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方法論記事

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

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DOI:

10.3791/54041

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2016年6月2日

 ,  , 
1Center for Vaccines and Immunology, Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia

この記事について

サマリー

ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。

要約

ウイルス様粒子（VLP）およびサブウイルス粒子（のSVP）は、ライブ病原体の使用よりも増加した生物学的安全性と安定性の利点を提供するウイルスワクチン設計の代替的なアプローチです。非感染性および自己集合、VLPは、ライブの病原体または抗原の送達のための組換えウイルスベクターの必要性を迂回し、免疫原としての構造タンパク質を提示​​するために使用されます。この記事では、前臨床動物試験で将来のアプリケーションのためのVLPの設計と開発のさまざまな段階を示しています。抗原の選択、選択、VLPを/のSVPの精製、および抗原投与のための定量化の細胞株における抗原の発現：手順は、以下の段階を含んでいます。私たちは、抗原の発現のための両方の哺乳動物および昆虫細胞株の使用を実証し、方法論は収量が異なる方法を示しています。提示された方法論は、様々な病原体に適用することができるし、免疫原性STRで抗原を置換することによって達成することができます興味のあるユーザーの微生物のucturalタンパク質。 VLPおよびのSVPは最高のワクチン候補の抗原の特徴付けおよび選択を支援します。

概要

ウイルス様粒子（VLP）は、ヒトのワクチン接種のために承認された技術です。実際には、ヒトパピローマウイルス（HPV）を含む多くの現代的なライセンスワクチンの一部及び肝炎Β（HepΒ）ワクチンは、このアプローチを採用します。 VLPは自己集合することが可能な構造タンパク質から形成されます。組み立てられた粒子は、ウイルスの形態を模倣するが、彼らはウイルスゲノムを欠くので感染または複製することはできません。 VLPは、発現され、原核生物および真核生物系の数から精製することができます。 - 28％、酵母- 20％、植物- 9％、昆虫- 28％、および哺乳動物- 15％1細菌：文献のレビューは、異なった発現系は、以下のレートで使用されていることを明らかにしました。注目すべきは、L1カプシドタンパク質に基づくHPVワクチンは、酵母（ガーダシル）または昆虫細胞システム（サーバリックス）2で製造されます。 HepΒワクチン、RecombivaxとENGERIX-Βは、また、酵母で生産されており、HepΒ表面抗原3で構成されています、4。

我々は、アセンブリのための複数の構造タンパク質の同時発現を必要とするのVLPを産生する哺乳動物および昆虫細胞発現系を使用します。インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、デング熱ウイルス（DENV）、およびチクングニアウイルス（CHIKV）：私たちの仕事は、人間の病原体に対する設計、生産、および精製VLPに基づくワクチンに焦点を当てています。我々の方法は、複数の発現プラスミドからの複数の構造タンパク質、または単一の発現プラスミド（ 図1）の共発現を可能にするために十分に柔軟です。以前、我々は、製造および精製H5N1 VLPは、インフルエンザ赤血球凝集素（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、及びヒト胚性腎臓293T細胞におけるマトリックス（M1）5,6をコードするプラスミドとの共発現から組み立て。遺伝子は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化さpTR600、transcを開始するためのサイトメガロウイルス初期プロモータープラスイントロンAを含む真核細胞発現ベクターにクローニングしました。真核生物の挿入と転写7の終結のためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルのription。 HA、NA（ 図1A）および代替ウイルスマトリックスタンパク質、HIVのGag P55、の三プラスミドの同時発現を用いて同様のアプローチがこの研究にヒト季節性インフルエンザ亜型H3N2 VLPの生成に使用し、生成することが示されていますインフルエンザ粒子8と同様のサイズのVLPを。インフルエンザワクチンは、主に抗HA抗体を誘発するが、インフルエンザノイラミニダーゼの添加は、トランスフェクトされた細胞9も存在する追加の免疫原性標的から出芽VLPを可能にするためにシアリダーゼ活性を媒介します。 RSVのVLPを生成するために、我々はまた、先に説明し、電子顕微鏡6,10によって特徴付けられるように、さらに、HIVギャグを使用して、VLP形成の柔軟性を実証するために排他的にRSV表面糖タンパク質を提示原型ワクチンを設計するHIVのGagの無関係なコアを選択しました。他人以前それはRSV糖タンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）11、およびインフルエンザマトリックス12から種々のウイルス成分を用いて組み立てることができる提示するVLPを示しています。全長表面糖タンパク質配列は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を介して機能的受容体結合および抗体認識のアッセイのために必要とすることができる天然のコンホメーションを維持するために、この研究において使用しました。

