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方法論記事

光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

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DOI:

10.3791/54010

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2016年5月5日

 ,  , 
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco

この記事について

サマリー

液滴マイクロ流体における多色蛍光検出には、通常、かさばる複雑な落射蛍光顕微鏡ベースの検出システムが含まれます。ここでは、単一の光検出器によって収集されたマルチカラーデータを時間的にエンコードするために、光ファイバーのアレイを利用するコンパクトでモジュール化されたマルチカラー検出スキームについて説明します。

要約

蛍光アッセイは、その明るいシグナルと速い時間応答のために、液滴マイクロ流体工学で使用される最も一般的な読み出しです。マルチプレックスアッセイ、酵素進化、分子生物学的強化細胞選別などのアプリケーションでは、2色以上の蛍光を検出する必要があります。自由空間レーザーを落射蛍光顕微鏡に結合する標準的なマルチカラー検出システムは、かさばり、高価で、メンテナンスが困難です。この論文では、光ファイバーに結合されたレーザーを使用してマイクロ流体チャネルの離散領域を励起することにより、マルチカラー検出を実行するスキームについて説明します。放出された光は、単一の光検出器に結合された光ファイバーによって収集されます。励起は異なる空間位置で発生するため、放出された光の同一性を時間シフトとしてエンコードでき、より複雑な光フィルタリングスキームが不要になります。このシステムは、4つのユニークな色素の組み合わせを含む液滴集団の検出や、フルオレセインのサブナノモル濃度の検出に使用されています。

概要

液滴マイクロフルイディクスは、キャリアオイル1に懸濁水性液滴の多数の実験を区画化することにより、高スループット生物学のためのプラットフォームを提供します。液滴は、単一細胞分析2、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（PCR）3のように変化させるような用途に使用され、進化4酵素されています。彼らの明るい信号と高速時間応答がキロヘルツのレートでサブナノリットルの液滴の体積を検出すると互換性があるとして蛍光アッセイは、液滴マイクロ流体の検出の標準モードです。多くのアプリケーションは同時に、少なくとも2色のための蛍光検出を必要とします。例えば、私たちの研究室では、一般的に、アッセイの結果を一つの検出チャネルを使用した実験をソートPCR活性化液滴を行い、アッセイ陰性滴可算5にするために、二次背景染料を使用しています。

液滴マイクロ流体のための典型的な検出局はBAです落射蛍光顕微鏡上のsed、およびサンプルに集中するために、顕微鏡に自由空間レーザからの励起光を導入するために、複雑な光の操作スキームを必要とします。蛍光を液滴から出射された後、各検出チャンネル一光電子増倍管（PMT）は、波長帯を中心に利用するように、放出された蛍光を光がフィルタリングされます。落射蛍光顕微鏡ベースの光検出システムは、それらの費用、複雑さに参入障壁を提供し、メンテナンスを必要としました。光ファイバは、ファイバが手でマイクロ流体デバイスに挿入することができるので、ミラーベースの光経路の必要性を除去し、簡略化された堅牢な検出スキームを構築する手段を提供し、光路は、光ファイバコネクタを使ってインターフェースされることを可能にします。

本稿では、光学ファイバのアレイを利用することにより、多色蛍光検出を実行するためのコンパクトなモジュラー方式の組み立てと検証を記述しますダ単一の光検出器6。光ファイバは、個々のレーザに結合され、規則的な空間的オフセットでL字型の流路に垂直に挿入されます。蛍光収集ファイバは、励起領域に平行に配向され、単一のPMTに接続されています。液滴が異なる時間にレーザービームを通過するため、PMTによって記録されたデータは一時的にそのユーザが液滴がそれぞれ別個のレーザ光により励起された後に放出される蛍光とを区別することを可能にするオフセットを示しています。この時間的なシフトは、ダイクロイックミラーとバンドパスフィルタのシリーズを使用して、別個のPMTへの光を分離する必要がなくなります。検出器の有効性を検証するために、我々は、異なる色や濃度の染料をカプセル化液滴集団で蛍光を定量します。システムの感度は、単一色の蛍光検出のために調査、および0.1 nMの、200倍感度インプレッションまでの濃度で液滴を検出する能力を示してい文献7に報告され、最近の光ファイバベースの手法と比較してovement。

