ヒトの糖尿病臓器培養角膜におけるアデノウイルス遺伝子治療の例が、これらの角膜における創傷治癒の遅延と上皮幹細胞マーカー発現の顕著な減少の正常化に向けて提示されています。また、幹細胞が豊富な辺縁系上皮培養におけるこのプロセスの最適化についても説明します。
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方法論記事
糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹
この記事について
サマリー
要約
このプロトコルの目的は、ヒトの糖尿病角膜内の分子変化を説明し、それらが器官培養角膜にアデノウイルス遺伝子治療によって軽減することができる方法を示すことです。糖尿病性角膜疾患は、角膜神経と上皮創傷治癒の頻繁な異常を伴う糖尿病の合併症です。我々はまた、ヒトの糖尿病角膜内のいくつかの推定上皮幹細胞マーカーの有意な発現変化を報告しています。これらの変化を緩和するために、アデノウイルス遺伝子治療は、正常のc-Met癌原遺伝子発現のアップレギュレーションおよび/またはプロテイナーゼマトリックスメタロプロテイナーゼ10（MMP-10）およびカテプシンF.この治療のダウンレギュレーションを用いて実施されたが、糖尿病性角膜において創傷治癒を加速します唯一の輪部幹細胞区画を形質導入した場合であっても。最良の結果は、併用治療で得られました。正規化された幹細胞の可能性のある患者の移植のために、例もoptimizatiで提示されていますポリカチオン性増強剤を使用して幹細胞に富む培養物における遺伝子導入の上。このアプローチでは、選択された遺伝子についても、角膜上皮の創傷治癒の他のメディエーターのためだけでなく、有用であると細胞機能幹よいです。
概要
糖尿病性角膜疾患は、主に退行性上皮（角膜症）と神経（神経障害）の変化をもたらします。それは多くの場合、上皮創傷治癒および角膜神経削減1-4の異常によって明らかにされています。推定60から70パーセントの糖尿病患者は1,3、様々な角膜の問題を抱えています。我々の研究は、変化したのc-Metプロトオンコジーン（肝細胞増殖因子受容体）のダウンレギュレーションを含む、ヒトの糖尿病角膜における発現およびマトリックスメタロプロテイナーゼ10（MMP-10）およびカテプシンF 5,6の上方制御で複数のマーカータンパク質を同定しました。我々はまた、大幅に文書化されたヒトの糖尿病角膜にいくつかの推定上皮幹細胞マーカーの発現が低下しています。
以前の研究では、糖尿病、遅い創傷治癒を示し、ヒト糖尿病性角膜器官培養系を用いた糖尿病改変マーカーのレベルを正常化するために、アデノウイルスに基づく遺伝子治療を開発しましたマーカーの変更、およびex vivo角膜7,8と同様の細胞マーカー発現の減少を食い止めます。この変更の持続性は、エピジェネティックな代謝メモリ9の存在によるものと思われます。この培養系は、さらに、遺伝子治療のために使用しました。この治療のためのターゲットは、糖尿病性角膜における発現低下（ のc-Met癌原遺伝子）、または増加した発現（MMP-10....
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プロトコル
国立疾病研究インターチェンジ（NDRI、フィラデルフィア、PA）は承諾し、死後の健康と糖尿病の人の目と角膜を供給する。 NDRIのヒト組織収集プロトコルは、経営委員会と健康の監督の国立研究所の対象によって承認されています。本研究では、承認されたシーダーズ・サイナイ医療センター施設内倫理委員会（IRB）免除プロトコルEX-1055の下で行われています。 、博士を角膜外科医のコラボレーション。 E. MaguenとY.ラビノビッツは、幹細胞に富む角膜上皮の文化を単離するための廃棄強角膜縁を供給する。本研究では、承認されたIRBプロトコルPro00019393の下で行われています。
1.ヒト角膜器官培養
注：正常および糖尿病性角膜または全体の目はチルド角膜の記憶媒体に受信されている（ 例えば 、のOptisol GS）国家サプライヤーNDRIから死後48時間以内。
- 鉗子で貯蔵容器からの角膜を削除し、私はそれを二度洗いnは抗生物質 - 抗真菌（ABAM）の混合物。全体の目の場合には、湾曲したハサミで地球儀から角膜を切り出しました。少なくとも5ミリメートル結膜縁を残し、またABAMで角膜を洗います。
- 角膜の凹部に配置する混合物を準備します。これはABAM、1ミリグラム/（0.1N酢酸中10mg / mlのストック溶液から作られた）mlのウシ皮膚コラーゲン、1％寒天、およびインスリン - トランスフェリン - 亜セレンを含有する無血清の最小必須培地（MEM）か....
