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方法論記事

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

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DOI:

10.3791/54016

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2016年6月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetes and Metabolism Research Institute, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

自己再生および成体マウスの膵臓から単離された前駆細胞の分化を検出するためのインビトロコロニーアッセイに考案されています。これらのアッセイでは、膵臓前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で3次元空間での細胞コロニーを生じます。単一細胞、個々のコロニーの特徴を処理するためのプロトコルが記載されています。

要約

幹細胞および成体膵臓の前駆細胞は、1型糖尿病を有する患者を治療するための治療ベータ様細胞の潜在的供給源であり得ます。幹細胞および前駆細胞は、成人の膵臓に存在するかどうかしかし、それはまだ不明です。成体マウスで系譜追跡CRE-LOXを用いた研究戦略は、サポートまたはどちらかがベータ細胞がダクト、成人の膵臓前駆細胞が存在することができると推定位置から生成することができるという考えに異議を唱えることは、結果が得られています。これらのインビボ CRE-LOXの系譜トレースの方法は、しかし、幹細胞を定義するために必要な自己再生および多系列分化-2の基準の質問に答えることはできません。この技術的なギャップに対処を開始するために、我々は、膵臓前駆細胞のための3次元コロニーアッセイを考案しました。すぐに私たちの最初の公開後、他の研究室は、独立してオルガノイドアッセイと呼ばれる類似しているが、同一ではない、方法を開発しました。オルガノイドアッセイと比較して、我々の方法が採用します低濃度で細胞外マトリックスタンパク質の包含を可能にする粘性溶液を形成メチルセルロース、。多くの成人臓器幹細胞の場合のようにメチルセルロースを含むアッセイは、容易に検出及び前駆細胞は、小さなサブ集団を構成する際に重要である、単一細胞レベルでの前駆細胞の分析を可能にします。一緒に、いくつかの研究室からの結果は、in vitro自己再生およびマウスからの膵臓前駆細胞様細胞の多系列分化に実証します。現在のプロトコルは、マウスの膵臓前駆細胞を特徴づけるために、2つのメチルセルロースベースのコロ​​ニーアッセイを説明します。 1は、マウスの細胞外マトリックスタンパク質の市販製剤およびラミニンヒドロゲルとして知られている他の人工細胞外マトリックスタンパク質が含まれています。ここに示されている技術は、sの2）単一細胞操作、CD133 +のSox9 / EGFPの膵臓およびソートの1）解離+成体マウスから乳管細胞でありますorted細胞は、3）単一コロニーを、自己再生または分化を評価するために、二次コロニーアッセイにマイクロ流体定量RT-PCRおよびホールマウント免疫染色、および単一細胞懸濁液と再メッキへの一次コロニーの4）解離を使用して分析します。

概要

膵臓は、3つの主要な細胞系統で構成されています。腺房細胞が消化酵素を分泌する、ダクトは、病原体をかわすと腸に消化酵素を輸送するためにムチン分泌、および内分泌細胞は、グルコース恒常性を維持し、インスリンおよびグルカゴンなどのホルモンを、分泌します。膵臓の胚発生時には、初期の導管細胞は、成体動物1,2の膵臓に3系統を生じることができるトライ強力な前駆細胞の源です。そのような骨髄幹細胞などの成体幹細胞および前駆細胞は、すでに正常に様々な疾患3を治療するために使用されるので、成体膵臓幹細胞および前駆細胞を見つけることに強い関心があります。成体膵臓幹細胞および前駆細胞の単離および操作が可能であった場合は、これらの細胞は、インスリン分泌細胞は自己免疫によって破壊された1型糖尿病のような疾患を治療するために使用することができます。

トライ強力な前駆細胞がまだ胚発生完了後の成人膵管内に存在するかどうかは、多額の科学界で議論されている質問です。この議論では、およびin vivoでのcre-LOX系譜追跡技術を使用して、稲田と同僚は、マーカーで標識された大人のマウス膵管細胞、炭酸脱水酵素IIは、すべての3つの膵臓系統4を生じさせることができることを示しました。しかしながら、このようなHNF1b 5とのSox9 2などの他の管のマーカーを使用して、それが管細胞は、成体マウスにおけるβ細胞の主な原因ではないと結論付けられました。

数年前、我々は、上記の議論の原因が必要な自己再生および多系列分化二つの基準に測定するために使用することができる適切な分析ツールで、フィールド6,7において、欠如に起因し得ることを提案し幹細胞を定義します。上記のin vivoでのcre-LOXの系統追跡技術上記集団レベルでの前駆-子孫関係の証拠を提供することができます。しかし、この系統のトレース技術は、単一の前駆細胞は、自己再生し、複数の系統に分化することができるかどうかを識別するために、その電力が制限されます。いくつかのモノ強力な前駆細胞、異なる系統の電位のそれぞれが、一緒に分析した場合、それらをまとめて多系列分化能力を持っているように見える可能性があるため、単一細胞分析が重要です。さらに、幹細胞は、通常、成人器官の小集団です。マイナーな細胞集団の活動は、主要な人口でマスクすることができました。したがって、集団研究からの否定的な結果は、必ずしも、幹細胞が存在しないことを示すものではありません。最後に、CRE-LOXの系譜トレースは、現在、自己再生の測定を許可していません。

