皮膚外科神経切除：皮膚病のマウスモデルにおける神経のための要件をテストする方法

サマリー

この記事には、マウスの皮膚の遺伝的標識、外科的除神経、皮膚生検、およびホールマウントβ-ガラクトシダーゼ染色による標識上皮の可視化のための詳細なプロトコルが含まれています。これらの方法は、正常皮膚と病理学的皮膚のマウスモデルで神経の必要性をテストするために使用できます。

要約

皮膚の体性感覚神経は、皮膚に作用する多様な刺激を検出するように機能します。神経は感覚的な役割を確立するだけでなく、アトピー性皮膚炎、乾癬、がんなどの皮膚疾患も神経が調節する可能性があることが最近の研究で示唆されています。ここでは、皮膚の機械感覚器官であるタッチドーム(TD)を維持するための神経の要件をテストするためのプロトコルについて説明します。具体的には、ホールマウント染色によるTDの遺伝的標識、採取、可視化の方法、およびマウスの背側背部皮膚に対する片側の外科的除神経を行う方法について議論します。これらのアプローチを組み合わせることで、同じ動物の除神経皮膚と偽手術皮膚のTD形態と遺伝子発現を直接比較することができます。これらの方法は、皮膚病理のマウスモデルにおける神経の必要性を調べるためにも容易に適応させることができます。最後に、皮膚を繰り返しサンプリングする能力は、開始後のさまざまな段階と時間で病気の進行を監視する機会を提供します。

概要

過去数年間で、一般的には古典的な神経障害^1-4とは見なされない疾患に対する神経の影響に対する認識が広がっています。皮膚では、最近の実験的証拠により、感覚神経が乾癬から癌^5-9に至るまでの多様な病状を調節できることが示唆されています。これは、げっ歯類の神経機能の外科的除神経や薬理学的阻害などの技術を使用して実証されています。 乾癬の場合、これらの研究は、神経機能の喪失後にヒトの乾癬プラークが退行する理由を理解するためのメカニズムフレームワークを提供しました^7,10-12。

皮膚神経も遺伝子発現に影響を与える可能性があり、^13,14、正常な皮膚¹⁵の機械感知に重要です。特に、タッチドーム(TD)上皮は、ゆっくりと適応する1型(SA1)神経線維^16〜18によって神経支配される神経内分泌メルケル細胞と並置された円柱状表皮細胞のパッチで構成されています。TDは軽い触覚を媒介し、ハリネズミ経路の活動を示すことが示されています^5,19。TDの維持は神経支配^20,21に依存し、神経は正常なTDとそれに関連するメルケル細胞¹⁹を維持するためにヘッジホッグリガンドを分泌する。さらに、神経支配はTD上皮5からのヘッジホッグ依存性腫瘍形成^{を促進します。}これらの研究は、神経とそのニッチ内の周囲の細胞との間に起こる複雑な分子相互作用が、正常なTD生理学と疾患にとって重要であるという考えを補強しています。

これらの相互作用の性質を調査するために、ここではTDにおける遺伝子発現を操作するための一連のin vivo技術、および系統追跡後のTD視覚化のための皮膚生検採取のための技術について説明します。最後に、マウスの背側皮膚の片側から神経を切除し、反対側を無傷のままにして偽の内部制御を行う片側の外科的除神経を行う手順について説明します。手術の数週間後、除神経された皮膚と偽の対照皮膚を比較して、神経がアブレーションされたときに発生する変化を評価します。これらの技術は正常なTDの文脈で説明されていますが、除神経手順は、乾癬⁶、創傷治癒¹³、および腫瘍形成⁵のマウスモデルにおける神経の必要性を調べるために使用されてきました。最後に、皮膚は繰り返しの生検に適しているため、標識細胞の長期的な運命を監視したり、複数の時点での疾患の進行を評価したりする機会を提供します。

プロトコル

このプロトコルで説明されているすべての手順は、実験動物医学のためにミシガン大学の単位によって確立された規則に従って行われました。

1.マウスの遺伝的組換えを誘導します

注：Gli1の ^{TM3（CRE / ERT2）ALJ} / Jマウス系統（Gli1の ^{-CreERT2）13は、}上皮をTDためにタモキシフェン誘導性の遺伝子組換えの標的化を可能にします。 Gli1のを生成するために^22（ のLacZ）B6.129S4-GT（ROSA）26Sor ^tm1Sor / Jレポーターマウスとこの株を渡り、LacZを動物以下の染色ホールマウントにより、TD細胞を可視化します。

