マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

Summary

この研究は、理論的には200以上の酵素に適用できる普遍的な遺伝的酵素スクリーニングシステムを使用したハイスループットスクリーニングの方法を提示しています。ここでは、シングルスクリーニングシステムで、使用する基質(p-ニトロフェニルアセテート、p-ニトロフェニル-β-D-セロビオシド、およびフェニルリン酸)を変更するだけで、3つの異なる酵素(リパーゼ、セルラーゼ、アルカリホスファターゼ)を同定します。

Abstract

近年のハイスループットシングルセルアッセイ技術の開発により、大規模なメタゲノム^{ライブラリー1}の機能活性に基づく新規酵素のスクリーニングが可能になりました。私たちは以前、フェノールまたはp-ニトロフェノールによって活性化されるジメチルフェノール調節因子を使用する遺伝酵素スクリーニングシステム(GESS)を提案しました。フェノール由来基質からこれらのフェノール化合物は膨大な量の天然酵素反応によって生成されるため、この単一の遺伝子スクリーニングシステムは、理論的にはBRENDAデータベース内の200種類以上の酵素のスクリーニングに適用することができます。GESSの一般的な適用性にもかかわらず、スクリーニングプロセスを適用するには、最大フローサイトメトリーシグナルに到達するための特定の手順が必要です。ここでは、GESSによるメタゲノム前処理やフローサイトメトリーソーターの操作など、開発されたスクリーニングプロセスについて詳しく説明します。GESSを含む3つの異なるフェノール基質(p-ニトロフェニルアセテート、p-ニトロフェニル-β-D-セロビオシド、およびフェニルリン酸)を使用して、それぞれ3つの異なる酵素(リパーゼ、セルラーゼ、およびアルカリホスファターゼ)をスクリーニングし、同定しました。選択されたメタゲノム酵素活性はフローサイトメトリーのみで確認されましたが、DNAシーケンシングや多様なin vitro解析により、さらなる遺伝子同定に活用することができます。

Introduction

最近開発されたハイスループット単一細胞アッセイ技術は、新規酵素がそれらの機能的活動¹に基づいて大規模な遺伝的ライブラリーからスクリーニングすることができます。単一細胞レベルで、転写を調節するタンパク質は、標的酵素活性の結果として産生される小分子を検出することによりレポーター遺伝子の発現を誘発するために使用されます。 1つの初期のアプローチは、基板がレポータータンパク質²の発現を誘導する（SIGEX）メソッドを、スクリーニング基板に誘導される遺伝子発現を使用して、 ラルストニアユートロファ E2からフェノール分解オペロンの単離を含んでいました。 シュードモナス・プチダのNhaRはベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ^3を選択するために使用し、 コリネバクテリウム・グルタミカムからLysGは、多様な変異体のライブラリー⁴から新たなL-リジン生産株のハイスループットスクリーニングに使用しました。

以前は、遺伝的酵素screeningのシステム（GESS）は、一般的に適用可能なスクリーニングプラットフォーム⁵として提案されました。このシステムはP.の、フェノール認識ジメチルレギュレータ、DMPRを使用していますプチダ 。 DMPR（E135K）、及びDMPRの変異体は、また、p個のニトロフェノール（PNP）を検出するためのGESS（PNP-GESS）で使用することができます。フェノール化合物を製造する標的酵素の存在下で、 大腸菌においてGESS 大腸菌細胞は、蛍光活性化セルソーター（FACS）を使用して、単一の細胞の迅速な単離を可能にする、蛍光シグナルを発します。しかし、メタゲノム酵素の発現は、従来の組換え酵素のそれよりも弱いように見えます。従って、GESS最適な運転条件⁵と一緒にリボソーム結合部位（RBS）とターミネーター配列との組み合わせを調査することによって最大感度を有するフェノール化合物を検出するように設計しました。