粒子を生成するために単一のプラスミド発現系を使用するための私達の例としては、DENVおよびCHIKVあります。 DENVのケースでは、我々は、PRM / E構造遺伝子発現カセット13を含む単一プラスミドからの293T細胞における無カプシドとサブウイルス粒子（のSVP）を生成することができます。用語SVPは、ウイルス構造タンパク質のアセンブリにおいて、コアまたはカプシドタンパク質の欠如を示すために使用されます。 CHIK VLPはまた、カプシドおよびエンベロープタンパク質をコードする、またはIで、CHIKV構造遺伝子カセットを含む単一プラスミドを用いて製造することができます昆虫細胞発現（ - C 図1B）のために最適化された同じ構造遺伝子カセットをコードする組換えバキュロウイルスに感染させることによってnsect細胞。

上述の式アプローチの最終結果は、その後、20％のグリセロールクッションを介して超遠心によって精製することができる細胞培養培地中にVLPを放出します。本稿では、哺乳動物および昆虫細胞系からこれらのVLPを発現し、精製する方法を提示します。

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プロトコル

インフルエンザH3N2 VLPの生成1.哺乳動物発現系

  1. サブクローン例えば前述のpTR600のような真核生物発現ベクター内へのウイルス構造糖タンパク質ヘマグルチニン（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）のGag P55 7
  2. 化学的にコンピテントな大腸菌（ 例えば 、DH5α）でDNAを増幅し当たり、製造業者の指示としてプラスミド精製キットを用いてトランスフェクショングレードのプラスミドを単離します。 DNAの量は、収率及びユーザのニーズに依存しています。
  3. 加湿インキュベーター中5％CO 2で37℃で10％胎児ウシ血清（FBS）を含む増殖培地中で、哺乳動物細胞株、293Tを維持します。
  4. T-150組織培養フラスコは、フラスコには、次の日までに完全な細胞接着と百分の85から95までの細胞集密度を取得するように、フラスコ当たり45から75×10 6個の細胞を含むように細胞を増殖させます。希望conflu用顕微鏡下で細胞を検査ency。
    注：高細胞密度は、典型的には、しかしながら過剰コンフルエント副産物細胞廃棄物の蓄積をもたらし、細胞生存率を減少させることができる商業的なトランスフェクション試薬を使用した場合、最小限の細胞毒性で最適なタンパク質の発現を得るために推奨されます。
  5. トランスフェクションの日に、製造業者の推奨に従ってリポソームとDNAの混合物を準備し、1のDNA組成物とDNA細胞をトランスフェクション：HAの2：1 NA：T-150フラスコあたり40μgの総DNA量とギャグ。各フラスコに20〜30 mlで全容積を含むように、抗生物質を含まない無血清トランスフェクション培地中でDNAとリポソーム溶液を希釈します。
    注：遺伝子構築物の比率は、ユーザーの最適化を必要とし得ます。 1比：ここで実証されていないが、同様のトランスフェクション手順は、1で呼吸器合胞体ウイルス（RSV）FとHIV GAGと行われています。 DENVとCHIKV単一の発現プラスミドを、T-150フラスコあたりのDNAの20μgの合計に最適な電子のために使用されていますXPRESSION。 DNA：トランスフェクション試薬の比をユーザに最適化されています。使用はすなわち 、トランスフェクション法に基づくトランスフェクション培地を推奨、ポリカチオン性脂質トランスフェクションは、メディアが成長ホルモンを補充し、血清の非存在下での成長をサポートするために、微量元素することができるこのようにウシ胎児血清の減少または不在をお勧めします。
  6. 5％CO 2インキュベーターで37℃にフラスコを返します。 200ミリリットルの容量については、9 T-150フラスコを使用しています。細胞は、VLPの収穫日までトランスフェクション培地中で維持されています。
  7. 収穫培養抗原に応じて72〜96時間後、トランスフェクション後の細胞からの上清、またはときに、顕微鏡検査によって推定されるように、細胞生存率は70〜80％に減少しました。転送50mlコニカルチューブに上清とは、細胞破片をペレット化し、4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。
    注：付着細胞への新鮮予め温め、無血清トランスフェクション培地で3日間の上澄み液の交換はyielます類似またはわずかに低下し収率でVLPのダ第2のロットは、ユーザーが最適化されるべきです。
  8. 超遠心分離を介して、沈降前に0.22μmの細孔膜を通じたプール上清およびフィルタ。
  9. 0.8％の七面鳥または哺乳動物の赤血球を使用して、標準的な血球凝集アッセイ14によるHA発現VLPの赤血球凝集活性を試験または抗原特異的ELISAを進めます。代表的な結果については、 図2を参照してください。