1. コー​​ン油中の12.5mg / mlの濃度にタモキシフェン溶液を調製します。
   1. 1.5ミリリットルチューブでは、結晶性タモキシフェンを20mg、及びコーン油の後、1ミリリットルまで追加。タモキシフェンは、完全に（2-4時間）に溶解するまでのように、しっかりとボルテックスミキサーにチュ​​ーブをテープ、そしてRTで最高の設定で連続渦タモキシフェン微粒子の欠如のために解剖顕微鏡下で管を検査することによって確認されました。
   2. 15ミリリットルチューブにソリューションを転送し、追加のトウモロコシ油とミリリットルの12.5mg /の最終濃度にタモキシフェンを希釈します。さらに30秒間、粘性溶液をボルテックスして混合します。暗所で4℃で1週間までこの溶液を保管してください。
2. Gli1の腹腔内にタモキシフェンソリューションを注入し、LacZのマウスを、マウス体重の20グラムあたり200マイクロリットルの容量で、20グラムのマウスの重量当たり2.5ミリグラムの有効タモキシフェン投与量のために。

2.収穫皮膚生検

注：タモキシフェン誘導後数週間の実験に応じて、収穫の皮膚生検数日。すべての手術のために、滅菌手袋を使用して、外科手術用マスクやヘアネットを身に着けている、と手順の間、滅菌外科用ドレープで動物をカバーするなどの齧歯類の手術のための標準プロトコルに従います。

1. 水に90 mg / mlでケタミンおよび6.5 mg / mlとキシラジンを混合することにより、10倍の株式麻酔薬溶液を調製します。使用直前に無菌PBSにこの原液を1:10に希釈し、最大8ヶ月間、暗所で室温で保管してください。
   1. また、完全に動物を麻酔するために酸素と4％のガス濃度で始まる、イソフルラン吸入によってマウスを麻酔し、その後手続きの期間中、一から二パーセントにこれを下げます。
2. 20グラムマウス体重あたり200μlの用量で腹腔内麻酔液を注入します。動物はつま先のピンチアッセイによる鎮静の適切な面に到達したことを確認し、その心を確認し、呼吸率は（それぞれ、約600拍毎分160回の呼吸）正常です。
3. 、背部背部皮膚に生検部位から髪を削除しないニックように注意してか、下にある皮膚を損傷する電気バリカンを使用してください。
4. 剃りを拭いて手術部位を準備ベタジンとアルコールワイプを使用して、前方対後方方向でD領域。すべての髪の切り抜きがサイトから削除されていることを確認します。
5. 無菌手術領域に加温パッドの上に動物を配置し、黒のマーカーを用いて、生検部位を概説し、（デモの目的のために、滅菌ドレープが視認性を高めるために省略されました）滅菌外科用ドレープでカバー。
   注：毛包の長手方向部分を取得するには、生検（エッジが組織学のために切片するために、約1センチ）の長辺はにparasagital、前後方向（毛包の方向に平行）で実行する必要があります背側正中線（ 図1A）。
6. 根本的な筋肉の筋膜に損傷を与えることなく、マークされた領域に沿って全層切除を行うために、無菌＃11メスを使用してください。
   注：切除した皮膚組織は、表皮、真皮、皮下脂肪と皮筋層を含んでいます。出血は通常、最小です。
7. トンをフラット化彼は乾いたペーパータオルの上皮膚試料を切除し、真皮は、ダウンサイド過剰ペーパータオルを離れてトリム、および他のサンプルを収集する必要がある場合、最大1時間の冷PBSでサンプルを保存します。準備ができたら、組織学、または全載βガラクトシダーゼ（LacZを）染色のためのステップ4のためのサンプルを処理するためにステップ3.1または3.2に進みます。
8. 縫合糸は、およそ3ミリメートル離間シンプル中断したパターンで、6-0ナイロン縫合糸を使用して、生検部位を閉じます。
9. 完全回復後まで他の動物と同じケージに手術を受けたマウスを返さないでください。
10. 手術領域は、典型的には、1週間以内に、治癒するまで、彼らは毎日も意識を取り戻す、とまでは手術直後に動物を監視します。マウスは、痛みや苦痛の徴候を示す場合、指定機関の動物の管理と使用ガイドラインに従って鎮痛薬を使用してください。手術後7-10日以内に縫合糸を取り外します。
    注：必要に応じて、（50 mg / mlで株式solutカルプロフェンを希釈することにより、鎮痛剤溶液を調製イオン）1：滅菌水で100。 20gの体重あたり200μlの（5ミリグラム/ kgのマウス体重）の用量で、首筋の近くに肩甲骨の間の溶液の皮下注射。