GESSの基本的な利点の一つは、この単一のメソッドは、理論的にはOVのスクリーニングを可能にすることですBRENDAデータベース内の酵素のERより200異なる種類（ 表1は、http：// www.brenda-enzymes.info、2013.7）単に異なる基板を採用することにより。これは、セルラーゼ、リパーゼ、及びメチルパラチオンヒドロラーゼ（MPH）は、それぞれのp -nitrophenyl酪酸、p個の -nitrophenyl-cellotrioside、およびメチルパラチオン^、5の適切な基質でPNP-GESSを用いて検出することができることが示されました。最近では、PNP-GESSを使用して同定された新規酵素の一つであるアルカリホスファターゼ（AP）は、低温適応海洋metagenomes ⁶で最初に検出された熱不安定性のAPであることが判明しました。

ここでは、スクリーニングプロセスの詳細は、PNP-GESSはメタゲノムライブラリ^5,6から新規候補酵素を同定する迅速enzymes-リパーゼ、セルラーゼ、およびアルカリホスファターゼの3種類の活動を検出-andが提示されます。プロセスは、PNP-GESSとオペレーティングFLとメタゲノムの前処理を含みますOWサイトメトリー選別機。得られたヒットはさらに識別のために配列決定する必要がありますが、このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いて酵素活性確認の手順までの手順をカバーしています。

Protocol

1. PNP-GESSとメタゲノムライブラリの準備

1. 大腸菌におけるメタゲノムライブラリーを構築大腸菌は、フォスミドベクターを製造者のプロトコール⁵に従ってフォスミドライブラリー産生キットを使用します。
2. アリコートメタゲノムライブラリー細胞の供給源である-70℃、での保存のためのライブラリ100μlの。
   注：このライブラリーストックの600ナノメートルの波長で測定した試料の光学密度（OD _600）は約100です。
3. 氷の上で株式メタゲノムライブラリーの100μLを解凍し、50ミリリットルルリア - ベルターニ（LB）と2時間37℃でインキュベートした12.5 / mlのクロラムフェニコールを含む500mlフラスコに接種します。
4. 4℃で20分間、1000×gでの遠心分離によって50mlコニカルチューブ中の細胞を採取。
5. 再び4℃で20分間、1000×gで50ミリリットルの氷冷蒸留水（DW）と遠心機で迅速にペレットを再懸濁。
6. RES10％（v / v）のグリセロールを50μlの氷冷DWでペレットuspend。エレクトロポレーションのためにこの細胞アリコート50μlのを使用してください。
7. エレクトロコンピテント細胞を50μl、氷冷エレクトロポレーションキュベットおよびエレクトロポレーションで^{pGESS（E135K）5} DNA（100ngの）（1.8キロボルト/ cmで、25μF）の混合物の混合物を置きます。
8. 迅速に異化代謝産物抑制（SOC）媒体とスーパー最適な培養液1ミリリットルを追加し、穏やかに細胞を再懸濁。
9. ピペットを用いて14 mLの丸底チューブに細胞を移し、37℃で1時間インキュベートします。
10. 12.5 / mlのクロラムフェニコールおよび50μg/ mlのアンピシリンを含むLB 20×20平方cmプレートに回収した細胞を500μlを広げます。 12時間、30℃でプレートをインキュベートします。
11. 細胞スクレーパーを用いてコロニーを掻き取り、氷冷細胞記憶媒体を用いて50mlコニカルチューブに細胞を回収。
12. 4°Cで20分間1,000×gで遠心分離します。 10 mlの氷冷細胞記憶媒体にペレットを再懸濁OD 100の_600に到達します。
13. 小分けし、-70℃での保存のための細胞の20μlの。