膵臓前駆細胞生物学、コロニーの分野で技術的なギャップに対処を開始するには7-11またはオルガノイド12月15日 アッセイを考案しました。膵臓前駆細胞のための二つのコロニーアッセイは、我々の研究室で開発された：1は、マウスの細胞外マトリックスタンパク質（ECM）（ 方法および装置表を参照）の市販の調製物が含まれ、もう一方はラミニンヒドロゲル、定義された人工的なECMタンパク質7-11が含まれています 。前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で混合します。メチルセルロースは、木材繊維から調製し、生物学的に不活性粘性材料であり、日常的に、造血コロニーアッセイ16において使用されています。それらは再集合体をできないようにメチルセルロースを含む半固形培地は、単一の前駆細胞の移動を規制します。しかし、培地は、前駆細胞が増殖し、3次元空間における細胞のコロニーに分化させるのに十分柔らかいです。血液学者の伝統に従い、細胞のコロニーを生じさせることができた膵臓前駆細胞は、nでしたアメッド膵臓コロニー形成単位（P​​CFU）。ネズミECM-含むコロニーアッセイで増殖させた場合PCFUsは、「リング」コロニー7と命名されている嚢胞性コロニーを生じさせます。 Wntアゴニストを添加すると、R-spondin1は、マウスのECM含有培養に、いくつかのリングコロニーを「密」コロニー7に変わります。この記事では、マウスECM培養で生育したコロニーのこれらの2つのタイプをまとめて「リング/高密度」コロニーと呼ばれます。リング/高密度コロニーを単一細胞懸濁液に解離し、ラミニンヒドロゲルを含む培地に再播種するとき、「内分泌/腺房「コロニー7が形成されています。

単一のコロニーを分析使用して、9ネズミ膵臓、のいずれかから大人（2-4ヶ月齢）7,11または若い（1週齢）リング/高密度および内分泌/腺房コロニーの大部分は、3つすべてを表現することが判明しました系統マーカー。これは、発信PCFUsのほとんどがトライ強力であることを示唆しています。ネズミECM-含むコロニーアッセイでは、大人のマウスPCFUsロバスト自己複製と文化7で11週間にわたって約50万回を展開します。ラミニンヒドロゲルの存在下で、ネズミPCFUsは内分泌および腺房細胞と腺管系統7,9,11に非常に少ないに優先的に分化することが奨励されているのに対し、マウスECMは、優先的に、内分泌および腺房系統以上の管細胞の分化をサポートしています。重要なことは、インスリン+グルカゴン-モノホルモンの細胞はラミニンヒドロゲル培養物中で生成され、機能的成熟を ​​示唆し、 インビトロ 7,9 においてグルコース刺激に応答してインスリンを分泌しています。個々のPCFUsの三系列の分化ポテンシャル7,9および自己再生11は、コロニー形成のためにウェルあたり1細胞を培養すること、 すなわち 、単一細胞マイクロマニピュレーションによって確認されています。一緒に、これらの結果は、自己再生、トリpotenがあるという証拠を提供しますトン、3D培養における活性を示す生後マウスの膵臓内の前駆細胞様細胞。

この資料に記載されたマウスPCFUアッセイは、マウス胚性幹細胞（たmESC）17から分化した前駆細胞のために設計された前コロニーアッセイに由来するものです。そのプロトコルは、別のJoveの出版物18に詳細に記載されています。培養成分及び成人PCFUs用マウスECM含有コロニーアッセイを行うために必要な技術は、MESC由来前駆17,18と同じです。したがって、アッセイのこれらの側面は、ここでは繰り返さないことにします。代わりに、次の手順では、対処されることになります：1）成人の膵臓の解離および成体マウス7、2）選別された細胞の単一細胞操作、3）シングルコロニーからPCFUsを豊かCD133 +のSox9 / EGFP +管細胞を、ソーティングマイクロ流体定量RT-PCRおよびホールマウント免疫染色を用いて分析し、コロニーの4）解離単一細胞懸濁液にsおよびマウスECMまたはラミニンヒドロゲルコロニーアッセイに再メッキ。

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プロトコル

倫理的な声明：私たちは、品質と結果の整合性を確保するための研究を行う上で広く受け入れられている倫理基準に準拠しています。動物実験はホープの市で施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されます。

1.成人マウス膵臓からの単一細胞懸濁液を調製

注：前の刊行物7,11は、CD-1またはB6バックグラウンドのマウスを使用しました。両方の背景が同じような結果が得られました。 Sox9遺伝子座19,20によって駆動される強化された緑色蛍光タンパク質を有するトランスジェニックマウス系統（指定のSox9 / EGFP）は、CD-1バックグラウンドで作成されました。