組織学のため3.プロセスのサンプル

注：切除した組織を修復し、処理するには、アプリケーションに応じて、以下のいずれかの方法を使用します。

1. パラフィン包埋組織学的サンプルを生成するには、2週間まで70％エタノール中で、室温でPBS O / Nで3.7％ホルマリンで皮膚や店舗を修正。パラフィンに包埋する前にペーパータオルを削除します。
2. 凍結した組織学的サンプルを生成するために、PBS中の冷4％パラホルムアルデヒド中で組織を沈め、ゆっくりと1時間振とうします。溶液を除去し、PBSを3回交換し、約5分ごとにサンプルを洗います。次に、組織（「ショ糖沈没」）をcryoprotectするPBS中30％スクロース中にサンプルを沈めます。
3. 4℃で穏やかに振盪しながら、O / Nでインキュベートします。翌日、ペーパータオルを削除エルと皮膚の真皮側から過剰な脂肪組織を切り落とします。 10月に直接組織を埋め込み、-80℃で凍結したブロックを格納します。
   注意：以前に^5,19に記載のように切 ​​片した後、パラフィンまたは凍結サンプルのいずれか、のTD、メルケル細胞とそれぞれケラチン17、ケラチン8およびニューロフィラメントに対する抗体を使用して神経を識別するために、免疫組織化学によって染色することができます。

ホールマウントのLacZ染色4.視覚化サンプル

1. X-gal染色溶液を調製します。
   1. 滅菌水の250ミリリットルで0.94グラムの一塩基性リン酸ナトリウム、および2.6グラムのリン酸ナトリウム二塩基性を兼ね備えています。 7.3にpHを調整します。このために、1 M塩化マグネシウム、フェロシアン化カリウムの0.528グラム、およびフェリシアン化カリウムの0.412グラムの0.5ミリリットルを追加します。オクチルフェニルポリエチレングリコールの250μlを添加して、デオキシコール酸125mgの。塩基溶液は暗所で6ヶ月まで4℃で保存することができます。
   2. 50倍株式のX-galのsolutiを準備50 mg / mlで解決策を生成するためのX-galストックボトルにジメチルホルムアミドを添加することにより、上。暗所で-20℃でこの溶液を保管してください。
   3. 使用直前に、染色溶液を生成するために、X-GALのベース溶液に在庫のX-gal溶液を1:50に希釈します。小さ ​​な生検（<1 cm ^2）を、サンプル当たりの染色溶液のアリコート1-2 mlのため。
2. 静かに氷上で揺れ、30分間冷PBS中2％パラホルムアルデヒド/ 0.2％グルタルアルデヒドを含む溶液中で、ステップ2.7で採取した皮膚のサンプルを修正しました。小さ ​​い生検のために（<1 cm ^2）を、サンプルあたりの固定液1〜2mlのを使用します。
   注：また、のみ、またはわずか0.5％グルタルアルデヒド中で2〜4％パラホルムアルデヒドでサンプルを固定します。最適な固定条件は、組織、LacZ発現およびアプリケーションの度合いに依存します。
3. 固定剤溶液を除去し、室温でシェーカー上で、PBSを3回交換し、5分ごとにサンプルをすすいでください。
4. サンプルの下にペーパータオルを取り外し、excesを切り取ります鈍鉗子で脂肪を把持し、解剖ハサミでトリミングすることにより、皮膚の真皮側から脂肪組織をね。
5. X-gal染色溶液中に試料を浸し、37°C​​O / Nでインキュベートします。 LacZ発現は、解剖顕微鏡（ 図1B）の下でブルー染色として表示されます。
   信号強度が弱い場合、翌日染色液を交換し、O / Nインキュベーションを繰り返します注意してください。バックグラウンド染色が強すぎる場合には、染色の時間を短縮し、またはその代わりに、37℃の室温でサンプルをインキュベートします。
6. 染色液を外し、ゆっくりと室温で振盪しながら、約5分間、3％のDMSOを含有するPBSの3変化でサンプルを洗います。
7. 5分間、70％エタノールの2-3の変化で洗浄サンプル。 70％エタノールに保管サンプル。

