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方法論記事

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

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DOI:

10.3791/54058

⸱

2016年4月7日

 ,  , 
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

この記事について

サマリー

ヒトの糖尿病臓器培養角膜におけるアデノウイルス遺伝子治療の例が、これらの角膜における創傷治癒の遅延と上皮幹細胞マーカー発現の顕著な減少の正常化に向けて提示されています。また、幹細胞が豊富な辺縁系上皮培養におけるこのプロセスの最適化についても説明します。

要約

このプロトコルの目的は、ヒトの糖尿病角膜内の分子変化を説明し、それらが器官培養角膜にアデノウイルス遺伝子治療によって軽減することができる方法を示すことです。糖尿病性角膜疾患は、角膜神経と上皮創傷治癒の頻繁な異常を伴う糖尿病の合併症です。我々はまた、ヒトの糖尿病角膜内のいくつかの推定上皮幹細胞マーカーの有意な発現変化を報告しています。これらの変化を緩和するために、アデノウイルス遺伝子治療は、正常のc-Met癌原遺伝子発現のアップレギュレーションおよび/またはプロテイナーゼマトリックスメタロプロテイナーゼ10（MMP-10）およびカテプシンF.この治療のダウンレギュレーションを用いて実施されたが、糖尿病性角膜において創傷治癒を加速します唯一の輪部幹細胞区画を形質導入した場合であっても。最良の結果は、併用治療で得られました。正規化された幹細胞の可能性のある患者の移植のために、例もoptimizatiで提示されていますポリカチオン性増強剤を使用して幹細胞に富む培養物における遺伝子導入の上。このアプローチでは、選択された遺伝子についても、角膜上皮の創傷治癒の他のメディエーターのためだけでなく、有用であると細胞機能幹よいです。

概要

糖尿病性角膜疾患は、主に退行性上皮（角膜症）と神経（神経障害）の変化をもたらします。それは多くの場合、上皮創傷治癒および角膜神経削減1-4の異常によって明らかにされています。推定60から70パーセントの糖尿病患者は1,3、様々な角膜の問題を抱えています。我々の研究は、変化したのc-Metプロトオンコジーン（肝細胞増殖因子受容体）のダウンレギュレーションを含む、ヒトの糖尿病角膜における発現およびマトリックスメタロプロテイナーゼ10（MMP-10）およびカテプシンF 5,6の上方制御で複数のマーカータンパク質を同定しました。我々はまた、大幅に文書化されたヒトの糖尿病角膜にいくつかの推定上皮幹細胞マーカーの発現が低下しています。

以前の研究では、糖尿病、遅い創傷治癒を示し、ヒト糖尿病性角膜器官培養系を用いた糖尿病改変マーカーのレベルを正常化するために、アデノウイルスに基づく遺伝子治療を開発しましたマーカーの変更、およびex vivo角膜7,8と同様の細胞マーカー発現の減少を食い止めます。この変更の持続性は、エピジェネティックな代謝メモリ9の存在によるものと思われます。この培養系は、さらに、遺伝子治療のために使用しました。この治療のためのターゲットは、糖尿病性角膜における発現低下（ のc-Met癌原遺伝子）、または増加した発現（MMP-10およびカテプシンF）のいずれかでマーカーから選択されました。

アデノウイルス（AV）療法は、全器官培養角膜または唯一の強角膜周辺輪部の区画に使用しました。この区画は、角膜上皮を更新し、積極的に4,10-15創傷治癒に関与する上皮幹細胞を保有します。ここでは、プロトコルが正常及び糖尿病のヒト角膜臓器培養、上皮創傷治癒、幹細胞に富む輪部細胞培養物の単離および特徴付け、ならびにアデノウイルス、細胞および角膜形質導入するために提供されます。私たちの結果は、将来の移植のための糖尿病性角膜にマーカー発現および創傷治癒を正規化するため、この治療法の実現可能性を示しています。彼らはまた、併用療法は、糖尿病性角膜16-18通常マーカパターンと上皮の治癒を回復するための最も効果的な方法であることを示唆しています。

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プロトコル

国立疾病研究インターチェンジ（NDRI、フィラデルフィア、PA）は承諾し、死後の健康と糖尿病の人の目と角膜を供給する。 NDRIのヒト組織収集プロトコルは、経営委員会と健康の監督の国立研究所の対象によって承認されています。本研究では、承認されたシーダーズ・サイナイ医療センター施設内倫理委員会（IRB）免除プロトコルEX-1055の下で行われています。 、博士を角膜外科医のコラボレーション。 E. MaguenとY.ラビノビッツは、幹細胞に富む角膜上皮の文化を単離するための廃棄強角膜縁を供給する。本研究では、承認されたIRBプロトコルPro00019393の下で行われています。