2.メタゲノムライブラリから偽陽性を削除します

1. 氷上でメタゲノムDNAのフォスミドとpGESS（E135K）を含有する（ステップ1.13から）株式メタゲノムライブラリ細胞を解凍します。
2. 14-mlの丸底チューブに50μg/ mlのアンピシリンおよび12.5 / mlのクロラムフェニコールを含む2ミリリットルのLB中の細胞を10μlを接種します。 4時間、200rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。
3. 一方、FACSのマシンをオンにし、デフォルトFACSソフトウェアを開きます。次の設定を使用：ノズル先端径、70ミクロン;前方散乱面積（FSC-A）感度、300 V-対数増幅;側方散乱エリア（SSC-A）感度、350 V-対数増幅;フルオレセインイソチオシアネートエリア（FITC-A）感度、450 V-対数増幅;閾値パラメータ、FSC-値5。
   注意：一般的な設定が与えられています材料の表に記載されたFACSデバイス用。他のFACSデバイスの設定を調整します。
4. 1mlのPBSを含む5 mlの丸底チューブに5μlのサンプルを追加することにより、ステップ2.2からメタゲノムライブラリー細胞を希釈します。
5. FACS装置のロードポートに希釈したライブラリのサンプルを配置し、FACSソフトウェアの取得、ダッシュボード上のLoadボタンをクリックしてください。
6. ダッシュボード上のフローレートボタンをクリックして制御することにより、150​​0イベント/秒 - 1,000事象率を調整します。
7. ログを作成FSC-A 対ツールバーのドットプロット]ボタンをクリックすることで、グローバルワークシート上のスケールSSC-散布図をログスケール。ツールバーのポリゴンゲートボタンを使用して、一重のイベント（細菌集​​団）を包含するように散布ゲートR1を調整します。
8. ログは、ヒストグラムボタンをクリックすることで、ワークシート上のFITC-Aをスケールされた対細胞数とのヒストグラムをプロットします。そして、CytomeからFITC電圧を調整釣鐘型の分布のピークは、FITC-Aの10未満²であるように、インスペクタのコントロールウィンドウのターの設定]タブ。
9. 対対数スケールFSC-Aを作成します。ログFITC-グローバルワークシート上のドットプロット]ボタンをクリックしてプロット。ゲートがbell-のピーク付近分布の中心（合計10％の細胞から+ 5％-5％の細胞との間に位置するように、ツールバー上のポリゴンゲートボタンを使用して、プロットに振り分けゲートR2を設定字曲線）。
10. 1.2ミリリットルLBはFACS装置の出口で50μg/ mlのアンピシリンおよび12.5 / mlのクロラムフェニコールを含有し、R1とR2ゲートの両方を満たすソートアウト10 ⁶個^の細胞を含むコレクションチューブを置きます。
11. コレクションチューブを外し、キャップ、そして穏やかにボルテックス。

3.メタゲノム酵素スクリーニング

1. OD _600が 0.5に達するまで、200 rpmで振盪しながら37℃で（ステップ2.11）から選別された細胞をインキュベートします。
2. 1μlを添加し、細胞内フォスミドコピー数を増幅するために誘導ソリューションをコピーします。 250 rpmで振盪しながら37℃でさらに3時間、細胞をインキュベートします。
3. 最終濃度で14-mlの丸底チューブに0.5培養細胞mlの適切な基質（Pの -nitrophenylアセテート、p個の -nitrophenyl-β-D-セロビオシド、またはフェニルホスフェート）を追加し、選別するための細胞を調製します100μMの。
   1. 対照サンプルについては、14-mlの丸底チューブにステップ3.2からの培養細胞の0.5ミリリットルを追加します。ステップ3.3の基板ボリュームと同じ容量のPBSを追加します。
4. 37℃での2つのサンプルが3時間200rpmで振盪しながらインキュベートします。
5. 一方、ステップ2.3と同様の構成でFACSマシンを準備。
6. それぞれ、1mlのPBSを含む2 5ミリリットル丸底チューブに（ソート用）細胞および対照細胞の5μlを添加します。
7. トンにコントロール細胞を含むチューブを置きます彼は、FACSのポートをロードし、FACSソフトウェアの取得、ダッシュボード上のLoadボタンをクリックしてください。ダッシュボード上のフローレートボタンを制御することにより、3000イベント/秒 - 千にイベントレートを調整します。
8. ログを作成FSC-A 対ソフトウェアの世界的なワークシート上のドットプロット]ボタンをクリックして拡大縮小SSC-散布図を記録し、上ポリゴンゲートボタンを使用して、一重のイベント（細菌集団）を包含するように散布ゲートR1を調整スケーリングツール・バー。
9. ログを作成FSC-A 対ワークシート上のドットプロット]ボタンをクリックして拡大縮小FITC-散布図を記録し、0.1％未満のように、ツール・バー上のポリゴンゲートボタンを使用して、プロットに振り分けゲートR2を設定するスケーリング陰性細胞は、R2のゲート内で検出されています。
10. ソート試料管と対照サンプルチューブを交換し、1000にイベントレートを調整 - ダッシュボード上のフローレートボタンを制御することにより、3000イベント/秒。
11. 0.5を含むコレクションチューブを置きますmlのFACS装置の出口でのLBと整理10 ⁴細胞を、R1とR2のゲートの両方を満たします。
    注：ソート基準トップ0.1％R2ゲートにおけるFITC-Aの5％の範囲とすることができます。このプロトコルでは、トップ1％の細胞が陽性として回収しました。
12. コレクションチューブを外し、キャップ、そして穏やかにボルテックス。
13. LB、50μg/ mlのアンピシリン、12.5 / mlのクロラムフェニコールを含む2寒天プレート（90ミリメートルペトリ皿）上のサンプルを収集した0.5ミリリットルを広げ、37℃で一晩静置します。
14. 必要に応じて、手順3.1から3.14を繰り返すことにより、FITC-濃縮のためにソートの追加のラウンドを行います。