5.外科神経切除

1. ステップ2.2のように動物を麻酔し、全体の背部皮膚を剃ります。
2. O手術領域を準備しますベタジンとアルコール綿を使用して、背中の皮膚fおよび滅菌外科用ドレープ（デモンストレーション目的のために、滅菌ドレープが視認性を高めるために省略された）で動物をカバーしています。無菌手術領域で動作している間に加熱パッドを用いて動物を暖かく保ちます。
3. 尾以上のおよそ0.5センチメートルに首の付け根から背側正中線に沿って滅菌＃11メスを用いて切開を行います。
4. 鈍鉗子を使用して、静かにちょうど後肢上記に首の近くに肩甲骨脂肪パッドから下にある組織を可視化するために離れてサイドから左サイドの肌を反映しています。
   注：背側皮膚神経は急カーブを作り、皮膚（ 図2）の下の疎性結合組織に入る前に、トランク壁の半透明の筋膜を介して尾側に移動する白いストランドとして表示されます。
5. 解剖光顕微鏡下で超微細鉗子を使用して、アニマの左側から独占的に神経を取り除きますどこから摘採によって解剖学的部位T3-12に位置リットル皮膚への参入サイトへのトランク壁におけるセグメントの曲がり（ 図2）。
   1. オリエント鉗子垂直とその曲げサイトの下約0.5cmに把握し、上向きに引っ張り、伸ばし、周囲の組織（ 図2C - E）から分離するために神経を引き起こすことによって神経を取り除きます。隣接する血管を破裂しないように注意してください。
   2. 皮膚へのトランク壁から延びているすべての神経が除去されるまで続けます。トランク壁の密な筋膜内の神経に影響を与えることはありません。定期的に0.9％滅菌生理食塩水の滴を適用することにより、作業中はしっとり組織を保管してください。
   3. また、鉗子でトランク壁の近く、その近位端を把握し、細かいハサミでつむことにより、神経を取り除きます。その後、皮膚に近い先端部を切断する（ 図2F - H）。最後に、int型を削除しますervening神経セグメント（ 図2I）。
6. ステップ5.4で露出した皮膚フラップから任意の神経を削除します。これらの繊維は、背側皮膚神経の遠位枝を含み、散発的に皮弁（ 図2J - K）の真皮側の結合組織内に配置された白の分岐ストランドとして表示されます。
   1. これらの細かい枝を削除するには、微細な鉗子は、大きく、皮膚表面に平行神経を把握し、血管を破壊し、皮膚を穿刺避けるために、上向きに摘み取る位置付けます。すべての可視神経が削除されるまで続けます。
7. 鈍的切開を使用して、背側正中切開の右側の皮膚を反映するが、神経を削除しないでください。これは、反対側の偽手術対照として機能します。
8. 切開部を閉鎖するための簡単​​な中断されたパターンで背側正中線に沿って縫合。回復とポストoperの中に動物を監視しますativelyとして以前に（ステップ2.8から10）を実証しました。手術後7-10日以内に縫合糸を取り外します。
9. 機能的に手術後数週間に安定した除神経アップを評価するために、電気バリカンを使用して背部皮膚から毛を取り除きます。
10. 静かに皮下注射針を使用して、除神経皮膚領域を刺すと、動物は、通常、身震いまたはその頭を回すことにより、応答するかどうかを注意してください。皮膚領域を安定的除神経された場合、動物は、ほとんどまたは全く応答を示すであろう。
11. 黒のマーカーを使用して、反対側の偽側の無応答の面積だけでなく、同​​様のサイズと位置の領域の輪郭を描きます。
12. 分析のための手順2.1から2.9のように、これらのサイトからの生検を収集します。
    注：別の方法として、除神経および偽手術領域を含む全体の背背中の皮膚は、ステップ4で説明したように似たホールマウント染色のための単一のシートとして除去することができます。