1.ヒト角膜器官培養

注：正常および糖尿病性角膜または全体の目はチルド角膜の記憶媒体に受信されている（ 例えば 、のOptisol GS）国家サプライヤーNDRIから死後48時間以内。

  1. 鉗子で貯蔵容器からの角膜を削除し、私はそれを二度洗いnは抗生物質 - 抗真菌（ABAM）の混合物。全体の目の場合には、湾曲したハサミで地球儀から角膜を切り出しました。少なくとも5ミリメートル結膜縁を残し、またABAMで角膜を洗います。
  2. 角膜の凹部に配置する混合物を準備します。これはABAM、1ミリグラム/（0.1N酢酸中10mg / mlのストック溶液から作られた）mlのウシ皮膚コラーゲン、1％寒天、およびインスリン - トランスフェリン - 亜セレンを含有する無血清の最小必須培地（MEM）からなりますサプリメント7。
  3. マイクロ波殺菌および寒天溶解のために沸騰するまでこの混合物。すべてが溶解することは1分ほどかかる場合があります。それが沸騰したときに、混合物を簡単に溢れているため、部分的にオープンチューブキャップを残します。この理由のため、いくつかの沸騰サイクルは、10〜15秒毎に必要とされ得ます。 37-39℃に混合物を冷却。
  4. 滅菌60ミリメートル皿に角膜上皮側を下に置きます。 1.2に記載された混合物の約0.5ミリリットルと角膜の凹部を埋めます。ザ混合物を2分以内に角膜上で固化します。
  5. 気液界面培養のための輪部で約そのレベルを維持するために、滅菌60-mmディッシュにダウン角膜寒天側を置き、ABAMでMEMを含む完全培地を追加し、インスリン-トランスフェリン-セレンサプリメント7（37°C）。培地容積は、皿当たり7〜8ミリリットルです。
  6. 水パンと加湿5％CO 2インキュベーターに角膜と皿を置き、35℃（通常の角膜温度）で（この方法では、湿度レベルはで、または95％以上に維持されています）。角膜を湿らせるために上皮で毎日100μlの培地（2滴）を追加します。
  7. 4Xの目的とした標準的な顕微鏡を用いて、角膜の形態学および透過光下での顕微鏡で上皮細胞の生存率を監視します。一日一回行ってください。
  8. 3日ごとに培地を変更します。角膜は、少なくとも3週間培養することができます。 3-5日のための遺伝子治療実験のために、文化角膜、その後transduc金利（4.1から4.4）の遺伝子とeは、創傷治癒のプロトコル（2.1〜2.4）に導入遺伝子および対象に応じて別の3-5日に向けて出発します。

2.上皮創傷治癒

注意：脆弱な上皮基底膜は、通常の角膜では発生しないプロセスにデタッチされているため、糖尿病性角膜では、機械的スクレーピングによって上皮デブリードマンは現実的ではありません。従って、創傷治癒の同様の条件下で、正常および糖尿病角膜を維持するために、n型ヘプタノールで上皮の化学的除去は、19を使用します。この手順は、上皮を除去するが、両方の正常及び糖尿病性角膜中の無傷の基底膜が残ります。

  1. 中央上皮創面切除20を実行するために、75秒間の中央角膜前面のNヘプタノールに浸漬し、5mmの濾紙ディスクを置きます。
  2. フィルターを取り外して、完全培地中で角膜を洗います。寒天、コラーゲン0.5ミリリットルで凹部を埋めます1.4のような混合物と文化。デブリードマン後、上皮細胞は通常、死ぬ、顕微鏡無傷の基底膜7を残す剥がれ落ちます。
  3. 唯一の輪部遺伝子療法を用いた実験で、より大きな上皮の傷を作成するために、8.5ミリメートルのディスクを使用してください。これは、治癒過程における輪部幹細胞の関与を確保します。
  4. 微視的に角膜の治癒を監視します。上皮欠損が完全に治癒するまで毎日4X及び10Xで写真を作ります。治癒過程は、（正常または糖尿病）状態および創傷サイズに応じて2〜15日から取ることができます。
    注：治癒過程の間、黒クモ状細胞は上部焦点面で観察されます。これらの細胞は、上皮除去4後に死亡したアポトーシス間質角膜実質です。治癒がこれらの死んだ細胞が治癒上皮によって生い茂っていないと見えなくなる（ 図2、挿入図）である場合に完了したと判断されました。
  5. 治癒した後、完了、半分に角膜を切るには、クリオスタット切片上またはウェスタンブロット16,21のための間接的免疫蛍光のために10月の化合物およびプロセスでそれらを埋め込 ​​みます。