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結果
私たちは、角膜器官培養では、糖尿病のマーカーの発現の差（ 例えば 、基底膜タンパク質とインテグリンα3β1）および正常および糖尿病角膜の間の創傷治癒が保存されていることが以前に示されています。この培養系は、C-MET、MMP-10、およびカテプシンF.、糖尿病、改変されたマーカーのレベルを正常化することを目的とした遺伝子治療を行いました
全体角膜上皮がMMP-10またはカテプシンF（別々に、または組み合わせて）にAV-のcMet、またはAV-shRNAを形質導入した場合には、上皮創傷治癒がかなり短い時間で完了した（P <対応スチューデントt検定により0.03に比べて同じドナー16,17からAV-ベクター形質導入仲間角膜よりもAV-ベクトル）。 AV-のcMetが大幅に正常な角膜（Figuの治癒異ならなかった半分、によって治癒時間を減少しました）1再。 AV-shM10とAV-.......
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ディスカッション
角膜が原因遺伝子送達、ならびに有効性および副作用の評価は、簡単で、その表面の場所に遺伝子治療のための理想的な組織であると思われます。しかし、この強力なアプローチの臨床翻訳はまだによる角膜疾患や遺伝子治療のターゲット24の遺伝的原因に乏しい情報に遅いです。角膜の変化を含む糖尿病の合併症は、代謝メモリ9に変換され、自然の中で主にエピジェネティックな場合があります。この理由のため、糖尿病患者の組織および細胞は、ex vivoでその異常を維持し、器官及び組織培養で研究することができます。また、糖尿病は、遺伝子治療によって補正することができる遺伝子の発現レベルおよびパターンの特定の変化を引き起こします。我々はによって正規化するヒト角膜器官培養7,8を幹細胞区画の5,6,8を含む糖尿病性角膜上皮に変更されたいくつかのマーカーを同定し、使用しています遺伝子治療マーカー発現および糖尿病角膜に妥協上皮創傷治癒。
私たちは、その強力な導入遺伝子発現、その非統合の性質、およびアデノ随伴ウイルス
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開示事項
著者らは金銭的利益を宣言していない。
謝辞
NIH/NEI R01 EY13431 (AVL)、CTSI grant UL 1RR033176 (AVL)、およびRegenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Centerからの助成金
に感謝します。....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 最小必須媒体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11095-080 | |
| Optisol-GS | ボッシュ&Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM抗生物質-抗真菌剤混合物 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15240062 | |
| 子牛の皮膚のコラーゲン | シグマ・アルドリッチ | C9791 | |
| 寒天、組織培養グレード | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-ヘプタノール | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. コンパウンド | VWRインターナショナル | 25608-930 | |
| ディスパーゼII | ロシュ・アプライド・サイエンス | 4942078001 | |
| ケラチノサイト無血清培地(KSFM) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 17005042 | |
| EpiLife 培地とカルシウム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | MEPI500CA | |
| N2 培地サプリメント、100x | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 17502-048 | |
| B27 培地サプリメント、50x | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 17504-044 | |
| ヒトケラチノサイト増殖サプリメント、100x | サーモフィッシャーサイエンティフィ | ックS-001-5 | |
| トリプシン0.25%-EDTA0.02%フェノールレッド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | と25200056 | |
| トリプシン0.25%フェノールレッド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15050065 | |
| 大豆トリプシン阻害剤 | シグマ・アルドリッチ | T6414 | |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 26140079 | |
| インスリントランスフェリンセレナイトサプリメント(ITS) | Sigma-Aldrich | ケ | |
| NP63&アルファ; | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| 抗体 PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| 抗体 nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| インテグリン & アルファに対する抗体;3&ベータ;1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| ヒトIV型コラーゲン | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| アデノウイルス | Capital BioSciences | のカスタムメイド | |
| デノウイルスはカテプシンを発現します F shRNA | Capital BioSciences | カスタムメイド | |
| アデノウイルスはスクランブルshRNAを発現し、GFP | Capital BioSciences | のカスタムメイド | |
| アデノウイルスはc-met | OriGene(プラスミド) | SC323278 | |
| アデノウイルス発現GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| クエン酸シルデナフィル、 | 薬局 | ファイザー | |
| nbsp; | サーモフィッシャーサイエンティフィ | PHG0311 | |
| ポリ-L-リジン | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| ポリブレン | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | 同上、ドイツ | 50301 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10010049 | |
| コーニングラウンドエンドスパチュラ | ダウコーニング | 3005 | |
| 60 mmシャー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek IIマルチウェルチャンバースライド | シグマ・アルドリッチ | C6807 | |
| 200 &MU;lピペットチップ | BioexpressP-1233-200 | 他のサプライヤー利用可能な | |
| 倒立顕微鏡 | ニコン | Diaphot | 利用可能な他のサプライヤー/モデル利用可能な |
| 加湿CO<サブ>2インキュベーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 370 (Steri-Cycle) | その他のサプライヤー/モデル |
| 利用可能な蛍光顕微鏡 | オリンパス、日本 | BX-40 | 利用可能な他のサプライヤー/モデル |
| 解剖実体顕微鏡 | ライカ、ドイツ | S4 E | その他のサプライヤー/モデルが利用可能 |
参考文献
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2....
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