結果

タモキシフェン誘導性Gli1の-CreERT2およびLacZレポーター対立遺伝子を発現するマウスを生成することで、TD上皮を視覚化し、時間をかけてこれらの細胞の運命を追跡することが可能です。全体の除神経手順は、典型的にはマウスあたり1時間以内に完了することができ、動物に最小限の苦痛を引き起こす必要があります。

^5,19 -我々の以前の研究では、神経が正常なのTDだけでなく、それらに関連するケラチン8 ⁺メルケル細胞（C 図3A）の両方を維持するために重要であることが示されています。神経はまた、TD（ 図3D）にGli1の発現を促進するために重要です。皮膚（ 図1B）を通してTDクラスタの比較的まれな外観を与え、正確TD頻...

ディスカッション

神経は感覚ではなく、哺乳動物の臓器の開発、保守及び再生^13,24-27だけでなく重要な機能を果たします。神経が最近多様な皮膚疾患に関与しているように、ここで説明される技術は、動物疾患モデルの様々な神経支配の要件を研究するために使用することができます。確かに、一方的除神経の技術は、同じマウスから無傷または破壊神経のいずれかで皮膚の直接比較を可能にします。その後のデータは対応のあるt-検定を利用して分析してこれは、動物への動物の違いを補償するための理想的な内部統制を提供します。

ここで説明する手順は、大部分がLacZレポーター遺伝子を利用するが、これらの実験は、Gli1の-CreERT2対立遺伝子がTDで遺伝子発現を変更するために他の蛍光レポーターまたは条件付き対立遺伝子と結合するように適合させることができます。例えば、Gli1の-CreERT2マウスを交配することができます動物はタモキシフェン誘導⁵の後にTD-由来の腫瘍を形成するマウスを作製するためにPatched1（B...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルコール調製パッド	PDI	B339
AnaSed (キシラジン)	ロイド	NADA 139-236
抗体、抗ケラチン 8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I	ラット抗体、1:500 濃度で使用
抗体、抗ケラチン 17	細胞シグナル	#4543	ウサギ抗体、1:1,000 濃度で使用
抗体、抗ニューロフィラメント	細胞シグナル伝達	C28E10	ウサギ抗体、1:500濃度で使用
ベタジン調製パッド	メドライン	MDS093917
カルプロフェン(リマジル)	ゾエティス
コードレス充電式クリッパー	ウォール	トリマーモデル8900
コーン油	シグマ-アルドリッチ	C8267
クライオスタット	ライカ	CM1860
DAPI	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1306	を1:1,000濃度で使用
デオキシコール酸	シグマ-アルドリッチ	D6750
毛クリーム	ネア	N / A
ジメチルフォラミド	シグマ-アルドリッチ	319937
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ-アルドリッチ	D8418
グルタルアルデヒド	Sigma-Aldrich	G5882
ImmEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Ketamine HCl	Hospira	NDC 0409-2051-05
塩化マグネシウム	Sigma	M8266
マイクロカバーガラス	VWR	48404-454
マイクロスライド	VWR	48311-703
10% 中性緩衝ホルマリン	VWR	BDH0502-4LP
6-0 ナイロン縫合糸	DemeTECH	NL166012F4P
オクチルフェニルポリエチレングリコール	Sigma-Aldrich	I8896
O.C.T. コンパウンド	Sakura Tissue-Tek	4583
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	158127
フェロシアン化	ポタシウムSigma-Aldrich	P9387
フェリシアン化ポタシ	Sigma-Aldrich	702587
リン酸ナトリウム 一塩基性	Sigma-Aldrich	P9791
リン酸ナトリウム二塩基性	Sigma-Aldrich	S5136
ショ糖	Sigma-Aldrich	84097
タモキシフェン	Sigma-Aldrich	T5648-1G
超微細鉗子	デュモン	0103-5-PO
Vectashield	研究所	H1000
X-gal	シュ	10 651 745 001	使用前に50倍のストックを作成するためにジメチルフォラミドに溶解