幹細胞に富む文化の輪部細胞およびメンテナンスの3分離

注：強角膜縁から、プライマリ輪部上皮幹細胞（LESC）に富んだ文化を準備します。リムは、健康なドナーから来ると角膜移植は、標準的な角膜記憶媒体（ 例えば 、のOptisol）におけるコラボレーション外科医から受信された後に廃棄されました。そうでなければ、LESC富化培養物は正常および糖尿病全体の角膜の切除縁から得ることができ、または角膜の記憶媒体にNDRIから受信地球儀。

  1. 全体の角膜や地球儀が使用されている場合は、最初の輪部領域を分離。これを行うには、上皮側を上にして滅菌プラスチックシャーレ上で角膜を配置し、9 mmのトレフィン（円形角膜ナイフ）で中央領域を削除します。この中央部分を破棄します。その後、13ミリメートルのトレパンを使用して、輪部ゾーンを切除し、外側結膜部分を破棄します。細胞を単離するには、ベーグルのような輪部のリムを使用しています。細胞の単離の前に、内皮細胞を除去し、滅菌綿棒で表面上皮に角膜反対の内側から虹彩の残党を接着します。
  2. ディスパーゼ処理を用いて輪部細胞シートを分離します。 II 1.5 mlの2.4 U / mlのディスパーゼで2時間22 37℃で10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したケラチノサイト無血清培地（KSFM）を各強角膜縁をインキュベートします。
  3. 穏やかに鉗子で解剖立体顕微鏡下リムオフ縁上皮細胞シートを容易にし、0.25％トリプシン1mlの細胞を解離する - 室温で30分間、0.02％EDTA溶液。
  4. 培地（ 例えば 、Epilife）10mlに細胞を洗浄し、室温で5分間、卓上遠心機で300×gで、それらをペレット化。
  5. 再懸濁番目培養培地中のE細胞：N2、B27及びヒトケラチノサイト成長補助剤を含む培地、および10ng / mLの上皮成長因子（EGF）。
  6. KSFM中、0.5μgの/ cm 2で、フィブロネクチン、IV型コラーゲン、及びラミニン（FCL）を含むヒト基底膜タンパク質の混合物でコーティングされたフラスコ中で3,000〜5,000細胞/ mlまたは60 mmディッシュで細胞を播種ミディアム。
  7. 培養は、37℃で加湿（95％以上の湿度）CO 2インキュベーター中の細胞は、彼らは完全にコンフルエントな単層を形成するまで。これは、1〜2週間かかる場合があります。
    注：定期的にPAX6、ケラチン（K）14、K15、K17、およびΔNp63αを含む推定上LESCのマーカーに陽性免疫細胞化学染色によって細胞の同一性を確認します。一次抗体を含む染色詳細は8,16-18,22が公開されています。
  8. 37℃で10分間（0.25％溶液の5希釈1）通路にコンフルエント細胞を、1mlの0.05％トリプシン溶液でそれらを扱います。 5ミリリットルの大豆TRを追加します。培地4、及び3.5のように細胞を遠心分離：ypsinインヒビター溶液（10mg / ml）を1に希釈しました。
  9. 希釈された大豆トリプシンインヒビター溶液3mlで細胞ペレットを洗浄します。 FCLコート上プレートの細胞は、2×10 4細胞/ mlで皿またはガラスチャンバースライド（3.7を参照します）。

器官培養角膜の4アデノウイルス形質導入

注：組換えアデノウイルス（AV）は、AV-ベクター（何の遺伝子が挿入されていない）から（c-met遺伝子のオープンリーディングフレームを含む）、AV-のcMet、（MMP-10へのshRNAを含む）AV-shM10、およびAV-shCFを含みます（ shRNAを）Fカテプシンします。彼らは主要前初期サイトメガロウイルスプロモーターの制御下の遺伝子を発現するE1 / E3欠タイプ5 AVです。 AV-のcMetウイルスはAVベクターパッド/ CMV / V5-DEST 16を使用して生成されます 。 AV-shRNAのウイルスは、カスタム複製不能（-E1 / -E3）フーマーにiLenti-EGFPベクターからHH1プロモーターとGFPタグ配列と一緒にshRNA配列のサブクローニングによって生成されますアデノ4発現系17を用いて、n個のAV 5型ゲノム。