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プロトコル

1. SU8マスター製作

  1. 設計ソフトウェアを使用して、3層の製造のためのマイクロ流体構造を設計し、10μmの分解能で回路基板フィルム上のベンダーによって印刷されたデザインを持っています。デバイス設計の詳細は、添付文献6に記載されているチャネルの形状は、 図1に示されている。層は、各製造層8の機能を連結するために役立つ位置合わせマークを含むべきです。
  2. スピンコーター上の予め清浄3インチ径のシリコンウェハを置き、チャックに固定するために真空をオンにします。 80ミクロンの層の厚さを提供し、1750 rpmで、その後30秒間、500rpmで20秒間ウェハとスピンの中心にSU8-3050の1ミリリットルを適用します。
  3. ウェハを取り外し、30分間135℃のホットプレート上で焼きます。ウエハは、次のステップに進む前に室温まで冷却します。
  4. コリメートさ190メートル下の1 番目のレイヤーマスクに塗布されたウェハを公開W、365 nmのは、3分間のLED。露光後、次のステップに進む前に、室温まで冷却、1分間135℃のホットプレート上にウエハを配置します。
  5. スピンコーターにウェハを置き、チャックに固定するために真空をオンにします。 40ミクロ​​ンの追加の厚さを提供する層で、その結果、5,000 rpmで、その後30秒間、500rpmで20秒間ウェハとスピンの中心にSU8-3050の1ミリリットルを適用します。
  6. 次のステップに移動する前に室温に冷却後、ウエハを取り出して、30分間、135℃のホットプレート上で焼きます。
  7. 1.3にパターニングジオメトリ上に2 番目のレイヤーマスクの位置を合わせ、3分間LED nmのコリメート190ミリワット、365に塗布されたウェハを公開します。露光の後、4分30秒135℃のホットプレート上の場所は、次のステップに進む前に、室温まで冷却。
  8. スピンコーターにウェハを置き、チャックに固定するために真空をオンにします。その後、500rpmで20秒間ウェハとスピンの中心に30をSU8-3050の1ミリリットルを適用します秒は1000rpmで、100μmの追加の厚さを提供する層が得られます。
  9. 次のステップに移動する前に室温に冷却後、ウエハを取り出して、30分間、135℃のホットプレート上で焼きます。
  10. 1.3にパターニングジオメトリ上に第3層マスクの位置を合わせ、3分間LED nmのコリメート190ミリワット、365に塗布されたウェハを公開します。露光の後、9分間135℃のホットプレート上の場所は、次のステップに進む前に、室温まで冷却。
  11. 30分間のプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートの撹拌浴に浸漬して、マスクを作成します。 1分間135℃のホットプレート上でイソプロパノールとベークでウエハを洗浄します。ポリジメチルシロキサン（PDMS）成形用の100ミリメートルペトリ皿に開発されたマスターを配置します。

2. PDMSデバイスの製造

  1. プラスチック製のカップに硬化剤5gでシリコーンベースの50グラムを組み合わせることにより、1 PDMS：10を準備します。攪拌棒を取り付けた回転工具で内容を混ぜます。 DEG30分間、デシケータ内部に混合物として、または全ての気泡が除去されるまで。
  2. マスターの上に3ミリメートルの厚さを与え、さらにガス抜きのために戻ってデシケーターに配置するためにPDMSを注ぎます。一旦全ての気泡が除去され、80分間80℃でデバイスを焼きます。
  3. パターン化された面を上にして清浄な表面上メスと場所を使用して、金型からデバイスをカットし、0.75ミリメートル生検パンチで流体入口と出口をパンチ。 120μmから220μmの背の高い形状は、デバイスの側からアクセス可能であるように、デバイスを切断しなければなりません。
  4. プラズマは、300 Wのプラズマクリーナーで20秒間1ミリバールのO 2プラズマで3インチのガラススライドにより予め洗浄2インチと共に、機能面を上にして、デバイスを扱います。スライドガラスのプラズマ処理面上にPDMSデバイスのパターン形成された側を配置することによってPDMSデバイスを結合。 80℃のオーブンにデバイスを配置し、40分間組み立てられた装置を焼きます。
  5. チャンネルをレンダリングフッ素化された表面処理液を用いてデバイスを洗い流すために、注射器を用いて、疎水性。 10分、溶媒を蒸発させるために直ちに80℃でデバイスを焼きます。