  1. 1-2分間または呼吸が停止するまで、ガスのCO 2を使用して、3〜5成体マウスを安楽死させます。次に、各マウスに頸椎脱臼を行います。
  2. 膵臓を解剖し、準備します。
    注：安楽死の後、できるだけ早くマウスを解剖。これは、膵臓の自己消化を回避することが重要です死後変化に。
    1. ハサミを用いてマウスの腹壁の正中線に垂直方向の切開を行い、腹腔を開きます。脾臓を見つけ、静かにそれを持ち上げるために鉗子を使用しています。ハサミで脾臓と膵臓の脾臓葉間結合組織をカット。
      1. 膵臓の十二指腸と胃のローブのためにこの練習を繰り返します。 （; PBS / BSAと命名完全なソリューションP / S）冷ダルベッコ改変リン酸緩衝溶液（DPBS）、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する氷上のペトリ皿に膵臓組織を置きます。
    2. 先の細いピンセットを使用して、解剖顕微鏡下で膵臓から脂肪組織を削除します。
      注：これは、次の手順で解離した膵臓細胞の健康のために重要です。
      1. （オプション）を保証するために488から509 nmの励起を用いて蛍光実体顕微鏡下で緑色蛍光のために膵臓をチェックEGFP発現。
    3. 組織培養フード内で、冷PBS / BSAを10mlを含む3つの100 mmのペトリ皿中で3回順次組織をすすぎます。
  3. 組織の小片を生成します。
    1. できるだけ多くのPBS / BSAを除去するために乾燥、滅菌ペトリ皿に解剖膵臓を移し、氷上で別の乾燥ペトリ皿に移します。
    2. 1mlのPBS / BSAあたり2μlのDNアーゼIストック溶液（1万台[MU] / ml）を添加することにより、DNアーゼIを含むPBS / BSAを準備します。
      注：この溶液をPBS / BSA / DNアーゼIで1ソーティング実験をカバーれる、一度にこの溶液を〜200ミリリットルを作成し、指定されています。
    3. 2-3分間、または組織が細かくになるまで、春のはさみを使用して膵臓をみじん切りに。冷PBS / BSA / DNアーゼI 2〜3mlのそれらを停止するペトリ皿中の組織片に追加します。
    4. 10ミリリットルピペットで、氷上で50ミリリットルコニカルチューブに組織片を転送します。 PBS / BSで10mlに全量をできるだけ多くの組織を回収した後、A / DNアーゼリットル。
  4. 主に単一細胞に膵臓個を消化。
    1. 組織片に350〜450μL/ 10ミリリットルでコラゲナーゼB（100 mg / mlでストック）を追加し、すべての3-4分を旋回、8分間水浴中で37℃で組織をインキュベートします。策定し、続いて室温で50ミリリットルチューブの壁ダウン組織液を噴霧する16½G針を10ミリリットル注射器を使用してください。この7回繰り返します。
      注：細胞クラスターを破壊するが細胞を殺すことが発生する気泡を避けるために十分な力を使ってください。
    2. 37の水浴にチューブを返します すべての3-4分を旋回で8分とミックスのためのC°。前述したように、アップおよび7回上下組織を注射器、ドライペトリ皿上の組織液のサンプル（10μl）を配置します。反転し、位相コントラスト、10X対物レンズの光顕微鏡下で組織液を観察します。単一細胞およびいくつかの小型のCを期待エルクラスタは存在することが可能です。
    3. コラゲナーゼの活性を減速または停止するには、この点についての氷上で細胞を処理します。私はP1000ピペッターを用いて、冷PBS / BSAは/ DNアーゼの5ミリリットルで4℃で5分間、400×gで冷PBS / BSA / DNアーゼIを遠心分離にセルを使用して、50ミリリットルの容量、および再懸濁を調整します。
  5. 単一細胞懸濁液を得るために濾過し、洗浄。
    1. 70μmのナイロンメッシュフィルターカップを通過し、その後、40μmのナイロンメッシュフィルターカップを介して細胞をフィルタリングします。
    2. 冷PBS / BSA / DNアーゼI 5mlに細胞を再懸濁し、細胞をカウントします。
      注：2-4カ月齢のB6またはCD-1マウスの場合、各膵臓はそれぞれ、〜5または10万個の細胞をもたらすことができます。これらの数字は、異なる実験家の間で異なる場合があります。過剰な細胞破片を計数で検出された場合、4℃で5分間、400×gで50冷PBS / BSA / DNアーゼIとmlの遠心細胞にボリュームをもたらします。
    3. 2×10の濃度になるように細胞懸濁液の音量を調整冷PBS / BSA / DNアーゼIを用いて7細胞/ ml

2.膵臓コロニー形成前駆細胞を豊かにするために細胞を選別

注：B6マウスから、CD133 +ではなく、CD133 -細胞がPCFUs 7,9,11のために濃縮されています。 CD133 +細胞は、すべてのゲーティングパラメータが11を適用した後、全体の〜13％は、膵臓細胞を解離表します。 CD-1マウスから、CD133 +のSox9-EGFP +細胞は、典型的には全膵臓細胞の約4％を占め、そしてこの細胞集団はPCFUs 7について濃縮されます。 CD133 +のSox9 / EGFP +細胞の選別は、ここで説明されています。