  1. 遺伝子発現調節AVで、AV-ベクトルと別の角膜との各ペアの1つの器官培養角膜を伝達します。 24ウェル皿のウェル中で各媒体表面の下に角膜を保ち、37℃で48時間培養液中に角膜あたり0.8×10 8〜1.25プラーク形成単位（pfu）でAV-のcMetを使用してください。角膜あたり1〜2×10 8 PFUでAV-shRNAのウイルスを使用してください。
  2. 75 / mlのクエン酸シルデナフィルを補充した完全培地中で形質導入のためのウイルスを使用してください。この試薬 ​​は、上皮細胞21によるウイルスの取り込みを促進するカベオリン輸送を活性化させます。水溶液中でのシルデナフィルの短い半減期に、それ以降の媒体4-5時間に同じ量を再度追加します。標準治療は、48時間です。
  3. 角膜輪部で中レベルを維持するAVを含まない培地中でラウンド終了無菌スパチュラと文化と新しい皿に角膜を転送します。追加した後液体 - 空気界面におけるitional 4~8日、工程上皮創傷治癒のための様々な分析または試験するためのAV処置角膜（上記参照）。日常的に、角膜の上に100μlの培地（2滴）を添加して、培養中に角膜を湿ら。
  4. 唯一の輪部細胞の形質導入のために、中央の上皮の形質導入を回避するために、角膜輪部で中レベルでの気液界面での角膜でウイルスを培養します。

培養輪部細胞の5アデノウイルス形質導入

  1. / cm 2と0.5μgのでFCLの混合物でコーティングされたプラスチック皿に（3.5を参照）を10ng / mlのEGFを含む培地中でLESCに富んだ文化を維持します。
  2. AVは、感染の多重度の範囲で緑色蛍光タンパク質遺伝子（AV-GFP）またはAV-スクランブルのshRNA-GFPを保有して70から80パーセントの集密度に達した培養細胞（：1から300 PFU /細胞MOI）を伝達、2 ngの/ mlのEGFを含む培地インチtransductioを実行しますnは0.5ミリリットル培地中で20時間、続いて最小量（0.2ミリリットル）で3​​7℃で4時間。カベオリン輸送活性剤シルデナフィルは、細胞培養の形質導入のために必要とされません。
  3. （ポリカチオン（1 / mlのポリ-L-リジンまたは5μg/ mlのポリブレン）、または6μL/ mlの形質導入試薬のいずれか：AV導入効率を高めるために、細胞表面に結合するAVを容易に以下の試薬のいずれかを使用し例えば 、ViraDuctin）、または20μL/ mlの形質導入増強剤（ 例えば 、ibiBoost）。
  4. AVずにいずれかの培地を交換した後、加湿CO 2インキュベーター中で、4日間培養した細胞をインキュベートし、倒立蛍光顕微鏡を用いてGFPの発現レベルを評価します。
  5. AV-形質導入培養物中の細胞の移動を評価するためにスクラッチ創傷治癒アッセイを使用してください。マルチウェルチャンバースライドに細胞を増殖させます。 200μlのPIでまっすぐな直線運動で細胞を掻くことにより、単層で傷を作りますpetteチップ。負傷した後、剥離した細胞を除去するために、新鮮な1のための媒体を変更します。
  6. 4Xの倍率で倒立顕微鏡に取り付けたデジタルカメラで毎日傷を撮影。治癒が完了したときに時間を記録する（創傷の縁は、全体の傷に沿って接触します）。

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結果

私たちは、角膜器官培養では、糖尿病のマーカーの発現の差（ 例えば 、基底膜タンパク質とインテグリンα3β1）および正常および糖尿病角膜の間の創傷治癒が保存されていることが以前に示されています。この培養系は、C-MET、MMP-10、およびカテプシンF.、糖尿病、改変されたマーカーのレベルを正常化することを目的とした遺伝子治療を行いました

全体角膜上皮がMMP-10またはカテプシンF（別々に、または組み合わせて）にAV-のcMet、またはAV-shRNAを形質導入した場合には、上皮創傷治癒がかなり短い時間で完了した（P <対応スチューデントt検定により0.03に比べて同じドナー16,17からAV-ベクター形質導入仲間角膜よりもAV-ベクトル）。 AV-のcMetが大幅に正常な角膜（Figuの治癒異ならなかった半分、によって治癒時間を減少しました）1再。 AV-shM10とAV-...