光学部品の調製

  1. 105μmのコア、125μmのクラッド、NA = 0.22の光ファイバの最後の5ミリメートルから絶縁体を除去することにより、レーザ励起光ファイバを準備します。
  2. 2 回目の同一の繊維3.1を繰り返すことにより、2 番目のカラーレーザー励起ファイバーを準備します。
  3. 200μmのコア、225μmのクラッド、NA = 0.39の光ファイバ用の3.1を繰り返すことにより、蛍光信号を収集するための光ファイバを準備します。
  4. 先端が平らな面で終わっていない場合は、ファイバスクライブと端を再切断する - 全ての繊維の先端を点検します。
  5. 50 mWのにレーザーファイバーカプラを接続し、405 nmのレーザー、レーザーに105ミクロンコアファイバの1を添付してください。レーザパワーのセンサーでストリッピング終了を指示メータは、レーザパワーを最大化するためにレーザカプラの微調整を使用します。
  6. 50ミリワット、473 nmのレーザーのために3.5を繰り返します。
  7. レーザー光を遮断し、放出される蛍光を送信するために、レンズチューブを使用して、PMT上446/510/581/703 nmのクワッドバンドパスフィルタをマウントします。光はPMTに到達する前にフィルタを通過するように、ファイバカプラを取り付けます。
  8. 3.3から3.7に組み立てられたユニットに光ファイバを接続します。

4.オフライン混合乳剤の生成

  1. 60ミクロン×60ミクロンのオリフィスを有するフロー焦点マイクロ流体dropmaker装置を得ます。
  2. 2％のイオン性フッ素系界面活性剤9とHFE 7500油と1ミリリットル注射器を埋めます。
  3. PBS中で1ミリリットルフルオレセインの次の組み合わせでシリンジ（FITC）およびデキストランコンジュゲートの青色色素（CB）のシリーズを埋める：1 nMのFITC / 10 nMのCB、10 nMのFITC / 10 nMのCB、1 nMのFITC / 100 nMでCB、および10nMのFITC / 100 nmのCB。
  4. 反転マイクロ​​のステージにdropmakerデバイスをマウント対処とシリンジポンプに水と油の注射器。カップルPE-2のチューブを使用して、デバイスへの注射器。
  5. 油のための500μL/ hrであり、水溶液のための250μL/時でシリンジポンプを実行して、4.3からソリューションを含む80ミクロン液滴の混合物を作成します。水性試料の種類ごとに、交差汚染を除去するために、新鮮なdropmakerデバイスを使用します。空のシリンジに各色素の組み合わせからエマルジョンの〜200μLを収集します。
  6. 4滴型は単一収集シリンジに収集された後、繰り返し注射器を回転させることによってエマルションを混合します。
  7. 繰り返し水溶液はPBS中0.1、1、10、及び100nMのFITCを含有する4.2〜4.6ステップ。

5.光ファイバの挿入

  1. <100マイクロ秒のシャッタースピードの可能なデジタルカメラと接続された倒立顕微鏡のステージ上のステップ2で作製したマイクロ流体チップを置きます。
  2. 側から慎重に作業し、inse主流路にを通して穿刺しないように注意しながら、最も遠い上流120μmのチャネルに473 nmのレーザーに結合された繊維を室温。
  3. 300ミクロンの繊維間隔を提供し、最下流120μmでハイサイドチャネルに405 nmのレーザーに結合された光ファイバを挿入します。
  4. 2レーザー励起繊維に通常の220μmの背の高いチャネルにPMT結合繊維を挿入します。

混合エマルジョンの6蛍光検出

  1. PE-2のチューブで検出装置のスペーサーオイル入口に​​2％のイオン性フッ素系界面活性剤とHFE 7500を充填した5ミリリットル注射器を取り付けてください。
  2. PE-2のチューブを使用してデバイスの液滴再注入入口に垂直に配向されたシリンジポンプやカップルでの混合FITC / CBエマルジョンを含む注射器をマウントします。廃棄物容器にデバイスの出口からPE-2チューブの長さを接続します。
  3. 総理の両方まで、千マイクロリットル/時間でポンプのそれぞれを実行して、デバイス石油や液滴は、定期的にデバイスに結合し、下流に流れるされるように見られています。
  4. スペーサーオイルが検出領域を通って移動する液滴との間に有意な間隔を提供し、6000μL/ hrで、100μlの/時の液滴で実行されるように流量を調整します。
  5. 、レーザーをオンにするデータ収集プログラムを起動し、ベースラインのノイズ・フロアを100倍以上ある信号を提供するためにPMTのゲインを調整します。二重ピークのすべてが単一の、直線的にスケーリングされたtimetraceにはっきりと見えるようにレーザーパワーを調整します。
  6. 少なくとも20kHzでPMT電圧timetraceの60秒を取得します。 MATLABなどのコンピューティングのプログラムにデータをインポートし、カスタム・コンピューティング・プログラム・スクリプトを使用して記録ダブレットのピークの高さを測定します。
    注：これは、補足情報として提供されます。
  7. 繰り返しは、405 nmレーザーをオフにし、4.7で作成されたFITC-のみの混合エマルジョンを使用して6.2から6.7を繰り返します。