  1. 解離膵臓細胞を染色。
    1. 氷上で5分間の10μg/ mlの最終濃度の抗マウスCD16 / 32で単一細胞懸濁液をインキュベートすることによって非特異的結合を減少させるために全体の膵臓の単一細胞懸濁液を遮断します。
    2. 1×10 6細胞のアリコートを取り外します（50＆＃181; l）は、すべての5-7分渦巻く、氷上で20分間、5μg/ mlの最終濃度でアイソタイプ対照抗体、ビオチン結合ラットIgG1で染色しました。
    3. 1×10 6個の細胞（50μlの）のアリコートを削除し、非染色対照として氷上に保ちます。
    4. すべての5-7分を旋回、氷上で20分間、5μg/ mlの最終濃度で、ビオチン結合抗マウスCD133一次抗体を用いて細胞の残りの部分を染色します。
  2. 細胞を洗浄。
    1. 4℃で5分間、400×gでPBS / BSA / DNアーゼIと1ミリリットルの容量と遠心分離をもたらすことによって、アイソタイプ対照および一次抗体染色サンプルを洗ってください。この洗浄工程を繰り返します。
    2. 最終濃度が2×10 7細胞/ mlになるように、PBS / BSA / DNアーゼIにおけるアイソタイプ対照一次抗体で染色したサンプルを再懸濁します。
  3. 2＆＃でストレプトアビジンとアイソタイプコントロールと、一次抗体染色サンプル（STV）標識アロフィコシアニン（APC）を染色181;グラム/ mlの最終濃度。すべての5-7分渦巻く、氷上で15分間インキュベートします。
  4. 細胞を4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色を洗浄します。
    1. ステップ2.2のように、PBS / BSA / DNアーゼIで二回アイソタイプコントロールと、一次抗体染色サンプルを洗ってください。 DAPIを含むPBS / BSA / DNアーゼI（0.2 / mlの最終濃度）で細胞を再懸濁します。アイソタイプコントロールサンプルの最終容量は0.5ミリリットルでなければなりません。
      注：一次抗体染色サンプルの最終密度は、使用するソータに適していることを確認してください。 5×10 6細胞/ mlの濃度を定期的に選別するために使用されます。
    2. ソート前に20μmのメッシュを介してすべてのセルを濾過し、暗所で氷上で細胞を維持するPBS / BSA / PS / DNアーゼIと0.5ミリリットルに染色されていない細胞の音量を調整します。
  5. 細胞の選別。
    1. ソートには80μm以上のノズルを使用してください。
      注：マウスの​​膵臓内分泌細胞は、物理的なストレスを受けやすいです。ホーweverは、ネズミPCFUsはソータ7を通過することによって発生する応力によって影響を受けたようには見えません。
    2. ソーター上の細胞イベントおよび分析パラメータを取得します。前方および側方散乱領域に対するゲートの細胞は、細胞の破片7を除外する。前方および側方散乱幅のためのゲートは、細胞ダブレットを除外します。 DAPI +死細胞7を除外するためのゲート。アイソタイプコントロール細胞（ 図1）からの値に基づいて、EGFPおよびCD133-APC信号のパラメータをゲーティング選択してください。
    3. 5％ウシ胎児血清（FCS）を補充したDMEM / F12培地1.5mlのを含む5 mlのポリスチレンチューブに選別された細胞を収集します。遠心分離機私は、5％FCSを添加したDMEM / F12またはPBS / BSA / DNアーゼのいずれかの少量（〜200μlの）中で5分間再懸濁し、400×gでソートされた集団が。使用するまで氷上で細胞を保管してください。
  6. ソーターから得られたCD133 +のSox9-EGFP +細胞の数をカウントします。取ります10μlの細胞サンプルは、細胞密度を決定するために、血球計で細胞を計数し、。
    注：ソーターからマシンの数は、多くの場合、信頼できないため、血球計算盤の使用が推奨されます。

3.プレートネズミECMタンパク質を含むコロニーアッセイに分類された細胞

注：別のJoveの出版18におけるマウスECM-含むコロニーアッセイへの細胞のプレーティングのための詳細なプロトコルを参照してください。

  1. 培養培地を準備します。
    1. DMEM / F12培地、1％（重量/体積）メチルセルロース、5％（v / v）のマウスECMタンパク質の50％を含む培養培地を調製（v / v）のMESC由来の膵臓様細胞からの馴化培地、5％ （v / v）のFCS、10ミリモル/ Lのニコチンアミド、10ng / mLのヒト組換えアクチビンB、0.1ナノモル/ Lエキセンジン-4、および1 ngの/ mlの血管内皮増殖因子A。馴化培地を生成するための方法は、他の場所18に詳述されています。
    2. 培地にRSPO-1の750 ngの/ mlに追加高密度コロニー形成が所望される場合。
    3. 3週間、37℃および5％CO 2でマウスECMタンパク質の培養をインキュベートします。

1セル当たりまあで4.文化選別細胞

注：以下の手順は、手や口のピペットを用いて、単一細胞を操作に適用されます。別のアプローチは、マイクロマニピュレーターを購入することです。典型的なマイクロマニピュレーターは、ジョイスティックで操作する、電動式プラットフォームと倒立顕微鏡を含んでいます。