4.ヒット選択と酵素活性の確認

1. フローサイトメトリー分析
   1. ステップ3.14でインキュベートプレートから、LED照明の波長488nmの観察下コロニーピッカーを使用しては蛍光を示さないコロニーを選択します。
   2. 14-mlのROで選択されたコロニーを接種します50μg/ mlのアンピシリンおよびそのOD _600が 0.5に達するまで、200 rpmで振盪しながら37℃で12.5 / mlのクロラムフェニコールを含む2ミリリットルのLBを含むウント底チューブ。
   3. 2μlを添加し、細胞内フォスミドコピー数を増幅するために誘導ソリューションをコピーします。 250 rpmで振盪しながら37℃でさらに3時間、細胞をインキュベートします。
   4. 14ミリリットル丸底チューブを準備し、培養細胞（ステップ4.1.3）の1ミリリットルを追加します。 100μMの最終濃度で適切な基質（p個の -nitrophenylアセテート、P -nitrophenyl-β-D-セロビオシド、またはフェニルホスフェート）を追加します。
      1. 制御のために、14ミリリットル丸底チューブにステップ4.1.3から1ミリリットルを培養した細胞を追加し、ステップ4.1.4の基板ボリュームと同じ容量のPBSを追加します。
   5. 37℃での2つのサンプルが3時間200rpmで振盪しながらインキュベートします。
   6. 一方、ステップ2.3と同様の構成でFACSマシンを準備。
   7. それぞれ、1mlのPBSを含む5ミリリットル丸底チューブに制御し、基板処理した細胞の5μlを添加します。
   8. FACS装置のロードポート上のコントロール細胞を含むチューブを置き、FACSソフトウェアの取得、ダッシュボード上のLoadボタンをクリックしてください。ダッシュボード上のフローレートボタンを使用して3000イベント/秒 - 1,000事象率を調整します。
   9. FITC-Aを測定するために取得]ボタンをクリックします。
   10. 基板処理された試料管を対照サンプルチューブを交換してください。ダッシュボード上のフローレートボタンを使用して3000イベント/秒 - 1,000事象率を調整します。
   11. FITC-Aを測定するために取得]ボタンをクリックします。
   12. FITC-Aをスケーリングログ対細胞数のヒストグラムをプロットすることによって、細胞の二つのグループの蛍光を比較します。
2. 他のアッセイは、酵素活性を確認するため
   1. 選択された酵素候補のさらなる同定のために、標準的な抽出のプロを使用してフォスミドDNAを抽出市販の抽出キットからcedures塩基配列を分析し、またはin vitroでの酵素活性^6,7をテスト^します。