バキュロウイルス/昆虫細胞系を用いて2 CHIK VLP式

  1. 商業バキュロウイルス発現系を用いて、S-27株からチクングニアウイルスのカプシドおよびエンベロープタンパク質（C-E3-E2-6K-E1）を発現する組換えバキュロウイルスを生成します。
  2. 28℃で100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを有する無血清Sf9細胞増殖培地中で培養スポドプテラ・フルギペルダ Sf9細胞。 suspens用スピナーフラスコ培養を開始するために3-5×10 5 C / mlで使用しイオンの細胞増殖。日常の通路彼らは2-4×10 6 C / mlの（3〜4日毎）の細胞密度に達します。
  3. スピナーフラスコ中の懸濁液中の培養Sf9細胞マルチスターラープレートシステム上で130rpmで撹拌しながら。適切な通気のために、スピナーフラスコの半分以下音量で培養容量を維持します。
  4. CHIK VLPの発現のために、1の感染多重度で組換えバキュロウイルスで、2×10 6細胞/ mlの密度で、Sf9細胞を感染し、28℃のインキュベーターに戻します。典型的には250mlのSf9細胞を含む1つまたは2つのスピナーフラスコを感染させます。
    注：私たちは、このメソッドを使用していないが、Sf9細胞をシェーカープラットフォームを使用して28℃で振盪フラスコ中で培養することができます。
  5. 製造業者のプロトコルに従ってトリパンブルー排除によって決定されるように細胞生存率が70〜80％に減少した72〜96時間の感染後、または後に収穫培養。
    注：細胞は、感染しながら増殖し続けるとがあります3日、感染後に組換えCHIK VLPをバキュロウイルスに感染したSf9培養における〜80％の生存率（解像度）。バキュロウイルス感染細胞は、外観が大きくなっています。形態はまた、長楕円形をラウンドから変更されることがあります。バキュロウイルス感染の後期段階では、細胞が溶解し始めました。
  6. 円錐管50ミリリットルに懸濁培養から直接文化を移し、4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。
  7. 上清を収集し、超遠心分離を介して沈降する前に、0.22μmの細孔膜でろ過します。

VLP /のSVPの3沈降/精製

  1. バイオセーフティーフード内で70％エタノール、25ミリメートル×89ミリメートルオープントップの超遠心管を滅菌します。エタノールを使用する前にオフに乾燥していることを確認します。
  2. きれいなチューブに上清の32ミリリットルまでロードします。 25ミリリットルの最小容量は崩壊し、不十分満たされた超遠心管の損傷を防止することをお勧めします。
  3. 慎重下敷き上清ウィットPBS中のH無菌3 mlの20％グリセロール（v / v）です。チューブがバランスしていることを確認してください。
  4. 4℃で4時間、135,000×gでスピン。
  5. ペレットがチューブから外れるません確実に上清を吸引し、。
  6. 再懸濁を激しくピペッティングにより滅菌PBSでチューブの底にVLPのを沈降させました。 PBSの量は、VLPは、VLP総タンパク質収量と下流のアプリケーションに依存して再懸濁する必要がありました。一般的に、少なくとも100μlの各VLPペレットを再懸濁します。
  7. 短期記憶および長期保存のために-80℃で貯蔵のためにストアサンプル4°C。