  1. ガラスパスツールピペットを準備します。
    1. ブンゼンバーナーを使用して、細かい点（開口における〜30ミクロン）にガラスパスツールピペットの先端を引き出します。ガラスパスツールピペットは、オペレータからの空気の流れに対する障壁を作成するために、綿の栓を持っている必要があります。
    2. 殺菌のため20分間121℃で燃え上がっガラスパスツールピペットをオートクレーブ。
  2. 文化のための96ウェルプレートを準備します。
    1. コー​​ルド半固形培地の協定を準備以前に記載されたプロトコル18にる。
    2. 1ミリリットル注射器を用いて100μl/ウェルで低結合平底96ウェルプレートの内部ウェルに培地を分注します。湿度を維持するために滅菌水で外側のウェルを埋めます。
    3. 使用するまで氷上で培養皿を置きます。
  3. 選別された細胞を準備します。
    1. 〜5mLのポリスチレンチューブ中で、10％FCSおよび1％メチルセルロースを含有するDMEM / F12 / PS 2.5mlの最終容量ソーターから収集6,000の細胞を加えます。成分を混合するために激しく振ります。 5分間、または泡が管の上部に浮遊するまで待ちます。このステップは、氷上で行う必要はありません。
    2. 18半G針で1mlシリンジを用いて、1ミリリットル/皿に2つの35mm皿に細胞溶液を分配します。
    3. そっと手で皿をロッキングすることによって皿の中の細胞溶液を広げます。半固形培地をウェルキャンのマージンで単一細胞として、35mmディッシュのマージンに到達することはできません。OTは明らか倒立光学顕微鏡を用いて観察します。
  4. 顕微鏡の周囲で作業エリアを準備します。
    1. 任意の細胞を含まないDMEM / F-12培地、1％メチルセルロースを含有する溶液（「無細胞」培地）を行い、（皿毎に1ミリリットル）は、2つの35 mmのペトリ皿に（4.3.2に記載）溶液を分配。
    2. クリーンと70％アルコール溶液で倒立位相差顕微鏡の周りのワークエリアを拭いてください。
  5. マウスピースでピペットを組み立てます。
    1. ステップ4.1で調製した滅菌ガラスパスツールピペットを選択してください。ガラスパスツールピペットの上部に1ミリリットルプラスチックピペットチップの大端を取り付けます。 1薄肉ゴムチューブの端部と、チューブのもう一方の端にマウスピースに1ミリリットルプラスチックピペットチップの小端部を取り付けます。同じグループの複数のセルをピックアップするための同一のガラスピペットを使用してください。
    2. 、口の吸引によって、少量の（〜10〜50μl）を策定「無細胞」は、半固体溶液をガラスパスツールピペットを用いて、ステップ4.4.1で行われていません。
      注：ガラスパスツールピペットの狭い開口部で半固体の溶液は、流れ抵抗を作成し、採取されるべき細胞の汚染を防止するためのバリアを提供します。
  6. 1つのセルを選択してください。
    1. 顕微鏡ステージ上で選別された細胞を含む35mm皿を置き、ふたを取り外します。
    2. 10倍対物レンズを用いて細胞見つけ、ピッキングされるのに適した細胞に焦点を当てています。
    3. 見つけて、次の目的の細胞にピペットチップの開口部を配置します。口から吸引を適用します。
      注：後のプロセスの間に細胞を失う危険性がないように、細胞の動きは、非常に遅くする必要があります。ピペットの開口部に入る細胞の動きが見えるはずです。流れが速すぎて移動した場合、狭い開口部を備えたピペットに変更。
  7. 文化ウェルに単一細胞を付着させます。
    1. 細胞はピペットになると、マウスピースの開口部を遮断することにより、流れを止めるために舌を使用しています。半固形培地が流れる停止していることを確認するために、半固形培地から先端を引き出す前に、簡単に一時停止します。
    2. ステップ4.2で調製した96ウェルプレート中のウェルにピペットの先端を置きます。静かにマウスピースの中に吹き込むことにより、ゆっくりと細胞を押し出します。セルウェル後のマークをウェルに二つのセルをめっき回避するために、堆積されます。
  8. 単一細胞を培養ウェルに入れていることを確認します。
    1. ステップ4.4.1で製造した「無細胞」培地中にピペットチップを置きます。顕微鏡下で先端部の開口部を観察しながら、残りの半固溶体を押し出します。ピペットの先端を流出する一切の細胞を期待していません。
    2. ダブルチェックのために、単一の細胞を移植した培養ウェル内の場所を見つけます。
  9. アップのための培養5％で37℃での単一細胞は、CO 23週間。

5.マイクロ流体定量RT-PCR解析のための半固体培養から個々のコロニーを選択してください

注：マウスECM含有コロニーアッセイにCD133 +のSox9 / EGFP +細胞をソートめっき3週間後に、リングまたは高密度のコロニーは7（ 図2）が形成されています。リング/高密度コロニーを単一細胞懸濁液に解離し、ラミニンヒドロゲル培養に再播種するとき、内分泌/腺房コロニー後の約1週間7（ 図2）が生成されます。各コロニーの系統構成を決定するために、マイクロ流体のqRT-PCR分析は、系統マーカー7の発現を検出するために使用されます。前増幅のために、コロニーは、TaqManプローブミックス、反応緩衝液、およびSuperscript III 21を含むマスターミックス中に混合されます。 48.48アレイチップは、その後、マイクロ流体PCR反応の21のために使用されます。