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結果

光ファイバの挿入を可能にするPDMSデバイスの製造は、種々の高さ（ 図1）のチャネルを作成するために、多段階のフォトリソグラフィ手順を必要とします。まず、SU-8の80μmの背の高い層は、シリコンウェハ上にスピンコートし、流体ハンドリングジオメトリを作成するために、マスクを用いてパターニングされます。次に、SU-8の追加の40μmの層がウェハ上にスピンコートし、120μmの背の高いレーザファイバ挿入チャネルを形成する機能を作成するために第2のマスクを用いてパターニングされます。最後に、100ミクロン以上のSU-8は、ウェハ上にスピンコートし、220ミクロントール検出ファイバ挿入路を与えるようにパターニングされます。マスターが開発され、今度はスライドガラスに接着されたPDMSデバイスを成形するために使用されます。最終的な製造は、デバイスの上部にパンチ穴と120ミクロンとの側面を介してアクセスさ220μmの背の高い光ファイバ・チャネルを介してアクセス、80μmの背の高い流動形状が含まれていますデバイス。

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ディスカッション

光ファイバ検出は、流体チャネルに対する光ファイバの位置合わせを必要とします。我々のデバイスは、多層フォトリソグラフィーで作製ガイドチャネルを利用しているので、互いに対するマスクの配置が非常に重要です。ファイバガイドチャネルは、流体チャネルに近づきすぎている場合、流体の漏れの可能性があります。ガイドチャネルが離れすぎて配置又はずれている場合、検出ファイバーによって集め蛍光シグナルが著しく減少することができます。適切な位置合わせは、フォトパターニング時に同じ場所に配置されるマスクに例えば同心円として、アライメントマークを設計することによって支援することができます。さらに、デバイスへの光ファイバーの手動挿入が使用できなく、それらをレンダリング、デバイス内の繊維の先端を破壊する可能性を秘めた繊細なプロセスです。 PDMSデバイスに結合したスライドガラスに対して繊維を拘束し、顕微鏡で観察しながら、ゆっくりと繊維を挿入するSUCCするキーですessfulファイバ挿入。予め形成されたエマルジョンの最後、再注入は、取り扱いを最小限に抑えて発生する必要があります。エマルションが作られ、空のシリンジに直接堆積された後、それは液滴再注入のために使用されるまで...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、DARPAの助成金番号84389.01.44908、NSF CAREER賞(DBI-1253293)、NIHの探索的/開発的研究助成金(CA195709)、NIHニューイノベーター賞(HD080351、DP2-AR068129-01)、およびUCSFリソース割り当てプログラムからのNew Directions助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PhotomasksCadArt Servcies
3インチ シリコン ウェーハ、P タイプ、バージン テスト グレード大学ウェーハ447
SU-8 3035MicrochemY311074
SU-8 2050MicrochemY111072
Sylgard 184 シリコーン エラストマー キットKrayden4019862
1 ml シリンジBD
10 mlシリンジBD309604
27 gaugue 針BD305109
PE 2ポリエチレンチューブScientific Commodities, Inc.B31695-PE/2
Novec 7500Fisher Scientific98-0212-2928-5一般に HFE 7500
イオン性クライトックス界面活性剤ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dyeLife TechnologiesD-1976
Fluorescein sodium saltSigma28803
Quad bandpass filterSemrockFF01-446/510/581/703-25
PMTThorlabsPMM02
ファイバーポートThorlabsPAFA-X-4-A
レンズチューブThorlabsSM1L05
パッチケーブル 200 μmコア / 225 μ1つのストリップエンドと1つのFC / PCコネクタThorlabsカスタム
μMコア / 125 μm被覆加工された光ファイバ、ストリップされた端部とFC/PCコネクタ1つ付きThorlabsCustom
125 μmファイバーストリッピングツールThorlabsT08S13
225 μmファイバーストリッピングツール
レーザーファイバーアダプターOptoEngineFC / PC
レーザー50 mWOptoEngineMDL-III-405CNIレーザー用ディストリビューター
473 nm CWレーザー 50 mWオプトエンジンMLL-FN-473-50
309628として知られている パッチケーブルを備えたmクラッディング光ファイバー105ThorlabsT10S13アダプター405nmCW

参考文献

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