4.タンパク質収率および特異抗原の収量を決定します

  1. 製造業者のプロトコルに従って、このようなBCAアッセイなどの市販のタンパク質定量法を用いて、総タンパク質含有量を決定します。
  2. 特定の抗原含量を評価するために、標準的な抗原及び2-5の連続希釈液を塗布して直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を行います1; ELISA 96ウェル平底プレートへの総タンパク質試料のG。
    1. プレート上の抗原の存在を探索し、マイクロプレートリーダーのための検出可能な吸光度を産生するために、従来のELISAの開発の基板を使用する抗原特異的な抗体を用いて、次のとおり。 VLPを、HAを発現するサンプルのHAおよびELISAアッセイの代表的な結果については、 図2を参照してください。 HAとNAの多くの組み合わせは、おそらくですが、収量はHA-NAの互換性15時に異なる場合があります。
      注：抗原特異的抗体は、可変の親和性を持って、抗体の終点希釈滴定は、VLPの定量化を行う前に決定されることが推奨されます。市販の抗体は、濃度または希釈範囲ELISAで使用するための、ならびに提案したプロトコルを提案しているでしょう。

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結果

VLPの収量は、ウイルス抗原構造物の設計によってばらつきがありました。このプロトコルでは、我々は、超遠心分離によって上清中のSVPまたはVLPの産生および精製のための昆虫および哺乳動物細胞を使用することを実証しました。 DENVのprM / E構造遺伝子発現カセットの4つのサブタイプは、 表1の（1-4として画定）DENVのSVPのバージョンを構築する0.6 mlの体積中の総タンパク質の1.1から2.6ミリグラムの範囲を示すために使用されました。インフルエンザVLPをを合成するために、それぞれギャグ;：HAのための2：1：NA 3遺伝子構築を必要とするVLPのために、我々は1の最適化されたDNAトランスフェクション率を発見しました対照的に、複数のチクングニアウイルスタンパク質を発現する単一プラスミドは、組換えバキュロウイルスおよび哺乳動物CHIK VLPを生成するための適切でした。 RSV FおよびGagこのような1でトランスフェクトされたように加え、デュアルプラスミドトランスフェクション法は、哺乳動物細胞でも可能である：1の比、及びa...

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ディスカッション

我々は成功し、様々な病原体のための複数の構造タンパク質で構成のSVPとのVLPを発現し、精製するために、上述の技術を使用しています。一般的に、我々は我々のVLPを生成するために、哺乳動物発現系を使用しています。しかし、私たちの手で、哺乳動物細胞は、CHIKのVLPの収量が低かった派生しました。組換えバキュロウイルス - 昆虫細胞系を使用する場合CHIKのVLP収率はより堅牢でした。一般的に、バキュロウイルス - 昆虫細胞系は、一方の制御下で、また、外来遺伝子の発現の高いレベルに組織培養フラスコ対スピナーフラスコで培養することができる、より高い細胞密度に起因し得る組換えタンパク質の高い量を得ますバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの。16しかし、バキュロウイルスを使用することの欠点は、アジュバント活性を有するVLP調製物中のバキュロウイルスの存在そのもの、およびワクチンにおけるスキュー免疫学的結果は、我々はまた、インフルエンザVの収量の変動を発見した17の研究であります使用HAとNAの組み合わせに応じてのLP。 H3N2 VLP2は比較的潜在的により効率の低いVLPのアセンブリまたはNA-互...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

私たちは、最大効率や歩留まりのためのプロトコルを最適化する助けたロスラボの前にメンバーを承認したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プラスミドMaxiのキットQiagen12163
DMEMCellgro10-013
LipofectamineLife TechnologiesL3000075Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000
Opti-MEM ILife Technologies31985062
Bac-to-Bac Baculovirusの発現システムLife Technologies10359-016
Cimarec I 6 マルチポイントスターラープレートサーモフィッシャーサイエンティフィック50094596
ポリクリア超遠心チューブSeton7025超遠心分離機に適したチューブとバケツサイズの確認
マイクロBCAタンパク質アッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック23235
リン酸クエン酸バッファーSigmaP4922
o-フェニレンジアミン二塩酸塩 シグマP8287
0.22 μm 真空フィルタートップ (500 ml)Nalgene569-0020
グリセロールSigmaG5516
H2SO4Sigma339741 
SF-900 II SFMサーモフィッシャーサイエンティフィック10902-096

参考文献

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