サンプルにおいて適用されました心臓傷害のモデル（ 図2）。 図1に示すように 、人間の心臓のマトリックスは、断面で見たときに、ハニカム状のパターンを表示する架橋されたタンパク質の複雑な織り方です。 図1の平面図を検討する際に各「ハニカム」構造は、通常、単一の筋細胞を回避し、約40μmの幅である。介在板で接続されたときに、いくつかの心筋細胞はメタファー「トンネル」を通って縦方向に実行されているロッドとして想定することができます三次元に拡張される。また、1ハイライト図切断工程（ 図1、...

Discussion

クロスセクションの表面調製は、プロトコル中に最も重要なステップです。臨界点乾燥工程に導入されるまで、微細構造を維持するために、脱水標本はすべての回で100％エタノールのままでなければなりません。標本は浅い皿にエタノールに浸されている間そこでEM検査のための表面を達成するための検体のスライスを行わなければなりません。露出面に触れたり、その後の取り扱い中にプローブされていないことも重要です。プロトコルのSEM部は関係なく、サンプル起源の基本的な電子顕微鏡のトラブルシューティングが必要な場合がありますが、重大な修正は、同様の行列観測のための他の組織タイプへのこの技術の適用のために予想されていません。繊維状のサンプルから収集した画像は、貧しい電荷散逸（「充電」）によって導入されたアーティファクトを起こしやすいです。充電の問題は、通常、走査速度を増加させる、加速電圧（別名滞留時間を減少させることによって最小化することができます）電子ビームのスポットサイズを小さくします。いくつかのスキャンの統合が遅くなり、より高品質な単一のスキャン画像内に存在する電荷アーティファクトなしでノイズの品質に匹敵する信号の画像を生成するチャージアーチファクトを回避するの...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
塩化カルシウム	電子顕微鏡 科学	12340	100 g
炭素接着	電子顕微鏡 科学	12664	30 g
炭素接着タブ	電子顕微鏡科学	77825	スタブに合うように注文
ダブルエッジ カミソリの刃 ステンレス鋼	テッド・ペラ社	121-6	250/pkg
エタノール	電子Microscopy Sciences	15055	450 ml
Gluteraldehyde, 50% Solution	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, distillation purified
Hydrochloric Acid	Electron Microscopy Sciences	16760 or 16770	100 ml
Monosodium Phosphate NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250 g
オスミウム四酸化電子	顕微鏡科学	19100	1 g
銀導電性接着剤	電子顕微鏡科学	12686-15	15 g
水酸化ナトリウム (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 kg
リン酸二塩基性ナトリウム (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500g
タンニン酸、5%水性	電子顕微鏡科学	21702-5	500 ml
三水和物カコジル酸ナトリウム	電子顕微鏡科学	12300	100 g
金パラジウム合金または金	精製システム株式会社		スパッタコーターのメーカーとモデルによって異なります
臨界点乾燥機	電子顕微鏡科学	850
プレーン木製アプリケーター	フィッシャーサイエンティフィック	23-400-102
クォンタ 250 環境SEM	FEI	Q250 SEM
スパッタコーター	クレッシントンサイエンティフィックインスツルメンツ株式会社	モデル108
アルミSEMのサンプルスタブ電子	顕微鏡科学	75220-12	ミスクロスコープに特有