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ディスカッション

角膜が原因遺伝子送達、ならびに有効性および副作用の評価は、簡単で、その表面の場所に遺伝子治療のための理想的な組織であると思われます。しかし、この強力なアプローチの臨床翻訳はまだによる角膜疾患や遺伝子治療のターゲット24の遺伝的原因に乏しい情報に遅いです。角膜の変化を含む糖尿病の合併症は、代謝メモリ9に変換され、自然の中で主にエピジェネティックな場合があります。この理由のため、糖尿病患者の組織および細胞は、ex vivoでその異常を維持し、器官及び組織培養で研究することができます。また、糖尿病は、遺伝子治療によって補正することができる遺伝子の発現レベルおよびパターンの特定の変化を引き起こします。我々はによって正規化するヒト角膜器官培養7,8を幹細胞区画の5,6,8を含む糖尿病性角膜上皮に変更されたいくつかのマーカーを同定し、使用しています遺伝子治療マーカー発現および糖尿病角膜に妥協上皮創傷治癒。

私たちは、その強力な導入遺伝子発現、その非統合の性質、およびアデノ随伴ウイルス

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開示事項

著者らは金銭的利益を宣言していない。

謝辞

NIH/NEI R01 EY13431 (AVL)、CTSI grant UL 1RR033176 (AVL)、およびRegenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Centerからの助成金

に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
最小必須媒体サーモフィッシャーサイエンティフィック11095-080
Optisol-GS ボッシュ&Lomb50006-OPT
ABAM抗生物質-抗真菌剤混合物サーモフィッシャーサイエンティフィック15240062
子牛の皮膚のコラーゲン シグマ・アルドリッチ C9791
寒天、組織培養グレードSigma-Aldrich A1296
n-ヘプタノールSigma-Aldrich 72954-5ML-F
O.C.T. コンパウンド VWRインターナショナル25608-930
ディスパーゼII ロシュ・アプライド・サイエンス4942078001
ケラチノサイト無血清培地(KSFM) サーモフィッシャーサイエンティフィ17005042
EpiLife 培地とカルシウムサーモフィッシャーサイエンティフィックMEPI500CA
N2 培地サプリメント、100xサーモフィッシャーサイエンティフィック17502-048
B27 培地サプリメント、50xサーモフィッシャーサイエンティフィ17504-044
ヒトケラチノサイト増殖サプリメント、100xサーモフィッシャーサイエンティフィックS-001-5
トリプシン0.25%-EDTA0.02%フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィックと25200056
トリプシン0.25%フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック15050065
大豆トリプシン阻害剤 シグマ・アルドリッチ T6414
ウシ胎児血清サーモフィッシャーサイエンティフィック26140079
インスリントランスフェリンセレナイトサプリメント(ITS)Sigma-Aldrich ケ
NP63&アルファ;Santa Cruz Biotechnologysc-8609
抗体 PAX6BioLegendPRB-278P-100
抗体 nidogen-1R&D SystemsMAB2570
インテグリン & アルファに対する抗体;3&ベータ;1EMD MilliporeMAB1992
human fibronectinBD Biosciences354008
human lamininSigma-Aldrich L4445
ヒトIV型コラーゲンSigma-Aldrich C6745-1ML
アデノウイルスCapital BioSciencesのカスタムメイド
デノウイルスはカテプシンを発現します F shRNACapital BioSciencesカスタムメイド
アデノウイルスはスクランブルshRNAを発現し、GFPCapital BioSciencesのカスタムメイド
アデノウイルスはc-metOriGene(プラスミド)SC323278
アデノウイルス発現GFPKeraFASTFVQ002
クエン酸シルデナフィル、薬局ファイザー
nbsp;サーモフィッシャーサイエンティフィPHG0311
ポリ-L-リジンSigma-Aldrich P4707
ポリブレンSigma-Aldrich 107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoost同上、ドイツ50301
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック10010049
コーニングラウンドエンドスパチュラ ダウコーニング3005
60 mmシャーサーモフィッシャーサイエンティフィック174888
Nunc Lab-Tek IIマルチウェルチャンバースライド シグマ・アルドリッチC6807
200 &MU;lピペットチップBioexpressP-1233-200他のサプライヤー利用可能な
倒立顕微鏡 ニコンDiaphot利用可能な他のサプライヤー/モデル利用可能な
加湿CO<サブ>2インキュベーター サーモフィッシャーサイエンティフィック370 (Steri-Cycle)その他のサプライヤー/モデル
利用可能な蛍光顕微鏡オリンパス、日本BX-40利用可能な他のサプライヤー/モデル
解剖実体顕微鏡ライカ、ドイツS4 Eその他のサプライヤー/モデルが利用可能
ック ック ラチン14サンタクルーズバイオテクノロジーsc-53253ケラチン15サンタクルーズバイオテクノロジーsc-47697抗体に対するケラチン17サンタクルーズバイオテクノロジーSC-58726抗体に対するI3146-5ML抗体&デルタ;MMP-10 shRNAを発現するアのを発現します上皮成長因子からの 25 mg &ックレ

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