  1. 前増幅PCRを準備48プローブを含む混合物。
    1. ピペット1.5 mlチューブ内の各TaqManプローブ（20×ストック）の1.5μlの。 150μlに音量を調整するためにTEバッファー78μlを添加します。
  2. メーカー21からのプロトコルに従うことによって、マスターミックスを調製します。
  3. 各0.2ミリリットルにマスターミックスの9μLを置き、PCRに適した薄壁の反応管、および最大48のチューブに対してこの手順を繰り返します。
  4. 半固体培養からの単一コロニーを選択してください。
    注：リング/高密度コロニーは〜50から400μmの9,11の範囲の直径と、内分泌/腺房コロニーよりも大きいです。したがって、単一のリング/高密度コロニーは曲面状に曲げられている10μlのピペットチップを装備P10ピペッターを使用して取得されます。小さ ​​な内分泌/腺房コロニー（ 図2）を選ぶために、手順4を参照してください。
    1. 、高倍率（ 例えば 、20X対物レンズ）の下で、目的のコロニーを探し倍率を削減し、aspiratコロニーを電子。 （オプション）コロニーの可視特性を文書化するために、この段階でコロニーの位相差画像を取ります。
    2. マスターミックスの9μLを含むPCRチューブにコロニーを移します。
    3. 次のコロニーを採取。合計で最大45個のコロニーをコントロールするための3箇所を残して、PCRランごとに分析することができます。
  5. 前増幅とRNA抽出およびcDNA合成。
    1. 熱反応を行う前に激しくサンプルをボルテックス。
    2. 製造元の指示21に従って熱サイクル反応を行います。リング/高密度コロニーは内分泌/腺房コロニーは16-20サイクルを必要とし、単一の細胞は、22サイクルを必要とし、14サイクルを必要とします。
      注：前増幅cDNAは、マイクロ流体PCR分析の前に-20℃で保存することができます。
  6. 製造元の指示21に従って、マイクロ流体チップを使用して、その後のPCR反応を実行します。
6。コロニーの全体マウント免疫染色

  1. 収穫とコロニーを修正しました。
    1. ステップ4または5.4のように、顕微鏡下でコロニーをピックアップし、4％パラホルムアルデヒド溶液に追加します。穏やかに振盪しながら4℃でO / Nインキュベートします。
    2. RTで10から30分間、二回1X PBSでコロニーを洗ってください。パラフィンで密封1.5ミリリットルチューブに4℃で固定したコロニーを保管してください。
  2. 抗体を有するコロニーを染色。
    1. ブロッキング緩衝液200μl（5％ロバおよび/またはヤギ血清、1×PBS中の0.1％トリトンX-100）を含む透明底96ウェル黒色プレートの1ウェルに転送コロニー。穏やかに振盪しながら4℃でO / Nインキュベートします。
    2. ブロッキング緩衝液を使用した：予め決め濃度（ハムスター抗ムチン1抗体のための500 例えば 、1）に一次抗体を希釈します。一次抗体の200μlでもきれいにコロニーを移し、穏やかに振とうしながら4℃でO / Nインキュベートします。 WPBSは、各洗浄のために室温で10分間、1×200μlのPBS / 0.1％Tween 20で新しいウェルにコロニーを移し、0.1％のTween 20を含有するコ​​ロニーを3回灰。
    3. ブロッキング緩衝液を使用した：予め決め濃度（ヤギ抗アルメニアハムスター抗体について2000 例えば 、1）に二次抗体を希釈します。暗闇の中で解決してください。二次抗体を200μlを含むウェルを洗浄するためにコロニーを移し、室温で2時間インキュベートします。ステップ6.2.2のようにPBS / 0.1％のTween 20でコロニーを3回洗浄。
  3. DAPIで対比染色コロニーとは、共焦点顕微鏡で可視化します。
    1. PBSは、300nMのDAPIを含有するウェルにコロニーを移し、室温で5分間インキュベートします。
    2. 可視化のための35ミリメートルのガラスボトムシャーレにDAPI染色コロニーを転送します。蒸発を防ぐために、コロニーの上にカバースリップを置きます。
    3. 画像をキャプチャするために、共焦点顕微鏡を使用してください。 DAPI staininを可視化するために、グラム、730から950ナノメートルの二光子励起波長を使用します。 519および561 nmでの発光波長を持つ蛍光色素を励起するために458ナノメートルの波長のアルゴンレーザーを使用してください。 665nmでの発光波長で蛍光色素を励起するために633nmの波長を有するヘリウム - ネオンレーザーを使用します。

7.二次コロニーアッセイに解離と再プレートプライマリリング/高密度コロニー

注：すべての手順は無菌条件下で行われるべきです。このような冷PBS / BSAで氷や洗浄細胞に細胞を置くなど、可能な限り、この手順で細胞に冷たい衝撃を避けてください。このような慣行は、再播種した細胞の生存率を低下させます。

  1. ソリューションを準備します。
    1. 37℃の水浴中でプレ暖かい洗浄緩衝液（0.1％BSAを含むDMEM / F12; P / S）。
    2. 前のウォーム96ウェルプレート（平底、低結合）を37℃のインキュベーターに。第二に一方のプレートのウェルを100μlの0.25％トリプシン-EDTA溶液を100μlの100％のFCSを追加よく。
  2. コロニーを収集します。
    1. ステップ5.4で説明したように、10μlのピペットチップを使用して、初代培養物における20以上のリング/高密度コロニーの合計を選択し、プール。
    2. 5分間400×gで1.5ミリリットルチューブとスピンで温かい（少なくともRT）洗浄緩衝液（〜千マイクロリットル）でコロニーを置きます。上清を取り除きます。
  3. トリプシンを用いて単細胞懸濁液にコロニーを解離します。
    1. （7.1で調製）を温かいトリプシン溶液を含んでいるウェルに、コロニーが含まれている残りの容量（20μL以下）を、転送します。
    2. 1.5分間37℃のインキュベーター（ない水浴）でプレートをインキュベートします。プレートを取り外し、コロニーを数回ピペット。さらに1.5分間37℃でインキュベートします。
    3. プレートおよびピペットアップを削除し、さらに数回上下コロニーを破壊します。コロニーは単一細胞懸濁液に、主に分散されているかどうかを確認するために顕微鏡下で確認してください。コロニーの過剰消化を避けてください。
  4. FCSを追加することにより、トリプシン反応を停止します。
    1. 細胞を含むウェルに暖かいFCS100μlのを転送します。ピペットアップと数回ダウン。千μlの温かい洗浄緩衝液を含む1.5 mlチューブに細胞を移します。室温で5分間、400×gで遠心分離します。
    2. 暖かい緩衝液で2回洗浄します。
    3. 再懸濁バッファーまたは培養培地の〜200μl中の細胞を。
  5. 血球計を用いて細胞数をカウントします。 RTで細胞懸濁液を保管してください。
  6. プレートを再マウスECMタンパク質（5％v / v）のまたはラミニンヒドロゲル（100μg/ mlの）のいずれかを含む二次コロニーアッセイに細胞を解離し、5％CO 2、37℃で細胞をインキュベートします。
    注：マウスの​​ECMタンパク質に細胞を再メッキのため、2-3週間のためによく、文化あたり2,500〜5,000細胞を使用しています。ラミニンヒドロゲル文化に再patingについては、7-12日間も、文化あたり10,000〜25,000細胞を使用しています。