Results

3フェノール基板が提案されたプロトコルに従うことにより、泰安、韓国の海洋干潟堆積物のメタゲノムライブラリーからの新規メタゲノム酵素を同定するために検討しました。ライブラリーの構築のために、平均30〜40キロバイトのメタゲノム配列は、Eに基づいているフォスミド、中に挿入しました大腸菌 F因子レプリコンおよびセル内の単一のコピーとして提示しました。フォスミドが広く、その安定した伝播⁸に起因する複雑なゲノムライブラリーを構築するために使用されていることに注意してください。

図1は、R1とR2ソートゲート（ 図1 B）と正のヒットの選択が続く負のソートと偽陽性の除去（ 図1 A）を含むスクリーニングプロトコルの簡単なフローチャートを示しています。ヒットとし、基板なしのサンプルの蛍光を比較することによ...

Discussion

生体触媒の生産効率を大きくすると、最高の自然な酵素源の一つと考えられている業界⁹とメタゲノムベースのバイオ化学の成功の鍵です。この意味で、それは、遺伝資源の大部分が^10を検討されていないメタゲノムから新規酵素をスクリーニングするために不可欠です。いくつかのスクリーニング方法は、直接転写活性化因子^11,12を用い^た酵素生成物を検出する開発されてきたが、これらの技術は、特定の代謝産物応答性転写システムを必要とします。一方、GESSは、フェノールまたはPNPは、基板をタグ付けの用途に応じて広く適用可能です。 BRENDAデータベースに（この作品で3例を含む）（ 表1）、フェノールまたはPNP化合物を製造する報告する酵素のほとんどが加水分解酵素に属するが（EC番号3）クラスの酵素は、より多様なフェノール基板を模索し、さらには人工的に設計します基板に施します酵素活性を標的とする、天然基質の代替として、大幅なスクリーニングシステムの適用可能性を拡張することができます。膜透過性および基板の細胞効果はかなりスクリーニングプロトコルに...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmidライブラリ制作キット
CopyControl インダクションソリューション	エピセンター	CCIS125	フォスミド コピーインダクションソリューション
EPI300	エピセンター	EC300110	エレクトロコンピテントセル
pCC1FOS	エピセンター	CCFOS110	フォスミドベクター
遺伝子パルサー Mxcell	バイオ・ラッド		エレクトロポレーションキュベットおよびエレクトロポレートシステム
FACSAria III	ベクトン・ディキンソン		フローサイトメトリー(FACS装置)
AZ100M	ニコン		顕微鏡
ウルトラスリム	マエストロゲン		LEDイルミネ
ーター50ml円錐管	BDファルコン
14ml丸底管	BDファルコン
5ml丸底チューブ	BDファルコン
p-ニトロフェニルリン酸	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
p-ニトロフェニル&β;-D-セロバイオシド	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p-ニトロフェニル酪酸	Sigma-Aldrich	N9876	基板
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	トリプトン 10 g/L、酵母抽出物 5 g/L、塩化ナトリウム 10 g/L
スーパーオプティマルブロス (SOB)	BD Difco	244310	トリプトン 20 g/L、酵母抽出物 5 g/L、塩化ナトリウム 0.5 g/L、硫酸マグネシウム 2.4 g/L、塩化カリウム 186 mg/L
異化抑制 (SOC)		、 0.4 % グルコース
2x 酵母エキス トリプトン (2xYT)	BD Difco	244020	カゼインの膵臓消化物 16 g/L、酵母エキス 10 g/L、酵母エキス 5 g/L
細胞記憶培地			2x YT ブロス、15% グリセロール、2% グルコース
pGESS(E135K)			dmpR、egfp 遺伝子、それらの適切なプロモーター、RBS、およびターミネーターを含む DNA ベクター. 原稿の参考文献 5 を参照してください。詳細。
クロラムフェニコール		Σ C0378
アンピシリン	Σ	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		フローサイトメトリー ソフトウェア バージョン 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4