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結果

成人の膵臓前駆細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ 図1）によって濃縮することができます。ここで使用されるのSox9 / EGFPトランスジェニックマウスラインが最初GENSAT脳アトラスプロジェクト19の結果として生成され、EGFPレポーターは、上流〜75キロバイトと〜150キロバイトのSox9 20の下流の配列を含む細菌人工染色体の制御下にありました。これらのマウスでは、EGFPは、効率的かつ特異的に22膵管にラベルを付けます。膵臓を調達し、単一細胞懸濁液中に解離し、ビオチンと結合した抗CD133抗体で染色し、STV-APCとコンジュゲート二次抗体で染色することにより行いました。得られた細胞は、適切なゲーティングパラメータ（ 図1）を用いてフローサイトメトリーにより分析しました。異なるゲーティングパラメータを使用して得られた細胞を選別し、ためのメチルセルロースを含有するコ​​ロニーアッセイにプレーティングすることができコロニー形成。以前...

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ディスカッション

膵臓コロニーアッセイおよび単一コロニーをここで説明する分析は、過去数十年23中の造血前駆細胞の生物学を解読で主要な役割を果たしてきたメチルセルロースを含む、造血コロニーアッセイに触発されました。これらのアッセイ（ 図5）において、膵臓細胞を適切な成長因子およびECMタンパク質のリングの形成をサポートする、高密度または内分泌/腺房コロニー7とメチルセルロースを含有する半固体培地に播種する解離。細胞のコロニーを生じることが可能な単一の前駆細胞はPCFUと呼ばれます。マイクロ流体定量RT-PCRおよびホールマウント免疫染色を用いて、個々のコロニーを特徴づけることにより、元のPCFUsの系統電位を推定することができます。これは、成体マウスPCFUsの大部分はトリ強力なインビトロ 7,9 内管、腺房、及び内分泌系統細胞を生じさせることが可能であることが見出されました。 MUR一方、伊根のECMタンパク質は、ダクト系統に向けてトライ強力PCFUの分化を促進する、ラミニンヒドロゲルは、堅牢な内分泌および腺房細胞系譜分...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

私たちは、ソートの支援のための希望の都市で分析サイトメトリーコアからルーシー・ブラウンとアレクサンダースパッラに感謝します。この作品は、国立衛生研究所によって部分的にサポートされている（NIH）ADRにHTKにR01DK081587とR01DK099734を付与し、U01DK089533、国立科学財団助成金NSF-DMR-1206121及び再生医療のためのカリフォルニア工科大学によってDATにRB5-07398を付与サポートジョセフ・J・ジェイコブスDATにカリフォルニア工科大学で医学のための分子工学研究所、およびオックスナード財団とエラ・フィッツジェラルド財団からのものからHTKにも深く感謝しています。

資金調達：この作品は、国立衛生研究所によって部分的にサポートされている（NIH）ADRにR01DK081587とR01DK099734 HTKに、とU01DK089533を付与し、国立科学財団の助成によりNSF-DMR-1206121及び再生医療のためのカリフォルニア工科大学にRB5-07398を付与DATは、ジョセフ・J・ジェイコブスからサポートDATにカリフォルニア工科大学で医学のための分子工学研究所、およびオックスナード財団とHTKのエラ・フィッツジェラルド財団からのものも深く感謝しています。この刊行物で報告された研究は、受賞数P30CA33572の下で国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされている分析サイトメトリーコアと光学顕微鏡デジタルイメージングコアで実行される作業が含まれていました。

研究のスポンサー：スポンサーは、研究デザイン、収集、分析、またはデータの解釈に参加しませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マウスECMタンパク質(マトリゲル)ベクトン・ディクソン(フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国)354230は-20°に保たれています。デ
ビッド・ティレル(米国ラミニンヒドロゲル-20°に保たれています。C
メチルセルロース信越化学 (東京)1,500 センチポアズ (動粘度単位 15 g/cm/秒) (高粘度)
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineMediatech (Manassas, VA, USA)21-031-CV
Phosphate Buffered SalineGibco (Grand Island, NY, USA)15070-063
50 ml Flacon Conical vialCorning Inc. (Corning, NY、米国)352070
100 mm x 20 mm懸濁培養皿Corning Inc.(米国ニューヨーク州コーニング)430591
Bovine Serum AlbuminSigma(米国ミズーリ州セントルイス)A8412
Penicillin/StreptomycinGibco(米国ニューヨーク州グランドアイランド)15070-063
DNase1Calbiochem(ドイツ、ダルムシュタット)260913
ラゲナーゼBロシュ(CH-4070、バーゼル、シュヴァイツ、スイス)11088831001在庫は-20°に保たれました。C
抗マウス CD16/32Biolegend (サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)101310低エンドトキシン、アジドフリー
PE-Cy7 ラット IgG2a &κ;アイソタイプコントロールバイオレジェンド(米国カリフォルニア州サンディエゴ)400522
ラットIgG1 & κ;Isotype ControleBioscience (San Diego, CA, USA)13-4301-82
Anti-CD133-BiotineBioscience (San Diego, CA, USA)13-1331-82
Anti-CD71-PE-Cy7Biolegend (San Diego, CA, USA)113812
Streptavidin-AllophycocyaninBiolegend (San Diego, CA, USA)405207
4',6-Diamidino-2-phenylindoleInvitrogen (マサチューセッツ州ウォルサム、 USA)3571在庫は-20 °に保たれました。C
Anti-mucin 1Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)HM-1630-P1
Dylight 649 Goat anti-Armenian HamsterJackson Immuno (West Grove, PA, USA)127-495-160
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12Mediatech(Manassas, VA, USA)10-092-CV
Fetal Bovine SerumTissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)101ストックは-20°に保たれました。C
Tris Ethylenediaminetetraaceticacid TEKnova (Hollister, CA, USA)T0221
Rneasy Micro KitQiagen (Venlo, Netherlands)74004
QuantiTec Reverse Transcription KitQiagen (Venlo, Netherlands)205310
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitAmbion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)11753-100
パラホルムアルデヒドSanta Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)SC-281692
ヤギ血清Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)005-000-121Stock kept at -20 °C
Donkey serumJackson Immuno (West Grove, PA, USA)0017-000-121在庫は-20 °C
Triton X-100Sigma (米国ミズーリ州セントルイス)T9284
Trypsin Sigma(米国ミズーリ州セントルイス)T-4799
エチレンジアミン四酢酸Invitrogen (マサチューセッツ州ウォルサム、 米国)15575-020
Trypsin-EDTALife Technologies(米国マサチューセッツ州ウォルサム)25200-056
滅菌水Gibco(米国ニューヨーク州グランドアイランド)15230-147分子生物学グレード
パスツールピペットフィッシャーサイエンティフィック(米国ペンシルベニア州ピッツバーグ)13-678-8B
40 μm フィルターメッシュフィッシャーサイエンティフィック (米国ペンシルベニア州ピッツバーグ)08-771-1
70 μm フィルターメッシュFisher Scientific (ペンシルベニア州ピッツバーグ、米国)08-771-2
TC Plate 96 Well SuspensionSarstedt83.3924 (Previously 83.1835)
1 cc SyringeBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)309659
10 cc SyringeBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)301604
48.48 Dyanmic Array ChipFluidigm (San Francisco, CA,アメリカ)BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 ダイナミックアレイサンプル &アッセイローディング試薬キットFluidigm (米国カリフォルニア州サンフランシスコ)85000800
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems (米国ニューヨーク州グランドアイランド)4304437
ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートSigma (米国ミズーリ州セントルイス)P7949
ガラス底皿MatTek (米国マサチューセッツ州アッシュランド)P35G-1.5-14-C35 mm ペトリ皿、ガラス底
マウスピース/ラバーチューブRenova Life Inc.(米国メリーランド州カレッジパーク)MP-SET
ニコチンアミドシグマ(米国ミズーリ州セントルイス)N0636在庫は-20 °に保たれています。C
血管内皮増殖因子R&D Systems (ミネソタ州ミネアポリス、米国)293-VEストックは-80 °に保たれています。C
アクティビン BR&D Systems (ミネソタ州ミネアポリス、米国)659-AB在庫は-80 °に維持。C
Extendin 4Sigma (St. Louis, MO, USA)E7144Stock kept at -20 °C
Rspondin-1R&D Systems (ミネソタ州ミネアポリス、米国)3474-RS在庫は-80 °に保たれています。C
Falcon 5 ml ポリスチレン丸底チューブCorning Inc. (米国ニューヨーク州コーニング)352054
PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)305196
PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)305198
Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate Corning Inc. (米国ニューヨーク州コーニング)3473
Costar 96 Black Well PlateCorning Inc. (米国ニューヨーク州コーニング)3603蓋付き平底透明。黒色ポリスチレンTC処理マイクロプレート
ツァイス LSM510 META NLO Axiovert 200M 倒立顕微鏡カールツァイスAG(ドイツ、オーバーコッヘン)
バイオマークHD Fluidigm (米国カリフォルニア州サンフランシスコ)
Aria Special Order Research Product Cell SorterBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)
PBS/BSA1x PBS
0.1%(重量/vol)BSA
ペンストレップ(49単位/ mlペニシリン、49 μg/ml ストレプトマイシン)
PBS/BSA/Dnase11x PBS
0.1%(重量/vol)BSA
ペンストレップ(49単位/ mlペニシリン、49 μg / mlストレプトマイシン)
Dnase 1 (2,400 単位/ml/膵臓)
ストックカリフォルニア州パサデナ)が提供するC在庫はコ

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